Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

Zusammenfassung

In diesem Video stellen wir Ihnen die Ex vivo Erzeugung und Erweiterung des menschlichen CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B) aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durch Stimulation mit CD40-Ligand und Interleukin-4.

Zusammenfassung

CD40-aktivierte B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle für immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für die Immuntherapie von Krebs ^3.1 identifiziert worden. Im Vergleich zu Dendritische Zellen (DCs), den am besten charakterisierten APC, CD40-B-Zellen haben mehrere verschiedene biologische und technische Eigenschaften. Ähnlich wie DCs, B-Zellen eine erhöhte Expression von MHC-und kostimulatorischen Molekülen (Abb. 1b) zeigen, weisen eine starke Wanderungsbewegungen Kapazität und präsentieren Antigen-Präsentation effizient auf T-Zellen nach Stimulation mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L). Doch im Gegensatz zu unreifen oder reifen DCs, Express-CD40-B-Zellen die volle Lymphknoten Homing Triade bestehend aus CD62L, CCR7/CXCR4 und Leukozyten-Antigen-Funktion-1 (LFA1, CD11a/CD18), die für Homing zu sekundären lymphatischen Organen (Abb. 1a) ^3. CD40-B-Zellen können ohne Schwierigkeiten aus sehr geringen Mengen im peripheren Blut, die weiter in vitro werden, um sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (> 10 ⁹ Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs kann erweitert erzeugt werden Patienten (Fig.1c, d) ^1,4.

In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert CD40-B-Zellen aus humanen PBMC erhalten. Key-Moleküle für die Zellkultur sind CD40-Ligand, Interleukin-4 (IL-4) und Cyclosporin A (CsA), die in einer 3-4 Tage alten Kultur-Zyklus wieder aufgefüllt werden. Für Laborzwecke CD40-Stimulation wird durch NIH/3T3-Zellen exprimierenden rekombinanten humanen CD40-Liganden (tCD40L NIH/3T3) ⁵ zur Verfügung gestellt. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen ist die Expression des humanen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig überprüft werden (Abb.2).

Nach 14 Tagen CD40-B-Zell-Kulturen bestehen aus mehr als 95% reinen B-Zellen sowie eine Ausweitung des CD40-B-Zellen über 65 Tage ist oft möglich, ohne Verlust der Funktion ^{1, 4.} CD40-B-Zellen effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T Zellen ^6. Sie haben nicht nur prime naϊve, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen ^7,8. CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren ^9.

Protokoll

Das Protokoll für die Erzeugung von menschlichen CD40-aktivierte B-Zellen aus PBMC ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von CD40-Liganden exprimieren NIH/3T3-Zellen, die als Platten-gebundenen Feeder-Zellen verwendet werden. Teil B beschreibt die eigentliche CD40-B Kultur.

A. Herstellung von Feeder-Zellen (tCD40L NIH/3T3)

Die tCD40L NIH/3T3 ist ein Anhänger murine Fibroblasten-Zelllinie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen.

1. Entfernen Sie alte Medium aus dem Primär-Kultur mit einer sterilen Pipette und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Saugen Sie das PBS nach dem Waschen.
2. 4 mL Trypsin / EDTA in einer 75 cm ^2-Kolben für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Verwenden leichtes Klopfen auf die Zellen zu lösen.
3. Fügen Sie 10 ml Wildtyp-mittel-und Schwenk-sanft.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Tube mit einer sterilen Pipette und drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min.
5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Wildtyp-Medium. Zählen Sie die Zellzahl eines Aliquots der Zellsuspension und bereiten drei 50 ml-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Zellen:
   1. 1,5 x 10 ⁶ Zellen zur Subkultivierung
   2. 0,2 x 10 ⁶ Zellen / well für die Bestrahlung von CD40-B-Zell-Kultur verwendet
   3. Rest einfrieren (falls erforderlich).
6. Drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min.
7. Entfernen Sie den Überstand.
   1. Für Subkultivierung: resuspendieren 1,5 x 10 ⁶ Zellen in 10 mL Wildtyp-Medium in einem 75 cm ² Zellkulturflasche (Zelldichte 1,5 x 10 ⁵ Zellen / ml), fügen G-418 [0,7 mg / mL] und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO _2. Split die Zellen zweimal pro Woche.
   2. Für die CD40-B-Zell-Kultur: Sie müssen 1,2 x 10 ⁶ Zellen für eine 6-Well-Platte. Resuspendieren der Zellen in Wildtyp-Medium mit einer Dichte von 0,1 x 10 ⁶ Zellen / ml und bestrahlen sie bei 78 Gy. Plate 2 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO _2. Mit diesem vorbereiteten Platten für B-Zell-Stimulation, wenn tCD40L NIH/3T3-Zellen Anhänger sind (mindestens 4 Stunden: check Einhaltung mit dem Mikroskop; warten Sie nicht länger als 24 h auf B-Zell-Stimulation beginnen). (Fahren Sie mit B.)

B. CD 40-B-Zell-Kultur

I. Vorbereitung der PBMCs für CD40-Stimulation (Tag 0):

Bitte beachten Sie: Bevor Sie fortfahren vergewissern, dass Feeder-Zellen adhärent sind. Fügen Sie immer frische Lösungen von Interleukin-4 und Cyclosporin A, um das Wachstum mittelfristig unmittelbar vor dem Gebrauch.

1. Nehmen PBMCs, entweder frisch oder in geeigneter Weise aufgetaut. Resuspendieren PBMCs zweimal in 50 ml 1x PBS zu waschen und Spin-down ersten Mal bei 265 xg für 7 min und ein zweites Mal bei 190 xg für 7 min zu anderen Zellen zu entfernen. Überstand verwerfen und die Zellen in 20 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Zellsuspension.
2. Spin down benötigte Menge an Zellen bei 225 xg für 5 min. Für eine 6-Well-Platte 4 x 10 ⁶ Zellen / well benötigt werden, also 24 x 10 ⁶ Zellen pro Platte.
3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die PBMC mit 1 x 10 ⁶ Zellen / ml in CD40-B Kulturmedium frisch mit 50 U / ml Interleukin-4 ergänzt als Wachstumsfaktor und 0,63 ug / ml Cyclosporin A Auswuchs der T-Zellen zu verhindern (Angesichts Konzentrationen beziehen sich auf ein ml Kulturmedium!).
4. Entfernen Sie den Überstand aus 6-Well-Platte vorinkubiert mit tCD40L NIH/3T3-Zellen.
5. Waschen Sie die Anhänger tCD40L NIH/3T3-Zellen mit 2 mL PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium.
6. Vorsichtig 4 ml PBMC Suspension (1 x 10 ⁶ Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO _2.
8. Am Tag 7 reculture der Zellen (Fahren Sie mit 3.2.).

II. Rekultivierung von CD40-B-Zellen (Tag 7 und dann alle 3-4 Tage):

1. Ernte-Clustern von CD40-B-Zellen aus 6-Well-Platte durch Resuspendieren mit einer 10 mL Pipette und sie gemeinsam in eine 50 ml Tube.
2. Spin down bei 225 xg für 7 Minuten und vollständig ersetzen den Überstand mit CD40-B Waschmedium. Während des Zählens der Zelle Betrag eines aliquoten, drehen Sie das Zellen nach unten bei 225 xg für 5 Minuten. Resuspendieren CD40-B-Zellen in CD40-B Kulturmedium in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Fügen Sie frische Lösungen von Interleukin-4 in einer Konzentration von 50 U / ml und 0,63 pg / mL Cyclosporin A auf das Medium.
4. Entfernen Sie den Überstand aus einer 6-well-Platte mit tCD40L NIH/3T3-Zellen vorinkubiert.
5. Waschen Sie die adhärenten Zellen mit 2 ml PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium.
6. vorsichtig 4 ml (1 x 10 ⁶ Zellen / ml) von CD40-B Suspension in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
7. Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO ^2.
8. Subculture Zellen wieder alle 3-4 Tage bis zum Ende mit hochreinem humanen CD40-aktivierte B-Zellen nach insgesamt 14 Tagen.

C. Trouble-Shooting - Was passiert, wenn CD40-B-Zellen nicht wachsen?

1. Haben Sie überprüft, für die CD40-Ligand Expression von Feeder-Zellen?
2. Die Platte gebundene Nährzellen der Stimulation dürfen nicht älter 24 Stunden?
3. Ist eine Kontamination mit Mykoplasmen möglich?
4. War der Interleukin-4-Lösung zur Ergänzung eingesetzt frisch aufgetaut und hatte die entsprechende biologische Aktivität?
5. War Cyclosporin A aufgenommen in der richtigen Konzentration?

Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1.

Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 2 dargestellt.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Feeder Zelle Wildtyp-Medium		Feeder Zelle Selektionsmedium
Reagens	Konzentration	Reagens	Konzentration
DMEM-Ham / F12		DMEM-Ham / F12
L-Glutamin	365 pg / mL	L-Glutamin	365 pg / mL
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 ug / mL	Gentamycin	15 ug / mL
		G-418	0,7 mg / mL

CD40-B Waschmedium		CD40-B Kulturmedium
Reagens	Konzentration	Reagens	Konzentration
IMDM		IMDM
L-Glutamin	584 pg / mL	L-Glutamin	584 pg / mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycin	15 ug / mL	Gentamycin	15 ug / mL
		rh Transferrin	50 ug / mL
		rh Insulin	5 ug / mL
		AB-Humanserum	10%

Reagens	Firma	Bestell-Nr
DMEM / Ham 's F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco ®	REF 21980-032
Dulbecco PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
AB-Humanserum	Invitrogen	Cat No 34005100
Holo-Transferrin menschlichen	Sigma	Cat No T0665
Insulin human	Sigma	Cat No I2643
Gencin ®	Delta Select	Art.-Nr. 7395800
Rekombinanten humanen Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES-Puffer	PAA	Cat No S11-001
G-418 Sulfat	PAA	Cat No P02-012
Trypsin / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco ®	REF 15400-054

Reagens	Firma	Bestell-Nr
Sterile Pipettenspitzen	Sarstedt
6-Well-Platte	NUNC	Cat No 140675
50 ml konischen Rohr	BD Falcon ™	Cat No 352070
Zellkulturflasche	SARSTEDT	Cat No 83.1813.002