Small Volume (1-3L) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

Zusammenfassung

Das Video dokumentiert kleines Volumen (~ 1 L) Filtration von mikrobieller Biomasse aus der Wassersäule.

Zusammenfassung

Der Workflow beginnt mit der Sammlung von der Küste Meeresgewässer für nachgeschaltete mikrobielle Gemeinschaft, Nährstoff-und Spurengasen analysiert. Für heute s Demonstration Proben wurden vom Deck der HMS John Strickland, die in Saanich Inlet gesammelt. Das Video dokumentiert kleines Volumen (~ 1 L) Filtration von mikrobieller Biomasse aus der Wassersäule. Das Protokoll ist eine Erweiterung des großen Volumens Probenahmeprotokoll oben beschrieben, mit einem wichtigen Unterschied: hier gibt es keine Pre-Filtration, so dass alle Größenklassen von Biomasse bis zum 0,22 um Filter-Cutoff gesammelt werden. Proben, die auf diese Weise sind ideal für Nukleinsäure-Analyse. Das Set-up-, Filtrations-und clean-up Schritte jeweils ca. 20-30 Minuten in Anspruch nehmen. Bei Verwendung von zwei Schlauchpumpen gleichzeitig bis zu 8 Proben gleichzeitig gefiltert werden. Um zu verhindern, Biofilmbildung zwischen Probenahme Reisen müssen alle Filteranlagen mit verdünnter HCl und VE-Wasser gespült werden und autoklaviert sofort nach Gebrauch.

Protokoll

1. Set up des Filtrationsapparatur
   1. Vor dem Filtrieren, zuerst abwischen Kondensation aus der vollen Flaschen und wägen
   2. Ein Autoklav bin auf der einen Seite der Pumpe, und die Abfälle Kolben auf der anderen.
   3. Dann legen Sie eine volle Probenflasche in den Autoklaven bin, aber nicht entfernen Sie die Kappe der Flasche noch.
   4. Pass den Schlauch durch die Schlauchpumpe, so dass die Luer-Ende des Schlauchs wird in den Kolben.
   5. Mit einer Pinzette entfernen Sie die Baumwolle aus einem sterilen 25 ml Pipette, und befestigen Sie die Pipette an das andere Ende des Schlauchs.
2. Filtration von Meerwasser
   1. Um die Filterung Meerwasser, öffnen Sie die Flasche und legen Sie die Pipette. Schalten Sie die Pumpe und stellen Sie die Fließgeschwindigkeit auf 1. Sehen Sie, um sicherzustellen, dass das Wasser wird in die richtige Richtung gepumpt.
   2. Lassen Sie ~ 100 ml Wasser, um durch den gesamten Schlauch passieren.
   3. Schalten Sie die Pumpe und befestigen Sie eine Sterivex Filter auf den männlichen Luer-Anschluss an das freie Ende des Schlauchs.
   4. Weiter Filterung, bis kein Wasser in den Flaschen übrig bleibt.
3. Lagerung von Filtern
   1. So speichern Sie die Filter, zuerst zu vertreiben restliche Wasser mit einem 30-60 ml Spritze.
   2. Seal der Unterseite des Sterivex Filter mit Parafilm. Mit einer Pipette 1,8 ml Lysepuffer, um den Filter, halten ~ 200 ul des Raumes in den Filter für die spätere Zugabe von Reagenzien.
   3. Dann Siegel der Spitze der Sterivex Filter mit einem kleinen Stück Parafilm, und beschriften Sie die Filter mit dem Datum und Identifizierung der Proben.
   4. Bewahren Sie die Filter in pre-markierten 50 ml Falcon-Röhrchen bei -80 ° C
4. Aufräumen
   1. Legen Sie die 25 ml Pipette in einen Kolben mit 0,1% HCl, und schalten Sie die Pumpe.
   2. Nach dem HCl waschen, spülen Sie den Schlauch mit Wasser autoklaviert.
      
      Schließlich messen und notieren Sie die Masse der jetzt leer 1L, um das Volumen des Wassers durch den Filter geleitet zu berechnen.

Repräsentative Ergebnisse: Stück 1 L Wasserprobe resultiert in einem Sterivix Filter, der Biomasse größer als 0,22 um enthält. Dies ist in Lysepuffer für spätere DNA-Extraktion und Analyse gespeichert. Das Endergebnis besteht aus einem Sterivix Filter pro 1-Liter-Flasche in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Der Filter enthält Biomasse größer als 0,22 um. Filter können bei -80 ° C vor der EDNA-Extraktion gelagert werden.

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Diskussion

Es ist zwingend notwendig, um abwischen Bänke und Pumpen mit einem feuchten Tuch nach dem Gebrauch an alle verbliebenen Spuren von Salzwasser, die sonst korrodieren würden Geräte zu entfernen. Obwohl das Verfahren ist einfach, kann der Zeitbedarf werden umfangreiche abhängig von der Konzentration der Biomasse oder Verunreinigungen in der Probe herausgefiltert.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse