Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt das Protokoll eines in-vitro-Angiogenese-Assay, rekapituliert mehrere Stufen der Angiogenese. Zeitraffer-Bilder von Keimen, Lumenbildung, Verzweigung und Anastomose - die wichtigsten Merkmale der Angiogenese - gezeigt werden.

Zusammenfassung

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, in dem, in Antwort auf angiogene Stimuli, neue Schiffe aus dem bestehenden Gefäßsystem geschaffen werden. Diese Schritte sind: Abbau der Basalmembran, die Proliferation und Migration (sprießen) von Endothelzellen (EC) in der extrazellulären Matrix, die Ausrichtung der EG zu Schnüren, Verzweigungen, Lumenbildung, Anastomose, und die Bildung einer neuen Basalmembran. Viele in-vitro-Assays wurden entwickelt, um diesen Prozess zu studieren, aber die meisten nur imitieren bestimmte Stadien der Angiogenese und morphologisch die Schiffe innerhalb des Assays oft nicht Schiffe in vivo ähneln. Basierend auf früheren Arbeiten von Nehls und Drenckhahn, haben wir ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG und Fibroblasten nutzt optimiert. Dieses Modell rekapituliert alle wichtigen frühen Phasen der Angiogenese und, was wichtig ist, zeigen die Gefäße Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. EG werden auf Cytodex Mikroträger beschichtet und eingebettet in eine Fibrin-Gel. Fibroblasten sind auf der Oberseite des Gels, wo sie bieten notwendige lösliche Faktoren, die EG sprießen aus der Oberfläche der Kügelchen zu fördern geschichtet. Nach mehreren Tagen sind zahlreiche Schiffe zu, die leicht unter Phasen-Kontrast-und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden. Dieses Video zeigt die wichtigsten Schritte bei der Einrichtung dieser Kulturen.

Protokoll

VORBEREITUNG CELLS

1. Rufen Sie HUVEC und Fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 Tage vor Sicken.
2. Schalten Sie mittel-bis EGM-2 (Clonetics) am Tag vor Sicken für HUVEC und der Tag vor dem Einbetten für Fibroblasten.
3. Eine Konzentration von ~ 400 HUVEC pro Perle benötigt wird.
4. 20.000 Fibroblasten pro Vertiefung erforderlich ist.

COATING die Perlen mit HUVEC - Tag -1

1. Trypsinize HUVEC.
2. Lassen Perlen absetzen (nicht zentrifugieren!). Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Perlen kurz in 1 ml warmes EGM-2 Medium.
3. Mix 2500 Perlen w / 1x10 ⁶ HUVEC in 1,5 ml warmes EGM-2 Medium in einem FACS-Röhrchen. Legen Sie sie vertikal in den Inkubator. (Dies reicht für ca. 10 Brunnen. Scale up bei Bedarf)
4. Inkubieren für 4 Stunden bei 37 ° C, Schütteln der Röhre alle 20 min. (Good Beschichtung ist entscheidend für die Keimung.)
5. Nach 4 Stunden, übertragen Sie die Kügelchen zu einer T25-Kolben in 5 ml EGM-2 und verlassen O / N.

EMBEDDING Kügelchen IN Fibringel - Tag 0

1. Bereiten Sie die 2,0 mg / mL Fibrinogen-Lösung (siehe Rezepte).
2. Add 0,15 Einheiten / ml Aprotinin auf die Fibrinogen-Lösung.
3. Transfer-beschichteten Beads zu einem 15mL konischen Rohr und lassen Kugeln zu begleichen. Resuspendieren Perlen in 1ml von EGM-2 und in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
4. Waschen Sie die Perlen 3X mit 1ml von EGM-2 durch Pipettieren und langsam nach unten.
5. Graf Perlen auf einem Deckglas und resuspendieren in Fibrinogen-Lösung bei einer Konzentration von ~ 500 Beads / ml.
6. Add 0,625 Einheiten / ml Thrombin in jede Vertiefung.
7. Fügen Sie 0,5 ml der Fibrinogen / Bead-Suspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.
   
   Ändern Sie die Pipettenspitze für jeden gut!
   
   
8. Mischen Sie die Thrombin und Fibrinogen, indem Sie nach oben und unten vorsichtig mit der Pipettenspitze ~ 4 bis 5 mal. Achten Sie darauf, große Blasen machen.
9. Lassen Sie die Platte für 5 min in der Motorhaube, dann legen Sie sie in die 37 ° C-Inkubator für 10-15 min, ein Gerinnsel zu erzeugen.
10. Während des Wartens auf das Gerinnsel, trypsinize Fibroblasten.
11. 1 ml der EGM-2 pro Well tropfenweise.
12. Seed-Fibroblasten auf der Fibrin-Gel bei einer Konzentration von 20.000 Zellen pro Vertiefung.

HINWEISE:

Normalerweise, wenn das Fibrin-Gel gebildet wird, werden Sie winzige Bläschen in dem Gel zu sehen. Mach dir keine Sorgen, sie werden in 3-4 Tagen verschwinden.

Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag, dh, Tag 2, 4, 6, etc. ..

Am Tag 3 oder 4 sollten Sie beginnen, um zu sehen sprießen.

Diskussion

Es gibt einen wachsenden Konsens, dass die dreidimensionale (3D) in vitro Angiogenese-Assays ein Modell, das viel näher an der tatsächlichen Umgebung in vivo als erreicht mit Hilfe von 2D Kulturen anbieten. Es ist offensichtlich, dass überlegene 3D-Systeme sollten reproduzierbar sein, und in der Lage sein, mehrere der wichtigsten Schritte der Angiogenese zu imitieren. Während mehrerer früherer 3D-Assays entwickelt worden, viele von ihnen entweder schwer zu erhalten mikrovaskulären Zellen, oder nur zu rekapitulieren einige der Etappen....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham	17-0485-01	10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C.
Aprotinin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C.