Подкожного введения мускариновых антагонистов и Triple-Иммуноокрашивание из Лонг Levator Auris мышц у мышей

Резюме

Мы описываем процедуры повторных доз ингибиторов мускариновых сигнализации на Лонг поднимающей Auris (LAL) мышцы молодых взрослых мышей и для последующего иммуноокрашивания его нервно-мышечного соединения (NMJs) в wholemounts. LAL мышц имеет уникальные преимущества для выявления В естественных условиях Фармакологического воздействия на NMJs.

Аннотация

Задние мышцы конечностей грызунов, таких как икроножной и передней большеберцовой, которые часто используются для прижизненного фармакологические исследования сигналов необходимо для формирования и поддержания млекопитающих NMJs. Тем не менее, препарат проникновения в эти мышцы после подкожного или внутримышечного введения часто неполные или неодинаковым и многие NMJs может оставаться неизменным. Хотя системное введение с таких устройств, как мини-насосы могут улучшить пространственно-временных эффектов, инвазивный характер такого подхода может вызвать смешанные воспалительные реакции и / или прямой ущерб мышцы. Более того, полный анализ NMJs в мышцу задней конечности является сложной задачей, поскольку требует много времени последовательный секционирования и обширные иммунной окраски.

LAL мыши представляет собой тонкий, плоский лист мышца, расположенная поверхностно на тыльной поверхности шеи. Это быстро сокращающихся мышц, функции, чтобы перемещать ушной раковины. Он содержит ростральной и хвостовой части, которые происходят от средней линии черепа и тянутся по бокам к хрящевой части каждой ушной раковины. Мышцы поставляется ветви лицевого нерва, что проекты, каудально при выходе шилососцевидный отверстия. Мы и другие нашли LAL быть удобной подготовки, что дает преимущества для изучения как краткосрочных, так и долгосрочные в естественных условиях воздействия наркотиков на NMJs и мышц. Во-первых, его поверхностное расположение облегчает несколько локальных приложений наркотиков, находящихся под легкой анестезией. Во-вторых, своей худобой (2-3 слоев мышечных волокон) позволяет визуализации и анализа практически всех NMJs в мышцах. В-третьих, простота рассекает его с ее нетронутыми нервы вместе с образцом его иннервации позволяет дополнительного анализа электрофизиологических в пробирке ^9,5. Последнее, возможно, самое главное, малый применяются объема (~ 50 мкл) легко покрывает всю поверхность мышц, обеспечивает равномерную и длительное воздействие всех его NMJs к препарату и устраняет необходимость в системном подходе ^1,8.

протокол

1. Подкожное введение ацетилхолина мускариновых рецепторов (mAChR) антагонисты

1. Подготовка в асептических условиях соответствующую дозу mAChR антагонист (см. таблицу) путем растворения препарата в стерильном физиологическом растворе в 1,5 мл трубки реакции. Следующие антагонистов были использованы: атропин, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, МТ 7.
2. Ничья 50 мкл раствора в шприце a1cc инсулина и использовать отдельный шприц для каждой мыши. Также приготовьте шприцами содержащие физиологический раствор только для каждой мыши в контрольной группе. Держите шприц по льду до готовности внедрить.
3. Обезболить мышей с кетамином ксилазина коктейль (120 мг / кг кетамина, 8 мг / кг ксилазина) Проверьте соответствующие глубины анестезии, наблюдая отсутствие реакции на ноги крайнем случае.
4. После правильной седативный эффект, брить волосы покрытие ростральной области головы до хвостового области шеи, протрите оставшиеся волосы от 70% этанола.
5. Наведите под стереомикроскопа и вставить иглу параллельно LAL мышцу в то время как подтягивание слегка на иглу шприца (рис. 1а, б). Это гарантирует, что игла вводится в вышележащих соединительной ткани и непосредственно не повредить LAL мышцы. Вставьте иглу так, чтобы кончик крышки хвостового аспект LAL мышцы.
6. Очень медленно начинаю вводить раствор на право LAL мышц при выводе шприц, и общее время инъекции должна быть примерно 1 минуту. Если вводится должным образом, решение должно стать "Купол", что составляет примерно 1 см в диаметре, в вышележащих кожи, которые будут оставаться, по крайней мере один час. Равномерно вводят раствор покроет всю ростральной и хвостовой регионам право LAL мышцы.
7. Повторяйте процедуру каждые 12 часов от 1 до 7 дней. Для других studies1, мы использовали тот же протокол для введения факторов роста, каждые 12 часов на срок до 21 дней. Нет ненормальные ответы наблюдались у мышей вводили наркоз 2x в день на срок до 21 дней.

2. Препарирование LAL мышцы

1. Усыпить мышей с передозировкой натрия фенобарбитала (390 мг / кг). Смерть обеспечивается оценки отсутствие сердцебиения после торакотомии выполняется.
2. Придавить мыши в рассечение блюдо, сверху с 1 штифт в каждой лапе и 1 контактный через нос.
3. Сделайте первый разрез через кожу только, используя маленькие ножницы весны до разрезать вдоль левого LAL из региона только проксимальнее ухо к области вокруг левой лопатки.
4. Осторожно снимите кожу в этом регионе, но и избежать сокращения слишком близко к правому уху, поскольку это является одной из точек привязки на право LAL мышцы.
5. Найдите по центру полосы жировой ткани липидного вдоль средней линии, на поверхностный поверхности головы, где правые и левые мышцы LAL с концами. Использование маленькие ножницы весной, вырезать 1 см справа от жировой ткани (в сторону левого уха) от проксимального края левой LAL мышц до достижения плеча (рис. 1в).
6. Как только разрез делается, отогните право LAL мышцы с небольшой пинцет, чтобы разоблачить брюшной стороне мышцы. Trim соединительной ткани и фасции при тщательном подтягивание на право LAL мышц щипцами (рис. 1в).
7. Вырезать вокруг хвостовой конец правой LAL у основания уха. Продолжить резки, двигаясь в направлении ростральной конце правым ухом, сохраняя право LAL перевернулся (рис. 1в).. Лучше, чтобы включать больше ткани на этот шаг, чем рискуете повредить сам LAL. Если мышца начинает иссякать, пипетка 1X PBS в течение мышцы.
8. Место расчлененный право LAL в 30 мм культуры Sylgard блюдо с 1X PBS, спинной стороной вверх. Придавить четырех углах мышцы с небольшим контактов насекомого.
9. Используя небольшие щипцы и ножницы весной, чистая соединительная ткань из спинной и брюшной поверхности правой LAL мышцы. Включите мышцы снова и снова контактный для того, чтобы счистить брюшной поверхности. 2-3 мышцы могут быть размещены в том же 30-мм блюдо.

3. Тройной иммуноокрашивания из LAL NMJs: День 1

1. Перед началом иммуноокрашивания, подготовить все необходимые реагенты. 1X PBS, 2% бычьего сывороточного альбумина BSA) / PBS, 0,1 М глицина в 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 в 2% BSA / PBS, и 4% параформальдегида (PFA) в 1X PBS будет необходимо. Предварительное охлаждение метанола в морозильной камере -20 ° C.
2. Оставьте LAL мышцы закреплен в сторону спинного блюдо во время этого процесса. Отменить решение 1X PBS и добавьте достаточно 4% (PFA) для покрытия мышцы. Место блюдо на шейкере при скорости набора 2 или 3 в течение 20 минут. Если не указано иное, блюдо должно быть уделено шейкер для следующих шагов.
3. Отменить 4% PFA и мыть мышцы с 1X PBS 3 раза, 10 'каждая.
4. Отменить последнее 1X PBS вымыть и добавить 0,1 М глицина в 2% BSA / PBS решение для 30 '.
5. Отменить 0,1 М глицин решениеD Добавить 1X PBS содержащего родамина сопряженные α-бунгаротоксина в концентрации 1:200 для 15 '.
6. Отменить α-бунгаротоксина решение и мыть мышцы в 1X PBS, 3 раза 10 'каждая.
7. Permeabilize ткани, добавив предварительно охладить метанол и место блюдо в морозильной камере -20 ° С в течение 5 минут, точно, не качая необходимости.
8. Удалить метанола и промыть 3 раза 10 'каждый 1X PBS. Отменить последнее мыть и блок ткани с 0,2% тритона Х-100 в 2% BSA / PBS в течение 1 часа. Мытье и блокирование действия выполняются при комнатной температуре.
9. Инкубируйте мышцы за одну ночь, дрожа, при 4 ° С в коктейль из первичных антител разводят в блокирующий раствор (см. таблицу).

4. Тройной иммуноокрашивания из LAL NMJs: День 2

1. Вымойте мышцы 1X PBS 3 раза, 10 'каждый при комнатной температуре.
2. Добавить коктейль из вторичными антителами в блокировании решения в течение 1 часа при комнатной температуре (см. таблицу). Мышцы должны быть защищены от света от этого шага вперед, чтобы предотвратить фото-отбеливание Alexa Fluor 647-флуоресценции.
3. Вымойте мышцы 1X PBS 3 раза, 10 'каждая.
4. Очистите все оставшиеся соединительной ткани в 1X PBS, вырезать боковые границы LAL мышцы и смонтировать на слайдах спинной стороной вверх, с использованием стеклянной крышкой-квитанции и монтаж средств массовой информации. Используйте ясный лак для ногтей обеспечить покрытие скольжения на месте.
5. Защита слайды от света и хранить при -20 ° С до готовности для анализа.

5. Конфокальной изображений LAL NMJs

1. Высокое разрешение конфокальной изображения, полученные с планом Leica Apo 63x нефти цели (1.4NA) на Leica TCS 4D конфокальной микроскопии.
2. Флуоресцеина и Alexa 647 сигналов одновременно были отсканированы с лазерных линий 488 нм (аргон, 488 нм, 20 мВт) и 633 нм (гелий-неоновый, 633 нм, 10 мВт), соответственно. Последовательно, родамина сигнал затем сканируется с лазерной линии 561 нм (DPSS, 561, 20 мВт). Оптический разделы были собраны на 0,3 мкм интервалы и количество изображений в г-плоскости колебалась от 60-80. Обскуры настроен на Эйри 1 (107,97 мкм). Формат изображения 1024 x 1024 (X, Y), при этом коэффициент увеличения на 1, на 400 Гц результаты скорости в изображении размером 234,32 мкм и длиной 234,32 мкм и размером пикселя 229,05 нм х 229,05 нм.
3. Leica TCS-NT приобретение программного обеспечения затем используется для восстановления Z-серии изображений в максимальной проекции интенсивности.
4. Multipanel изображения с учетом яркости и контрастности использованием Adobe Photoshop.
5. Для типичного LAL мышцы, надо уметь анализировать примерно 75-100 NMJs фас. Synaptic устойчивость определяется функций, таких как пространственное выравнивание пре-, пери-и постсинаптических элементов (т.е. нерва, Шванн клеток и мышц), а измерения синаптической области (то есть, синапс размера).

Представитель результаты:

На взрослых млекопитающих NMJ, одного аксона двигатель развивает тонкой ветви, которые формируют высоко дифференцированного беседки из нервного окончания (рис. 2, зеленый) по одному волокну мышцы, точно соединенный с постсинаптической кластеров никотиновых АХР (рис. 2, Red) . Perisynaptically, терминал Шванн клетки плотно охватывают все отрасли пресинаптических нервных окончаний (рис. 2, синий). Структурную и функциональную целостность этой трехсторонней организацией сильно возмущенный ежедневного применения подтип-специфических ингибиторов mAChR. В примере, приведенном здесь (рис. 3), 4-DAMP, mAChR антагонист с высоким сродством к M1, M3, M4 и M5 mAChR подтипы, вызывает селективное устранение нервных окончаний от многочисленных NMJs всей мышцы поверхности (рис. 3Б, С). Кроме того, терминал Шванн клетки аномально покоя ^8, о чем свидетельствует яркая маркировка S100 без процесса расширения (рис. 3B ", 3C"). Postsynaptically, мышечные волокна являются нормальными и нет потери nAChRs (рис. 3B, 3C ").

Рисунок 1. Анатомическое расположение и организация LAL мышцы. Расположение ростральной (rLAL), хвостовой (Клаль) и LAL нерва (LALn) и соответствующих полос концевой пластинки показаны (А, вставка). Местоположения и ориентации иглы по отношению к LAL мышц показана для инъекций порядок (Б). Разрез точками показаны для вскрытия процедуры (С).

Рисунок 2. Трехсторонней организации NMJ. Высокая увеличение конфокальной вид мыши NMJ. Одного аксона разрабатывает тонкой ветви терминал (), плотно покрыта терминал Шванн клеток и их процессов (', звездочки указывают на терминал органов Шванн клетки). Postsynaptically в мышечное волокно, кластер никотиновых АХР именно соединенный с ветвей нерва TERMIсигналы и терминальные Шванн клеток.

Рисунок 3. LAL мышцы обрабатывают 4-DAMP, mAChR антагонистом. Низкого и высокого увеличения конфокальной видом LAL мышцы получавших транспортного средства или 4-влажный. В отличие от автомобиля обработанной мышце (-'''), многочисленные NMJs в 4-DAMP обработанной мышце отсутствие нервных окончаний (В-В''', С-С'''). Коробках области на рисунке 2B увеличена на рис 2С.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод, представленный здесь позволяет исследовать ранее неизвестные роли подтипа конкретных mAChR сигнализации в стабильности и поддержание млекопитающих NMJs. Этот метод также будет полезна для проверки эффектов нейротрофических факторов и фармакологических агентов. Например, наши ла?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
кетамин	Hospira	NDC0409-2051-05	Доза: 120mg/kg
ксилазина	Ллойд лаборатории	LA33806	Доза: 8mg/kg
атропин	Sigma-Aldrich	A0132	(> 98% чистоты); Доза: 0.2mg/kg - 20mg/kg
атропин	Фойгт Глобальное распределение	AT105	Фармацевтическая класса
Methoctramine	Sigma-Aldrich	M105	Доза: 100 - 400M
4-DAMP	Sigma-Aldrich	D142	Доза: 2.5mg/kg
AFDX-116	Tocris Bioscience	1105	250M
AFDX-384	Tocris Bioscience	1345	50M - 500M
MT 7	Пептиды Международной	ПМТ-4340-х годов	0,1 - 1M
1X фосфатно-солевым буфером, рН 7,4	Invitrogen	10010049
Параформальдегид	Рыболов	T353-500	Сделать 10% раствор путем растворения первых 10g/100mL деионизированной дистиллированной водой, составляет 4% с 1X PBS, отрегулировать рН до 7,4
Натрий pentobarbitol	Virbac здоровья животных	NDC-051311-050-01	Доза: 390mg/kg
Sylgard	Dow Corning	Часть # 184	Следуйте инструкциям, которые поставляются с комплектом, можно использовать несколько размеров блюдо культуры (30мм, 60мм, 100 мм) в зависимости от потребностей
0,1 М глицин	Sigma-Aldrich	G-7126	Добавить 0.185g к 25 мл 2% BSA / PBS
2% бычьего сывороточного альбумина (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100г	Растворить 2 г в 100 мл BSA в 1X PBS
0,2% Triton X100 в 2% BSA / PBS (блокирующего буфера)	Sigma-Aldrich	T9284-100 мл	Растворите 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS
α-бунгаротоксина	Invitrogen	T1175	Использование при концентрации 1:200
SMI-312	Sternberger моноклональных антител	SMI312	Использование в концентрации 1:1000
SV2	Развивающие Исследования Гибридома банка	SV2-Супернатант	Использование при концентрации 1:10
S100	Dako	Z0311	Использование при концентрации 1:400
FITC-антимышиного IgG1	Roche	03117731001	Использование при концентрации 1:200, но если фон высокий, попробуйте 1:400
Alexa Fluor 647-сопряженных козьего анти-кролик	Invitrogen	A21244	Использование при концентрации 1:200
Vectashield флуоресцентные монтажа СМИ	Векторные лабораторий	H-1000	Это не жесткий набор носителей, то вам нужно обеспечить покрытие скольжения прозрачным лаком ногтей.
Малый Ножницы весна	Инструменты изобразительных наук	15002-08
Препарирование щипцы	Инструменты изобразительных наук	11295-51