Pressure Controlled Ventilation zu Acute Lung Injury in Mäusen zu induzieren

Zusammenfassung

Ein Mausmodell für Ventilator induzierte Lungenschädigung ist ein wichtiges Instrument, um eine akute Lungenversagen Studie In vivo. Hier berichten wir über eine einfach anwendbare In situ Modell für den akuten Lungenversagen mit Hochdruck-Beatmung zu akutes Versagen der Lunge auslösen.

Zusammenfassung

Murine Modelle sind umfassend genutzt, um akute Verletzungen verschiedener Organe Systeme (1-34) zu untersuchen. Akutem Lungenversagen (ALI), die bei längerer Beatmung auftritt, trägt zur Morbidität und Mortalität der Critical-Illness-und Studien über neue genetische oder pharmakologische Ziele sind Gebiete intensiver Untersuchung (1-3, 5, 8, 26, 30, 33 -36). ALI wird durch den akuten Ausbruch der Krankheit, die zu nicht-kardialen Lungenödem und anschließender Beeinträchtigung der pulmonalen Gasaustausch (36) führt definiert. Wir haben ein Mausmodell der ALI mit einem Druck-Beatmung an Ventilator-induzierten Lungenschädigung (2) induzieren entwickelt. Zu diesem Zweck sind C57BL / 6 Mäuse anästhesiert und eine Tracheotomie durchgeführt wird, gefolgt von Induktion von ALI über mechanische Lüftung. 3 Stunden - Mäuse sind in einem Druck-gesteuerte Einstellung mit einem inspiratorischen Spitzendruck von 45 mbar über 1 belüftet. Als Outcome-Parameter, Lungenödem (wet-to-dry-Verhältnis), bronchoalveoläre Flüssigkeit Albumingehalt, bronchoalveoläre Flüssigkeit und Lungengewebe Myeloperoxidase Inhalt und pulmonalen Gasaustausch beurteilt werden (2). Mit dieser Technik konnten wir zeigen, dass es ausreichend induziert akute Lungenentzündung und können zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen oder Genotypen (1-3, 5) zu unterscheiden. Daher ist diese Technik kann hilfreich sein, für Forscher, die molekularen Mechanismen in ALI mit einem genetischen Ansatz in Mäuse mit Gen-gezielten Löschung beteiligt zu verfolgen.

Protokoll

Allgemeine Bemerkungen:

Alle Arbeiten sind unter einer aufrechten Präpariermikroskop (Olympus, SZX10 mit Z-Axis Crank Post mit STU2 Ständer mit Galgen) und mit Hilfe eines chirurgischen Koagulator (11) durchgeführt werden. Die experimentellen Gruppen sollten so gut wie möglich in Alter und Gewicht angepasst werden, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Temperatur, Blutdruck, Anästhesie und Flüssigkeitszufuhr sollte stabil sein ganz.

1. Anästhesie und Luftröhre Vorbereitung

1. Verwenden Sie C57BL / 6 Mäusen, die mindestens 10 Wochen alt sind und einen Körper von 22-25 g. Induce Anästhesie Verwendung von Natrium-Pentobarbital in einer Dosierung von 70 mg / kg Körpergewicht ip (6). Pflegen Sie Anästhesie ungefähr mit 10 mg / kg / h Natrium-Pentobarbital. Seien Sie vorsichtig mit einer Überdosierung, da diese deutlich geringere könnte den Blutdruck. Re-Dosierung von Pentobarbital - auch nach Stunden-können zu schweren Anstieg der Plasmaspiegel führen.
2. Nach Narkoseeinleitung, sichere Mäuse in Rückenlage mit dem oberen und unteren Extremitäten an den Tisch mit einem Klebeband und eine Naht befestigt zu den Knöcheln. Machen Sie dasselbe für den Kopf durch die Zähne. Ausreichende einstweilige ist für eine erfolgreiche Intubation und eine gut kontrollierte Chirurgie wichtig. Vor der Operation, decken Sie die Maus mit Mineralöl, das Risiko der Maus Haare Allergien zu reduzieren. Um sicherzustellen, dass die Körpertemperatur stabil bleibt decken die Mäuse mit handelsüblichen Frischhaltefolie.
3. Legen Mäusen auf eine Temperatur gesteuerte beheizte Tisch (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Sonde Thermometer an thermischer Rückführung Steuerung der Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten
4. Expose der Luftröhre operativ. Dissect lateralen und dorsalen Seiten der Luftröhre des Bindegewebes und der Platz zwei 3,0 Seide chirurgisches Nahtmaterial (Harvard Apparatus, USA) mit jeweils 10 cm lange unter der Luftröhre. Die Nähte sollten ca. 1 cm voneinander entfernt sein.
5. Sorgfältig incise die Luftröhre 3 bis 4 mm unterhalb Kehlkopf zwischen zwei kreisförmigen Knorpel mit einer McPherson-Vannas Scissors (8 cm, gerader Klinge, World Precision Instruments, USA). Achten Sie darauf, nicht zu einer Blutung führen, da dies die Outcome-Parameter zu verwechseln könnte.
6. Führen Sie eine Intubation mit einem stumpfen Polyethylen Kanülen (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Legen Sie die Spitze des Polyethylen Kanülen in einem Winkel von 85 Grad in die Luftröhre. Dann kippen die Kanülen so dass es im Einklang mit den Tracheallumen ist. Drehen Sie dazu den Schlauch weiter unten in der Luftröhre, bis die Spitze der Kanülen in die Thorax-Öffnung verschwunden ist. Fixieren Sie das Rohr in dieser Position mit den beiden chirurgischen Seidennaht platziert dorsal der Luftröhre (siehe 1.4).

2. Technik der Ventilator-induzierten Lungenschädigung

1. Verbinden Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät. Zur Induktion Lungenschädigung verwenden wir einen Druck kontrollierte Lüftung Technik mit einem Servo 900 C von Siemens (DRE Veterinary, USA). Die Tiere werden belüftet mit inspiratorischen Spitzendruck von 45 mbar, Frequenz von 80 Atemzügen / min und einem positiven endexspiratorischen Druck von 0-3 mbar mit einer FiO ₂ = 1,0 sein. Die Inspiration zum Ablauf Verhältnis sollte 1:1 betragen. Trotz der Tatsache, dass die Servo 900 C als Beatmungsgerät für Menschen gebaut ist, funktioniert die Verwendung in einem Druck gesteuerter Lüfter Einstellung für die Lüftung von Mäusen ausgezeichnet.
2. Überwachen der Herzfrequenz mit einem EKG (zB Hewlett Packard, B blingen, Deutschland). Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz nicht unter 400 sinken. Man sollte sehen, eine Verschiebung des Herzens Achse nach rechts, wenn mechanische Lüftung als Zeichen der erhöhten pulmonalarteriellen Druck im Anschluss an eine Erhöhung der Druck im Brustraum eingeführt wird. Wenn die Maus entwickelt Bradykardie, überprüfen Sie die Temperatur und die Narkose-Dosis / Konzentration. Xylacin / Ketamin Anästhesie induziert eine herz von 250 / min und wird daher nicht empfohlen.
3. Tragen Sie eine geeignete Flüssigkeit ersetzt werden. Eine Infusion mit Kochsalzlösung 0,1 ml / Stunde über einen arteriellen und venösen Katheter vor der Beatmung durchgeführt werden soll, um eine ausreichende venöse Einreichung zu gewährleisten. Aufgrund der hohen Beatmungsdrücke den venösen Rückstrom zum Herzen gestört ist, was zu einem kritischen Abfall des mittleren arteriellen Druck führen kann. Auch könnte eine Kochsalzlösung Bolus von 500 ul gegeben ip vor der Operation sein.
4. Legen eines Katheters in die Arteria carotis zur kontinuierlichen Aufzeichnung des Blutdrucks (27). Befestigen Sie den Arm an den Körper, bevor Sie sezieren die Arterie zu starten. Die Halsschlagader wird über stumpfe Präparation der paratracheal Muskeln ausgesetzt. Nach weiteren Exposition und sorgfältiger Vermeidung jeglicher Traumatisierung des Gewebes (insbesondere des Nervus vagus), wird ein Katheter in das Gefäß mit zwei Nähten und einer kleinen Klemme (37) eingefügt. Dies legt eine längere Segment der Arterie. Legen Sie eine Ligatur ganz am Ende der Halsschlagader. Bringen Sie eine größere Klammer an das Ende des Fadens zu Spannungen oder fixieren th erhaltene Naht an den Tisch mit Klebeband. Stellen Sie ein weiteres Naht um die Arterie und sezieren die Arterie, die sehr distalen Ende. Hier legen einer kleinen Klemme. Verwenden Sie Mikro-Schere, eine kleine diagonale Öffnung in der Arterie geschnitten. Halten Sie die Öffnung mit einer feinen Pinzette (Dumont, WPI) und vorher die richtige Größe Katheter mit den Händen / Pinzette. Machen Sie einen Knoten mit dem zweiten Faden und sichern die Arterie. Lösen Sie die Klemme und vorab den Katheter weiter. Sichern Sie den Katheter mit mehreren Knoten und Band. Alternativ kann die Halsschlagader Katheter kann am Ende des Experiments eine arterielle Blutproben zur Blutgasanalyse zu sammeln.

3. Rückgewinnung von Gewebeproben

Nach 3 Stunden der künstlichen Beatmung, werden Proben gesammelt, um das Ausmaß der Lungenschädigung zu beurteilen. Wir empfehlen das Sammeln brochnoalveolar Spülflüssigkeit (BAL), arterielle Blut und Lungengewebe.

1. Erhalten BAL-Flüssigkeit am Ende des Experiments. Nach Vertiefung der Narkose, spülen Sie die Trachealtubus mit 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Flüssigkeit sollte in der Luftröhre / Lunge für 3 Sekunden verbleiben, bevor sie die Einziehung über die angeschlossene Spritze. Die BAL ist Snap-in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C für weitere Analysen. Seien Sie sich bewusst, dass das gewonnene Volumen konnte deutlich weniger als 1 ml.
2. Führen Blutgasanalyse am Ende des Experiments. Um das zu tun, sollte ein Schnitt direkt unterhalb des Brustbeins erfolgen. Halten Sie das Brustbein mit einer Pinzette und Umfang der Einschnitt entlang des Brustkorbs. Als nächstes wird die Membran an den Rändern eingeschnitten und wird aus den Rippen schneiden. Jetzt gibt es einen offenen Blick in die untere Öffnung des Thorax. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette und öffnen den Brustkorb durch lange Schnitte an der rechten und linken Seite (als seitliche wie möglich), so dass die komplette vordere Thoraxwand up-Stationen eingeschaltet ist. Dies sollte getan werden, während das Versuchstier noch mechanisch belüftet. Der linke Ventrikel punktiert mit einem 27 ½ G Nadel und arteriellen Blut-Analyse erfolgt mit dem i-STAT System (Abbott, USA). Wird die arterielle Blutgasanalyse durchgeführt werden soll, kann eine BAL nicht erreicht werden, da dies ein wesentlicher Confounder die Ergebnisse sein werden.
3. Alternativ zur oben beschriebenen Methode kann arterieller Blutproben über die Halsschlagader Katheter gesammelt werden. Allerdings sollte dies geschehen, bevor die BAL ist, erhalten werden.
4. Excise der Lunge en-bloc durch Hochziehen des Herzens und der Schnitt der Luftröhre. Haben ein Stück Gewebe bereit, Blut zu absorbieren, so das Operationsfeld sichtbar ist. Ziehen Sie das Herz in die Richtung des Bauches und vorsichtig entlang der Wirbelsäule geschnitten, alle Brustorgane zu mobilisieren. Cut der Aorta, entfernen Sie die Brustorgane und legen Sie sie auf eine saubere OP-Tisch.
5. Schneiden Sie das Herz und die großen Schiffe der Gewebeprobe. Stellen Sie sicher, dass es keine Thymusgewebe noch in der Lunge verbunden. Separate der Lunge mit einer Schere und in einzelne Röhren und Snap-freeze. Bei -80 ° C für weitere Analysen.

4. Die Messung der Lungenschädigung

Wir empfehlen die Verwendung der folgenden Outcome-Parameter, um das Ausmaß der Lungenschädigung zu bewerten: Führen Sie eine Albumin ELISA (Bethyl Laboratories, USA) und Myeloperoxidase (MPO) ELISA (Hycult Biotechnology, USA), um das Ausmaß der Barriere Dysfunktion und die Höhe der entzündlichen bewerten Zellen in der BAL-Flüssigkeit. Führen Sie eine MPO ELISA bilden auch das Lungengewebe. Wenn nass-to-dry-Verhältnis gemessen werden wir nicht erhalten BAL-Flüssigkeit und den Lungenkreislauf wird nicht geleert (siehe 3.3). Messen Sie das Gewicht der Lunge nach der Exzision. Dann Lungen sind für 48 h und im Lungengewebe wieder gemessen lyophilisiert. Dann wird das Nass-Trocken-Verhältnis wird in mg Wasser pro mg trockenes Gewebe (5) gemessen.

Abbildung 1. Protein-Gehalt in der BAL in Reaktion auf VILI. Mäuse mit Pentobarbital wurden, war Beatmung eingeleitet und die Mäuse wurden belüftet mit druck-Einstellungen (inspiratorischer Druck von 45 mbar, positive end-exspiratorische Druck 3 mbar, 100% inspiriert Sauerstoffkonzentration). Nach 0, wurde 1, 2 und 3 Stunden von Lüftungs-BAL geerntet und der Eiweißgehalt wurde quantifiziert mit einem Bicinchoninsäure Assay (BCA-Assay). Die relative Änderung der Proteingehalt gezeigt wird, normalisiert auf 0 Stunden der Lüftung (n = 4 pro Gruppe, * p <0,05 im Vergleich zur Kontrolle, Mittelwert ± SEM)

Diskussion

Die vorliegende Studie beschreibt eine Technik, bei der Ventilator-induzierten Lungenschädigung bei Mäusen. Dieses Modell zeigt sehr gut reproduzierbare Verletzungsgefahr durch hohen Druck Belüftung. Die Ermittler, die ein Studium Akut-Lungenschädigung bei Mäusen überlegen können von diesem Modell profitieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Natrium-Pentobarbital (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd,	VPL 9372	4mg/mL in Kochsalzlösung
Insyte 22 G	Beckton Dickinson	n / a
Suture, Silk 4.0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolene 8,0	Ethicon, USA	M8739	wiederverwendbar
Siemens 900 ° C	DRE Veterinary, USA	# 336	renoviert
Binokular (SZX10)	Olymp	n / a	betrachten großzügigen Arbeitsabstand
Heiztisch	Rt, Effenberger, Deutschland	n / a	nur und einzigen Anbieter
Blutdruckmessgerät	Cyber ​​Sense, Inc	BPM02
Ich STAT	Abbott	n / a