Reguladores positivos permitem que uma célula avance através de pontos de controlo do ciclo celular. Os reguladores negativos têm um papel igualmente importante, pois terminam a progressão de uma célula através do ciclo celular—ou a pausam—até que a célula atenda a critérios específicos.

Três dos reguladores negativos mais bem compreendidos são p53, p21 e proteína do retinoblastoma (Rb). Os papéis regulatórios de cada uma dessas proteínas foram descobertos após cópias defeituosas terem sido encontradas em células com replicação descontrolada (ou seja, cancro). Essas proteínas exercem a maior parte dos seus efeitos regulatórios no ponto de controlo G₁ no início do ciclo celular.

A p53 influencia fortemente o compromisso de uma célula se dividir. Ela responde a danos no DNA descontinuando o ciclo celular e invocando enzimas para reparar o dano. Se o dano no DNA for irreparável, a p53 pode impedir que a célula prossiga pelo ciclo celular induzindo apoptose, ou morte celular.

Um aumento de p53 desencadeia a produção de p21. A p21 impede que a célula transite de G₁ para a fase S do ciclo celular, ligando-se aos complexos CDK/ciclina, inibindo as suas ações regulatórias positivas.

A Rb regula negativamente o ciclo celular agindo sobre diferentes reguladores positivos, principalmente em resposta ao tamanho da célula. A Rb ativa (desfosforilada) liga-se a fatores de transcrição, impedindo-os de iniciar a transcrição genética e, portanto, a produção de proteínas.

Quando a Rb está ligada ao fator de transcrição E2F, inibe a síntese de proteínas necessárias para a transição de G₁ para a fase S. À medida que a célula se torna maior, a Rb é gradualmente fosforilada até ser inativada e se soltar do E2F. O E2F pode então ativar genes que produzem as proteínas necessárias para prosseguir para a fase seguinte do ciclo celular.