Volume piccoli (1-3L) Filtrazione di campioni d'acqua di mare costiero

Riepilogo

Questo volume video di documenti di piccole dimensioni (~ 1 L) filtrazione di biomassa microbica dalla colonna d'acqua.

Abstract

Il flusso di lavoro inizia con la raccolta delle acque marine costiere per la comunità microbica a valle, le analisi dei nutrienti e dei gas traccia. Per i campioni manifestazione di oggi s sono stati raccolti dal ponte della HMS operativo John Strickland a Inlet Saanich. Questo volume video di documenti di piccole dimensioni (~ 1 L) filtrazione di biomassa microbica dalla colonna d'acqua. Il protocollo è un'estensione del protocollo di campionamento grandi volumi descritto in precedenza, con una fondamentale differenza: qui non c'è pre-filtrazione passo, per cui tutte le classi dimensionali delle biomasse sono raccolti fino al 0,22 micron di taglio del filtro. I campioni raccolti in questo modo sono l'ideale per l'analisi degli acidi nucleici. Il set-up, la filtrazione e la pulizia passi ogni impiegano circa 20-30 minuti. Se si utilizzano due pompe peristaltiche contemporaneamente, fino a 8 campioni possono essere filtrati allo stesso tempo. Per prevenire la formazione di biofilm tra i viaggi di campionamento, tutte le apparecchiature di filtrazione devono essere lavate con acido cloridrico diluito e acqua deionizzata e sterilizzati in autoclave immediatamente dopo l'uso.

Protocollo

1. Messa a punto di apparecchiature di filtrazione
   1. Prima di filtrare, in primo luogo asciugherà eventuale condensa dal bottiglie piene e pesarli
   2. Inserire un bin autoclave su un lato della pompa, e il pallone dei rifiuti dall'altro.
   3. Poi posto una bottiglia piena campione nel cestino autoclave, tuttavia, non rimuovere il tappo della bottiglia ancora.
   4. Passare attraverso il tubo della pompa peristaltica modo che l'estremità luer del tubo è nel pallone.
   5. Utilizzando una pinzetta, togliere il cotone da una pipetta sterile 25 ml, e allegare la pipetta per l'altra estremità del tubo.
2. Filtrazione di acqua di mare
   1. Per iniziare il filtraggio dell'acqua di mare, aprire la bottiglia e inserire la pipetta. Accendere la pompa e impostare la velocità di flusso a 1. Guarda per assicurare che l'acqua viene pompata nella direzione corretta.
   2. Lasciare ~ 100 ml di acqua di passare attraverso il tubo intero.
   3. Spegnere la pompa e porre un filtro Sterivex al raccordo maschio luer alla estremità libera del tubo.
   4. Continuare a filtrare l'acqua fino a quando non viene lasciato in bottiglia.
3. Conservazione dei filtri
   1. Per memorizzare i filtri, prima espellere l'acqua residua con una siringa da 30-60 ml.
   2. Sigillare il fondo del filtro Sterivex con Parafilm. Usando una pipetta, aggiungere buffer di lisi 1.8ml al filtro, mantenendo ~ 200 ul di spazio nel filtro per la successiva aggiunta di reagenti.
   3. Poi, sigillare la parte superiore del filtro Sterivex con un piccolo pezzo di Parafilm, i filtri e l'etichetta con la data e l'identificazione del campione.
   4. Conservare i filtri pre-etichettati 50 ml tubi falco a -80 ° C
4. Ripulire
   1. Inserire la pipetta 25 ml in un pallone contenente 0,1% di HCl, e accendere la pompa.
   2. Dopo il lavaggio HCl, sciacquare il tubo con l'acqua in autoclave.
      
      Infine, misurare e registrare la massa delle bottiglie ormai vuote 1L al fine di calcolare il volume di acqua passata attraverso il filtro.

Risultati Rappresentante: Unità 1 campione di acqua L produce uno Sterivix filtro, che contiene biomassa superiore a 0,22 micron. Questo è memorizzato in tampone di lisi per l'estrazione del DNA e analisi successive. Il risultato finale è costituito da un filtro Sterivix per ogni bottiglia da 1 litro memorizzate nel buffer di lisi e pronto per l'estrazione del DNA. Il filtro contiene biomassa superiore a 0,22 micron. I filtri possono essere conservati a -80 ° C prima dell'estrazione Edna.

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Discussione

E 'indispensabile per pulire panche e pompe con un panno umido dopo l'uso per rimuovere ogni traccia persistente di acqua salata che altrimenti corrodere attrezzature. Anche se la procedura è semplice, il requisito di tempo può essere esteso a seconda della concentrazione di biomassa o detriti nel campione essere filtrato.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse