Оптимизированная фибринового геля из бисера тест для изучения ангиогенеза

Резюме

Это видео демонстрирует протокол в анализе ангиогенеза пробирке, что повторяет несколько стадий ангиогенеза. Покадровый изображения прорастания, просвет образования, ветвление и анастомоза - ключевые особенности ангиогенез - это показано на рисунке.

Аннотация

Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором, в ответ на ангиогенных стимулы, новые суда создаются из существующих сосудов. Эти шаги включают в себя: деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции (прорастание) эндотелиальных клеток (ЕК) в внеклеточного матрикса, выравнивания ЕС в шнуры, ветвящийся, просвет образования, анастомоза, и формирование новой базальной мембраны. Многие в пробирке тесты были разработаны для изучения этого процесса, но большинство лишь имитируют определенные этапы ангиогенеза, и морфологически судов в анализах часто не похожи на судах в естественных условиях. На основе более ранних работ Nehls и Drenckhahn, мы оптимизировали в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС и фибробластов. Эта модель повторяет все ключевые ранних стадий ангиогенеза и, что немаловажно, судов дисплей патент межклеточных люмен окруженной поляризованной ЕС. ЕС покрыты на микроносителях cytodex и встроенных в гель фибрина. Фибробласты слой поверх геля, где они обеспечивают необходимый растворимых факторов, которые способствуют прорастанию ЕС с поверхности бусины. После нескольких дней, многочисленные суда присутствуют, которые можно легко наблюдается при фазово-контрастной и покадровой микроскопии. Это видео демонстрирует основные этапы в создании этих культур.

протокол

ПОДГОТОВКА КЛЕТОК

1. Вызовите HUVEC и фибробластов в M199/10% FBS / Пен-Strep (1:100) за 1-2 дня до бисером.
2. Коммутатор средних EGM-2 (Clonetics) день до бисером для HUVEC и позавчера вложение для фибробластов.
3. Концентрация ~ 400 HUVEC в шарик не требуется.
4. 20000 фибробластов на лунку необходимо.

Покрытие бисера с HUVEC - ДЕНЬ -1

1. Trypsinize HUVEC.
2. Разрешить бусин для урегулирования (НЕ ЦЕНТРИФУГА!). Аспирируйте супернатант и мыть бисером кратко в 1 мл теплой EGM-2 среды.
3. Mix 2500 бисером ж / 1x10 ⁶ HUVEC в 1,5 мл теплой EGM-2 среды в трубке СУИМ. Поместите его вертикально в инкубаторе. (Этого будет достаточно для ~ 10 скважин. Масштабирование при необходимости)
4. Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° С, пожимая трубку каждые 20 мин. (Хорошо покрытие имеет решающее значение для прорастания.)
5. Через 4 часа, передача покрытием бисером T25 колбу в 5 мл EGM-2 и оставить O / N.

Вложение ПОКРЫТИЕМ бусины фибринового геля - ДЕНЬ 0

1. Подготовка 2,0 мг / мл фибриногена решение (см. рецепт раздел).
2. Добавить 0,15 ед / мл апротинина к фибриногена решение.
3. Передача покрытых бисером 15 мл коническую трубку и пусть бисером обосноваться. Ресуспендируют бисером в 1 мл EGM-2 и передачи в 1,5 мл трубки центрифуги.
4. Вымойте бисером 3X с 1 мл EGM-2 с помощью pipeting вверх и вниз МЕДЛЕННО.
5. Граф бусины на покровное и ресуспендируют в фибриногена раствора при концентрации ~ 500 бусин / мл.
6. Добавить 0,625 ед / мл тромбина в каждую лунку.
7. Добавить 0,5 мл суспензии фибриногена / гранулы в каждую лунку 24-луночного планшета.
   
   Изменение пипетки для каждой скважины!
   
   
8. Смешайте тромбина и фибриногена, идя вверх и вниз, осторожно кончиком пипетки ~ 4 до 5 раз. Будьте осторожны, чтобы не делать большие пузыри.
9. Оставьте пластину в течение 5 мин в капюшоне, а затем поместить его в 37 ° С-инкубаторе в течение 10-15 мин для получения сгустка.
10. В ожидании сгусток, trypsinize фибробластов.
11. Добавить 1 мл EGM-2 на лунку падение мудрым.
12. Семенной фибробластов поверх геля фибрина в концентрации 20 000 клеток на лунку.

ПРИМЕЧАНИЯ:

Обычно, когда геля фибрина образуется, то вы увидите крошечных пузырьков в геле. Не волнуйтесь, они исчезнут в течение 3-4 дней.

Изменение средств массовой информации каждый день, то есть 2 дня, 4, 6, и т.д. ..

Днем 3 или 4, вы должны начать видеть прорастания.

Обсуждение

Существует растущий консенсус, что трехмерная (3D) в анализах пробирке ангиогенеза предлагаем модель, которая гораздо ближе к реальной среде, чем в естественных условиях можно добиться, используя 2D культур. Очевидно, что превосходное 3D-системы должны быть воспроизводимы, и будут способны имитиров?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham	17-0485-01	10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C.
Aprotinin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C.