Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Zusammenfassung

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die Entdeckung In vivo Pharmakologische Wirkungen auf NMJs.

Zusammenfassung

Hinterbein Muskeln von Nagetieren, wie gastrocnemius und tibialis anterior, werden häufig für in vivo pharmakologische Studien der Signale für die Bildung und Pflege von Säugetieren NMJs verwendet. Allerdings ist eine medikamentöse Eindringen in diese Muskeln nach subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung häufig unvollständig oder ungleichmäßig und viele NMJs können, bleiben unberührt. Obwohl die systemische Verabreichung von Geräten wie Mini-Pumpen der raum-zeitlichen Wirkungen verbessern kann, kann die invasive Natur dieses Ansatzes Ursache zu verwechseln entzündliche Reaktionen und / oder direkte Schädigung der Muskulatur. Darüber hinaus ist eine vollständige Analyse der NMJs in einem Hinterbein Muskeln schwierig, weil es zeitaufwendig serielle Schnitte und umfangreiche Immunfärbung erfordert.

Die Maus LAL ist ein dünnes, flaches Blatt Muskel oberflächlich auf dem Rücken des Halses befindet. Es ist eine schnell zuckenden, dass die Funktionen auf der Ohrmuschel zu bewegen. Es enthält rostralen und kaudalen Abschnitte, die von der Mittellinie des Schädels stammen und erstrecken sich seitlich auf die knorpeligen Teil jeder Ohrmuschel. Der Muskel wird durch einen Zweig des Nervus facialis, die kaudal Projekte beim Verlassen des Foramen stylomastoideum geliefert. Wir und andere haben herausgefunden, LAL, um eine bequeme Zubereitung, die Vorteile für die Untersuchung von kurz-und langfristigen In-vivo-Wirkungen von Drogen auf NMJs und Muskeln bietet. Erstens erleichtert ihre oberflächliche Lage mehrere lokale Applikationen von Medikamenten unter leichter Betäubung. Zweitens ermöglicht seine Dünnheit (2-3 Schichten von Muskelfasern) Visualisierung und Analyse von fast allen NMJs innerhalb des Muskels. Drittens erlaubt die einfache seziert er mit seinen Nerven intakt zusammen mit dem Muster seiner Innervation ergänzende elektrophysiologische Untersuchungen in vitro ^9,5. Last, und vielleicht am wichtigsten, eine kleine applizierte Volumen (~ 50 ul) leicht deckt den gesamten Muskel-Oberfläche sorgt für eine gleichmäßige und bei längerer Exposition aller NMJs auf das Medikament und eliminiert die Notwendigkeit für einen systemischen Ansatz ^1,8.

Protokoll

1. Die subkutane Verabreichung von Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten

1. Bereiten Sie unter aseptischen Bedingungen die entsprechende Dosis von mAChR-Antagonist, (vgl. Tabelle), indem man das Medikament in steriler physiologischer Kochsalzlösung in 1,5 ml Reaktionsgefäß. Die folgenden Antagonisten wurden verwendet: Atropin, Methoctramin, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
2. Draw 50 ul Lösung in a1cc Insulinspritze und eine separate Spritze für jede Maus. Auch bereiten Spritzen mit physiologischer Kochsalzlösung nur für jede Maus in der Kontrollgruppe. Keep Spritzen auf Eis, bis die Injektion bereit.
3. Anesthetize Mäuse mit Ketamin-Xylazin-Cocktail (120 mg / kg Ketamin, 8 mg / kg Xylazin) Check für eine angemessene Narkosetiefe durch die Beobachtung Mangel an Reaktion auf Prise Zeh.
4. Nach ordnungsgemäßer Sedierung, rasieren Behaarung des rostralen Bereich des Kopfes bis zum kaudalen Bereich des Halses, wischen restlichen Haare weg mit 70% Ethanol.
5. Bewegen Sie die Maus unter Stereomikroskop, und legen Nadel parallel zur LAL Muskel während Hochziehen leicht auf die Nadel der Spritze (Abb. 1A, B). Dies gewährleistet, dass die Nadel in darüber liegenden Bindegewebes eingesetzt wird und nicht direkt beschädigt LAL Muskel selbst. Führen Sie die Nadel so, dass die Spitze deckt den kaudalen Bereich des LAL Muskel.
6. Ganz langsam beginnen, Lösung über das Recht LAL Muskel injizieren, während Zurückziehen der Spritze, die insgesamt Injektion sollte etwa 1 Minute. Wenn injiziert richtig, sollte die Lösung bilden eine "Kuppel", die etwa 1 cm im Durchmesser ist, in die darüber liegende Haut, die für mindestens eine Stunde bleiben. Ein gleichmäßig eingespritzt Lösung deckt den gesamten rostralen und kaudalen Regionen der rechten LAL Muskel.
7. Wiederholen Sie den Vorgang alle 12 Stunden für 1 bis 7 Tagen. Für andere Studien1 benutzten wir das gleiche Protokoll zu injizieren Wachstumsfaktoren alle 12 Stunden für bis zu 21 Tage. Keine anormalen Reaktionen wurden von Mäusen mit Narkose 2x pro Tag für bis zu 21 Tage verabreicht wird.

2. Dissection von LAL Muskeln

1. Euthanize Mäuse mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (390 mg / kg). Der Tod ist durch die Beurteilung Mangel an Herzschlag nach Thorakotomie durchgeführt wird gewährleistet.
2. Pin Sie die Maustaste in eine Sektion Gericht, Dorsalseite mit Pin 1 in jeder Pfote und 1 Stift durch die Nase.
3. Machen Sie den ersten Schnitt durch die Haut nur mit kleinen Feder Schere zu schneiden entlang der linken LAL aus der Region nur proximal an das Ohr, um die Region rund um das linke Schulterblatt.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Haut in dieser Region, aber vermeiden Schneiden zu nahe an das rechte Ohr, da dies eine der Ansatzstellen für das Recht LAL Muskel.
5. Suchen Sie den mittig platzierten Fettgewebe Streifen Lipid entlang der Mittellinie auf der äußeren Oberfläche des Kopfes, wo rechts und links LAL Muskeln zu erfüllen. Mit kleinen Feder Schere, schnitt 1cm auf der rechten Seite das Fettgewebe (in Richtung des linken Ohres) vom proximalen Rand der linken LAL Muskel bis zum Erreichen der Schulter (Abb. 1C).
6. Sobald der Schnitt gemacht, Ziehen Sie die richtigen Muskeln LAL mit kleinen Zange auf die Bauchseite des Muskels freizulegen. Trim das Bindegewebe und Faszien während vorsichtiges Ziehen an der rechten LAL Muskel mit einer Pinzette (Abb. 1C).
7. Cut um den kaudalen Ende des rechten LAL an der Basis des Ohres. Weiter Schnitt, Bewegung in Richtung des rostralen Ende des rechten Ohres, halten das Recht LAL umgedreht (Abb. 1C).. Es ist besser, mehr Gewebe bei diesem Schritt als Gefahr der Beschädigung der LAL selbst gehören. Wenn der Muskel beginnt zu trocknen, Pipette 1X PBS in den Muskel.
8. Legen Sie seziert Recht LAL in 30mm Kultur Sylgard Schale mit 1X PBS, Rücken nach oben. Pin unten vier Ecken des Muskels mit kleinen Insekten Pins.
9. Mit Hilfe von kleinen Zangen und Scheren Frühjahr, sauber Bindegewebe aus dorsalen und ventralen Flächen der rechten LAL Muskel. Schalten Muskel wieder und wieder-pin, um sauber aus Ventralfläche. 3.2 Muskeln können in der gleichen 30mm Schale gelegt werden.

3. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 1

1. Vor Beginn der Immunfärbung, bereiten alle notwendigen Reagenzien. 1X PBS, 2% Rinderserumalbumin BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS benötigt werden. Pre-cool Methanol in -20 ° C Gefrierschrank.
2. Lassen Sie LAL Muskeln in der Schüssel Dorsalseite während dieses Prozesses merken. Discard 1X PBS-Lösung und fügen genug 4% (PFA), um den Muskel zu decken. Legen Gericht auf Schüttler gesetzt bei Drehzahl 2 oder 3 für 20 Minuten. Soweit nicht anders vermerkt, sollte das Gericht auf einem Schüttler für die folgenden Schritte gesetzt werden.
3. Discard 4% PFA und waschen den Muskel mit 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils.
4. Discard letzten 1X PBS waschen und fügen 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS-Lösung für 30 '.
5. Discard 0,1 M Glycin-Lösung eined add 1X PBS mit Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin bei einer Konzentration von 1:200 für 15 '.
6. Discard α-Bungarotoxin Lösung und waschen Muskel in 1X PBS, 3 mal 10 'jeweils.
7. Permeabilisieren Gewebe, indem vorgekühlt Methanol und die Schale in der -20 ° C Gefrierschrank für genau 5 Minuten, kein Schütteln erforderlich.
8. Entfernen Methanol und 3 x waschen 10 'jeweils mit 1X PBS. Discard letzten Wasch-und Block-Gewebe mit 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS für 1 Stunde. Das Waschen und Blockierung Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
9. Inkubieren Sie die Muskeln über Nacht, Zittern, bei 4 ° C in einer Mischung aus Primär-Antikörper in Blocking-Lösung (vgl. Tabelle) verdünnt.

4. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 2

1. Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils bei Raumtemperatur.
2. Add-Cocktail Sekundärantikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (vgl. Tabelle). Die Muskeln müssen vor Licht von diesem Schritt weiter geschützt werden Foto-Bleiche von Alexa-Fluor 647-Fluoreszenz zu verhindern.
3. Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils.
4. Reinigen Sie verbleibende Bindegewebe in 1X PBS, schneiden Sie die seitlichen Grenzen der LAL Muskeln und Montage auf Folien Dorsalseite auf, die Verwendung von Glas Deckgläschen und Montage Medien. Verwenden Sie klare Nagellack Deckglas fixieren.
5. Schützen Sie Folien aus Licht und bei -20 ° C bis zur Analyse bereit.

5. Konfokale Bildgebung von LAL NMJs

1. Hochauflösende konfokale Bilder sind mit einem Leica Plan Apo 63X Öl-Objektiv (1.4NA) auf einem Leica TCS 4D konfokalen Mikroskop erreicht.
2. Fluorescein und Alexa 647-Signale wurden gleichzeitig mit Laserlinien 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) und 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) gescannt bzw.. Sequenziell ist Rhodamine Signal wird dann mit der Laserlinie 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) gescannt. Optische Schnitte wurden mit 0,3 &mgr; Abständen gesammelt, und die Anzahl der Bilder in der z-Ebene von 60 bis 80 variiert. Die Lochkamera ist Airy 1 (107,97 um) angepasst. Das Bildformat 1024 x 1024 (X, Y), mit einem Zoom-Faktor von 1, bei 400Hz Geschwindigkeit führt zu einer Bildgröße von 234,32 um x 234,32 um und Pixelgröße von 229,05 nm x 229,05 nm.
3. Leica TCS-NT Software zur Erfassung wird dann verwendet, um z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren.
4. Multipanel Bilder sind für Helligkeit und Kontrast mit Hilfe von Adobe Photoshop angepasst.
5. Für eine typische LAL Muskel, sollte man in der Lage sein ca. 75-100 en face NMJs analysieren. Synaptic Stabilität wird durch Merkmale wie räumliche Ausrichtung der prä-, peri-und postsynaptischen Elementen (zB Nerven, Schwann-Zellen und Muskeln), und Messungen der synaptischen Bereich (dh Synapse Größe) bestimmt.

Repräsentative Ergebnisse:

Bei den erwachsenen Säugetieren NMJ, erarbeitet ein einziger Motor Axon feinen Verästelungen, die sehr differenzierte Lauben einer Nervenendigung (Abb. 2; Green) Form auf einer einzigen Muskelfaser, die genau auf postsynaptische Cluster von Nikotinsäure AChRs (Abb. 2; Red) apposed . Perisynaptically, Terminal Schwann-Zellen eng decken alle Zweige der präsynaptischen Nervenendigungen (Abb. 2, blau). Die strukturelle und funktionelle Integrität dieses dreigliedrige Organisation ist stark gestört durch die tägliche Anwendung von Subtyp-spezifischen mAChR Inhibitoren. In dem hier vorgestellten Beispiel (Abb. 3), beschwört 4-DAMP, ein mAChR-Antagonist mit hoher Affinität für M1, M3, M4 und M5 mAChR-Subtypen, selektive Eliminierung von Nervenendigungen aus zahlreichen NMJs ganzen Muskel Oberfläche (Abb. 3B, C). Darüber hinaus sind Terminal Schwann-Zellen ungewöhnlich ruhig ⁸ als von hellen S100 Kennzeichnung ohne Prozess-Erweiterung (Abb. 3B ", 3C") belegt. Postsynaptisch sind Muskelfasern normal und es gibt keinen Verlust von nAChRs (Abb. 3B ', 3C).

Abbildung 1. Anatomische Lage und Organisation des LAL Muskel. Lage von rostral (rLAL), caudal (ClaI) und der LAL Nerv (LALn) und entsprechende Endplatte Bands gezeigt werden (A, Einschub). Die Lage und Orientierung der Nadel in Bezug auf die LAL Muskel ist für das Injektionsverfahren (B) dargestellt. Incision Punkte sind für die Dissektion Verfahren (C) gezeigt.

Abbildung 2. Tripartite Organisation der NMJ. High-Vergrößerung konfokalen Ansichten einer Maus NMJ. Ein einzelnes Axon erarbeitet feinen Endäste (A), dicht von Terminal Schwann-Zellen und deren Prozesse (A ', Sternchen zeigen Sie auf Terminaldienste Schwann Zellkörper) abgedeckt. Postsynaptisch in einer Muskelfaser, ist eine Ansammlung von Nikotinsäure AChRs genau auf die Zweige des Nervus Terminals apposedSignale und Terminal-Schwann-Zellen.

Abbildung 3. LAL Muskeln mit 4-DAMP, ein mAChR-Antagonisten behandelt werden. Low-und High-Vergrößerung konfokalen Blick LAL Muskeln mit Fahrzeug oder 4-DAMP behandelt. Im Gegensatz zu den Vehikel-behandelten Muskeln (A-A'''), zahlreichen NMJs in der 4-DAMP-behandelte Muskel fehlt Nervenendigungen (B-B''', C-C'''). Ein boxed Bereich in Abbildung 2B ist in Abbildung 2C gezoomt.

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Diskussion

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von bisher nicht Rollen von Subtyp-spezifischen mAChR Signalisierung in die Stabilität und die Wartung von Säugetieren NMJs. Diese Methode wird auch nützlich sein, um die Auswirkungen von neurotrophen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Zum Beispiel fand unser Labor, dass Ciliary neurotrophen Faktor (CNTF) sprießen aus nahezu allen LAL Nervenendigungen in erwachsenen Mäusen hervorgerufen 1 . Dieses Ergebnis mit früheren Studien von C...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Ketamin	Hospira	NDC0409-2051-05	Dosis: 120mg/kg
Xylazin	Lloyd Laboratories	LA33806	Dosis: 8mg/kg
Atropin	Sigma-Aldrich	A0132	(> 98% Reinheit); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg
Atropin	Voigt Global Distribution	AT105	Pharmazeutischer Qualität
Methoctramin	Sigma-Aldrich	M105	Dosis: 100 - 400M
4-DAMP	Sigma-Aldrich	D142	Dosis: 2.5mg/kg
AFDX-116	Tocris Bioscience	1105	250M
AFDX-384	Tocris Bioscience	1345	50M - 500M
MT 7	Peptide Internationalen	PMT-4340-s	0,1 - 1M
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7,4	Invitrogen	10010049
Paraformaldehyd	Fischer	T353-500	Machen Sie 10% Lösung zunächst durch Auflösen 10g/100mL entionisiertes destilliertes Wasser; machen 4% mit 1X PBS, pH-Wert einstellen auf 7,4
Sodium pentobarbitol	Virbac Tiergesundheit	NDC-051311-050-01	Dosis: 390mg/kg
Sylgard	Dow Corning	Part # 184	Befolgen Sie die Anweisungen, die mit Kit kommen, können mehrere große Kulturschale verwenden (30mm, 60mm, 100mm) je nach Bedarf
0,1 M Glycin	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g bis 25 mL von 2% BSA / PBS
2% Rinderserumalbumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Lösen 2g BSA in 100 ml 1X PBS
0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100 mL	Lösen Sie 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS
α-Bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200
SMI-312	Sternberger Monoklonale Antikörper	SMI312	Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:1000
SV2	Developmental Studies Hybridoma der Bank	SV2-Überstand	Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:10
S100	Dako	Z0311	Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:400
FITC-Ziege-anti-Maus-IgG1	Roche	03117731001	Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200, aber wenn Hintergrund ist hoch, versuchen 1:400
Alexa-Fluor 647 konjugierten Ziege anti-Kaninchen	Invitrogen	A21244	Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200
Vectashield fluoreszierenden Eindeckmittel	Vector Laboratories	H-1000	Dies ist keine Hard-Set-Medium, müssen Sie das Deckglas mit klarem Nagellack zu sichern.
Kleine Frühling Schere	Feine Science Tools	15002-08
Dissektionszangen	Feine Science Tools	11295-51