Pressione di ventilazione controllata per indurre lesioni polmonari acute nei topi

Riepilogo

Un modello murino per lesioni ventilatore polmonare indotta è un importante strumento per studiare una lesione acuta del polmone In vivo. Qui, segnalano un caso facile In situ di danno polmonare acuto con alta pressione ventilazione meccanica per indurre insufficienza acuta del polmone.

Abstract

Modelli murini sono ampiamente utilizzati per studiare le lesioni acute dei diversi sistemi di organi (1-34). Danno polmonare acuto (ALI), che si verifica con ventilazione meccanica prolungata, contribuisce alla morbilità e la mortalità della malattia critica, e studi su nuovi bersagli farmacologici o genetici sono aree di indagine intensa (1-3, 5, 8, 26, 30, 33 -36). ALI è definita dalla insorgenza acuta della malattia, che porta alla non-cardiaco edema polmonare e conseguente compromissione polmonare di scambio dei gas (36). Abbiamo sviluppato un modello murino di ALI, utilizzando una pressione di ventilazione controllata per indurre ventilazione indotta dal danno polmonare (2). A tal fine, i topi C57BL / 6 sono anestetizzati e una tracheotomia viene eseguita seguita da induzione di ALI tramite ventilazione meccanica. I topi sono ventilati in una pressione controllata ambiente con una pressione inspiratoria di picco di 45 mbar oltre 1 - 3 ore. Come parametri di risultato, edema polmonare (bagnato a secco ratio), il contenuto liquido broncoalveolare albumina, fluido broncoalveolare e polmonare contenuti mieloperossidasi dei tessuti e degli scambi gassosi polmonari sono valutati (2). Con questa tecnica si potrebbe dimostrare che induce sufficientemente infiammazione acuta dei polmoni e può distinguere tra diversi gruppi di trattamento o genotipi (1-3, 5). Pertanto questa tecnica può essere utile per i ricercatori che perseguono meccanismi molecolari coinvolti nella ALI utilizzando un approccio genetico nei topi con il gene-mirati eliminazione.

Protocollo

Osservazioni generali:

Tutte le operazioni devono essere effettuate con un microscopio verticale dissezione (Olympus, SZX10 con Z-Axis Messaggio Crank con STU2 Stand Stand Boom) e utilizzando un coagulatore chirurgico (11). I gruppi sperimentali devono corrispondere nel miglior modo possibile per età e peso per garantire la comparabilità dei risultati. Amministrazione di temperatura, pressione arteriosa, anestesia e fluido deve essere stabile nel tempo.

1. Anestesia e preparazione trachea

1. Utilizzare topi C57BL / 6 che sono almeno 10 settimane e hanno un corpo di 22-25 g. Indurre l'anestesia con pentobarbital sodico alla dose di 70 mg / kg ip di peso corporeo (6). Mantenere l'anestesia con circa 10 mg / kg / h di sodio pentobarbital. Siate cauti con sovradosaggio poiché questo potrebbe ridurre significativamente la pressione sanguigna. Ri-somministrazione di pentobarbital - anche dopo ore, può portare ad un aumento dei livelli plasmatici gravi.
2. Dopo l'induzione dell'anestesia, i topi sicuro in posizione supina con gli arti superiori e inferiori attaccato al tavolo con un nastro e una sutura fissato alle caviglie. Fare lo stesso per la testa usando i denti. Ritenuta sufficiente è importante per una intubazione di successo e un intervento chirurgico ben controllata. Prima dell'intervento, coprire il mouse con olio minerale per ridurre il rischio di allergia del mouse capelli. Al fine di garantire che la temperatura corporea rimane stabile coprire i topi con avvolgere gli alimenti disponibili in commercio.
3. Topi svolge su un tavolo a temperatura controllata riscaldata (RT, Effenberg, Monaco, Germania) con una sonda termometro rettale collegata al controller feedback termico per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C.
4. Esporre la trachea chirurgicamente. Sezionare le parti laterali e dorsale della trachea del tessuto connettivo e luogo due 3,0 sutura seta chirurgica (Harvard apparecchi, USA) ogni 10 cm di lunghezza sotto la trachea. I punti di sutura dovrebbe essere di circa 1 cm l'uno dall'altro.
5. Con attenzione incidere la trachea 3 - 4 mm al di sotto della laringe tra due cartilagini circolari con un McPherson-Vännäs Forbici (8 cm, lama dritta; Strumenti di precisione World, USA). Assicurarsi di non provocare un sanguinamento, per evitare di confondere i parametri di risultato.
6. Eseguire una intubazione tracheale con un brusco polietilene cannule (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Inserire la punta delle cannule polietilene in un angolo di 85 gradi nella trachea. Poi inclinare il cannule quindi è in linea con il lume tracheale. Lentamente anticipo il tubo a valle della trachea fino alla punta di cannule è scomparso nella apertura del torace. Fissare il tubo in questa posizione con la sutura di seta chirurgica due posti dorsale della trachea (vedi 1.4).

2. Tecnica di ventilazione indotta danno polmonare

1. Collegare il tubo di un ventilatore. Per indurre danno polmonare si usa una tecnica di ventilazione controllata a pressione utilizzando un Servo 900 C da Siemens (DRE Veterinaria, USA). Gli animali saranno ventilati con picco di pressione inspiratoria di 45 mbar, la frequenza di 80 respiri / min e una positiva di fine espirazione pressione di 0-3 mbar con una FiO ₂ = 1.0. L'ispirazione al rapporto di scadenza dovrebbe essere 1:1. Nonostante il fatto che il Servo 900 C è costruito come ventilatore per l'uomo, il suo utilizzo in un ambiente controllato ventilatore a pressione eccellenti opere per la ventilazione dei topi.
2. Monitor della frequenza cardiaca con un elettrocardiogramma (ad esempio Hewlett Packard, B blingen, Germania). Assicurarsi che la frequenza cardiaca non scenda sotto 400. Si dovrebbe vedere uno spostamento dell'asse cuore a destra, quando la ventilazione meccanica è istituito come un segno di aumento della pressione arteriosa polmonare conseguente a un aumento della pressione intratoracica. Se il mouse si sviluppa bradicardia, controllare la temperatura e la dose di anestetico / concentrazione. Xylacin / Ketamin anestesia induce un cuore cuore di 250 / min e non è pertanto raccomandato.
3. Applicare una sostituzione adeguata di liquidi. Un infuso con soluzione salina normale 0,1 ml / ora tramite un catetere arterioso o venoso deve essere eseguito prima della ventilazione, per garantire archiviazione sufficiente venosa. A causa delle alte pressioni di ventilazione è compromessa il ritorno venoso al cuore, che potrebbe portare ad un calo critico della pressione arteriosa media. Inoltre, il bolo di soluzione fisiologica di 500 microlitri potrebbe essere dato ip prima dell'intervento.
4. Posizionare un catetere in arteria carotide per la registrazione continua della pressione sanguigna (27). Fissare il braccio al corpo prima di iniziare la dissezione dell'arteria. L'arteria carotidea è esposta tramite dissezione dei muscoli paratracheali. A seguito di evitare ulteriore esposizione e attento di qualsiasi trauma dei tessuti (in particolare del nervo vagale), un catetere viene inserito nel vaso con due punti di sutura e un morsetto piccolo (37). Questo esporrà un segmento più lungo l'arteria. Inserire una legatura alla fine della carotide. Fissare una pinza più grande per la fine della sutura per ottenere ° tensione o fissaree sutura al tavolo con del nastro. Posto un altro sutura intorno all'arteria e sezionare l'arteria fino alla fine distale. Qui, posto una fascetta di piccole dimensioni. Usare le forbici per tagliare micro una piccola apertura in diagonale l'arteria. Tenere l'apertura con una pinza sottile (Dumont, WPI) e far avanzare il catetere di dimensione corretta, con le mani / pinze. Fare un nodo con il tuo sutura secondo e sicuro l'arteria. Allentare il morsetto e far avanzare il catetere ulteriormente. Fissare il catetere con parecchi nodi e nastro. In alternativa, il catetere in arteria carotide può essere posto alla fine dell'esperimento per raccogliere campioni di sangue arterioso per l'analisi dei gas del sangue.

3. Recupero di campioni di tessuto

Dopo 3 ore di ventilazione meccanica, i campioni vengono raccolti per valutare l'entità del danno polmonare. Si consiglia di raccolta del fluido brochnoalveolar lavaggio (BAL), il sangue arterioso e nel tessuto polmonare.

1. Ottenere BAL alla fine dell'esperimento. Dopo l'approfondimento di anestesia, sciacquare il tubo tracheale con 1 ml di tampone fosfato salino (PBS). Il fluido deve rimanere nella trachea / polmoni per tre secondi prima che sia il recupero attraverso la siringa collegata. Il BAL è snap-congelato in azoto liquido e conservati a -80 ° C per ulteriori analisi. Essere consapevoli del fatto che il volume recuperato potrebbe essere significativamente inferiore a 1 ml.
2. Effettuare analisi dei gas del sangue, alla fine dell'esperimento. Per farlo, un'incisione dovrebbe essere fatto proprio sotto lo sterno. Tenere lo sterno con una pinza e misura l'incisione lungo la gabbia toracica. Successivamente, il diaframma è inciso ai bordi ed è tagliata fuori dalle costole. Ora c'è una bella vista in apertura inferiore del torace. Sollevare lo sterno con una pinza e aprire il torace da tagli lunghi sul lato destro e sinistro (come laterale possibile) in modo che la parete toracica anteriore completo è rivolto verso l'alto. Questo dovrebbe essere fatto, mentre l'animale sperimentale è ancora a ventilazione meccanica. Il ventricolo sinistro è perforato con un ago 27 ½ G e analisi del sangue arterioso viene eseguita utilizzando il sistema i-STAT (Abbott, USA). Se l'emogasanalisi deve essere eseguita, un BAL non è possibile ottenere, dal momento che questo sarà un fattore confondente significativo per i risultati.
3. In alternativa al metodo precedente, campioni di sangue arterioso possono essere raccolti tramite il catetere in arteria carotide. Tuttavia questo dovrebbe essere fatto prima che il BAL si ottiene.
4. Dell'accisa i polmoni in blocco tirando il cuore e tagliato la trachea. Avere un pezzo di tessuto pronti ad assorbire il sangue, in modo che il sito chirurgico è visibile. Tirare il cuore in direzione del ventre e tagliato con cura lungo la spina dorsale di mobilitare tutti gli organi toracici. Tagliare l'aorta, rimuovere gli organi toracici e metterli su un tavolo pulito chirurgico.
5. Tagliare il cuore e il vaso principale del campione di tessuto. Assicurarsi che non vi è alcun tessuto del timo ancora attaccato al polmone. Separare i polmoni con una forbice e il luogo in singoli tubi e gli snap-congelare. Conservare a -80 ° C per ulteriori analisi.

4. Misura del danno polmonare

Si consiglia di utilizzare i seguenti parametri esito per valutare l'entità del danno polmonare: Eseguire un albumina ELISA (Bethyl Laboratories, USA) e un mieloperossidasi (MPO) ELISA (Hycult Biotechnology, USA) per valutare il grado di disfunzione della barriera e la quantità di infiammazione cellule nel BAL. Eseguire un MPO ELISA anche formare il tessuto polmonare. Se bagnato a secco rapporto deve essere misurata non otteniamo BAL e la circolazione polmonare non viene svuotata (vedi 3.3). Misurare il peso dei polmoni dopo l'escissione. Poi polmoni sono liofilizzati per 48 ore e nel tessuto polmonare di nuovo si misura. Poi il bagnato a secco rapporto è misurato come milligrammi di acqua per mg di tessuto secco (5).

Figura 1. Contenuto proteico nel BAL in risposta a VILI. I topi sono stati anestetizzati con pentobarbital, ventilazione meccanica è stato istituito e topi sono stati ventilati con pressione controllata impostazioni (pressione inspiratoria di 45 mbar, positiva di fine exspiratory pressione 3 mbar, 100% ispirata concentrazione di ossigeno). Dopo 0, ore 1, 2 e 3 della ventilazione BAL è stato raccolto e il contenuto proteico è stato quantificato usando un test bicinchoninic acido (dosaggio BCA). La variazione relativa del contenuto proteico viene mostrato normalizzata a 0 ore di ventilazione (n = 4 per gruppo, indica * p <0,05 rispetto ai controlli, media ± SEM)

Discussione

Il presente studio descrive una tecnica di esecuzione di ventilazione indotta dal danno polmonare nei topi. Questo modello dimostra lesioni altamente riproducibili a causa di una ventilazione ad alta pressione. Gli investigatori che considerano gli studi acuta danno polmonare nei topi possono trarre beneficio da questo modello.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Pentobarbital di sodio (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd,	VPL 9372	4mg/ml in soluzione salina
Insyte 22 G	Beckton Dickinson	n / a
Sutura, seta 4,0	Harvard Apparatus	517698
Sutura, Prolene 8,0	Ethicon, USA	M8739	riutilizzabili
Siemens 900 ° C	DRE Veterinaria, Stati Uniti	# 336	ristrutturato
microscopio da dissezione (SZX10)	Olimpo	n / a	considerare generosa distanza di lavoro
Riscaldamento Tabella	Rt, Effenberger, Germania	n / a	unico fornitore e un'unica
Pressione arteriosa periferica	Cyber ​​Senso, Inc	BPM02
I STAT	Abbott	n / a