Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Zusammenfassung

Wir haben eine Mikroverkapselung Technik als eine effektive Plattform für 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Endoderm und dopaminerge (DA) Neurone optimiert. Es bietet auch eine Chance für Immun-Isolierung von Zellen aus dem Wirt während der Transplantation. Diese Plattform kann für andere Zelltypen angepasst werden.

Zusammenfassung

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) werden als attraktive Alternative Quelle für Zellersatztherapie Schwellenländern, da sie in der Kultur erweitert werden kann, auf unbestimmte Zeit und unterschieden werden, um alle Zelltypen des Körpers. Verschiedene Arten von Biomaterialien wurden auch in Stammzellkulturen verwendet worden, um eine Mikroumgebung imitiert die Stammzellnische ^1-3 bereitzustellen. Letzteres ist für die Förderung von Zelle-zu-Zell-Wechselwirkung, Zell-Proliferation und Differenzierung in spezifische Linien als auch Gewebe, unter Angabe eines dreidimensionalen (3D) Umgebung ⁴ wie Kapselung wichtig. Das Prinzip der Verkapselung von Zellen umfasst Einfangen von lebenden Zellen innerhalb der Grenzen der semipermeablen Membranen in 3D-Kulturen ^2. Diese Membranen können für den Austausch von Nährstoffen, Sauerstoff und Impulse über die Membranen, während Antikörper und Immun-Zellen aus dem Wirt, der größer als der Kapsel Porengröße ⁵ sind ausgeschlossen. Hier vorab wirschickte einen Ansatz zur Kultur und zu differenzieren hESC DA-Neuronen in einer 3D-Mikroumgebung mit Alginat-Mikrokapseln. Wir haben uns verändert den Kulturbedingungen ^2, um die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC verbessern. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Zugabe von p160-Rho-assoziierte Coiled-Coil-Kinase (ROCK)-Inhibitor, Y-27632 und menschliche fetale Fibroblast-konditionierten Mediums Serumersatz (HFF-CM) an die 3D-Plattform signifikant erhöht die Lebensfähigkeit der eingekapselten HES in dem die Zellen exprimiert endgültigen Endoderm Markergene ^1. Wir haben nun diese 3D-Plattform für die Vermehrung von menschlichen embryonalen Stammzellen und effiziente Differenzierung zu DA-Neuronen verwendet. Protein-und Genexpressionsanalysen nach der letzten Stufe der DA neuronalen Differenzierung zeigte eine erhöhte Expression von Tyrosin-Hydroxylase (TH), ein Marker für die DA-Neuronen,> 100 Falten nach 2 Wochen. Wir stellten die Hypothese, dass unsere 3D-Plattform mit Alginat-Mikrokapseln kann nützlich sein, um die Proliferation zu studieren und gerichtete Differenzierungvon HES auf verschiedenen Linien. Das 3D-System erlaubt auch die Trennung von Feeder-Zellen aus hES während des Prozesses der Differenzierung und hat auch Potenzial für Immun-Isolierung während der Transplantation in der Zukunft.

Protokoll

Alle der unten beschriebenen Verfahren werden unter aseptischen Bedingungen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Reagenzien und Geräte verwendet werden in der untenstehenden Tabelle aufgelistet.

1. Herstellung von 1,1% Alginat (w / v)

1. In 0,275 g gereinigtes Natriumalginat (high Glucuronsäure-Gehalt ≥ 60%, Viskosität> 200 mPa · s, und Endotoxin ≤ 100 EU / g) in einem sterilen 50 ml-Röhrchen und 25 ml sterilem 0,1% Gelatinelösung früheren (0,5 g hergestellt gelatin/500 ml Milli-Q-H ₂ O gelöst und durch Autoklavieren).
2. Vortex das Rohr für ca. 30 Sekunden, um die teilweise aufzulösen Alginatpulver legen Sie dann das Rohr auf einer Orbitalmischer bei 10 xg über Nacht (Raumtemperatur).
3. In 2,778 ml von 9% steriler NaCl (4,5 g NaCl/50 ml Milli-Q-H ₂ O) in 25 ml Alginatlösung. Vortex das Rohr für etwa 30 Sekunden durch Zentrifugation bei 95 × g für 5 min.
4. Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 °, C für die kurzfristige Lagerung (1-2 Monate) oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung (ungefähr ein Jahr).

2. Vorbereitung von CaCl ₂ Fällbad

1. Man löst 14,7 g CaCl ^_2. 2H ₂ O und 2,38 g HEPES in 1 Liter Milli-Q H ₂ O.
2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4.
3. Sterilisieren Sie die Lösung mit dem 0,22 um-Filter.
4. Fällbad kann bei Raumtemperatur (6-12 Monate) gelagert werden.

3. Herstellung von Lösung Entkapseln

1. In 500 ml Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS), 50 ml 0,5 M EDTA und 5 ml 1 M HEPES.
2. Sterilisieren mit einem 0,22 um Filter oder Autoklaven bei 121 ° C für 20 min.
3. Bewahren Sie die decapsulating Lösung bei Raumtemperatur (6-12 Monate).

4. Vorbereitung von Serum-Ersatz (SR) Medium

1. Vor der Einkapselung vorbereiten SR Medium im Voraus, da debeschrieben in der Tabelle von spezifischen Reagenzien und Geräte.

5. Vorbereitung der ROCK-Inhibitor (Y-27632)

1. Verdünnte Y-27632 Pulver in 0,1% humanes Serumalbumin (HSA) in D-PBS, um einen 5 mM Lösung herzustellen.

6. Vorbereitung für die Verkapselung von HES

1. Pre-behandeln die Zellen mit Kulturmedien mit 10 uM von ROCK-Inhibitor (RI) für zwei Stunden bei 37 ° C (vor Licht schützen) ergänzt.
2. Nach der Behandlung RI, waschen Sie die Zellen mit D-PBS zweimal verdrängen die Zellen von Kulturplatten enzymatisch mit Accutase für 10 min bei 37 ° C
3. Vorsichtig kratzen die Zellen mit der Pipette oder Zellschaber und sammeln sich in einem 15 ml-Tube. Neutralisieren Sie die Accutase mit SR Medium im Verhältnis 1:1.
4. Um eine einzelne Zellsuspension herzustellen, filtern Sie die neutralisierte Zellen unter Verwendung eines 40 um Filter zu sammeln und in einem frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen.
5. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Lösung unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt.
6. Zentrifugieren der Zellsuspension 95 xg für 5 min und vorsichtig den Überstand verwerfen danach. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten 0,9% NaCl. Zentrifugieren 95 xg für 5 min und den Überstand verwerfen.

7. Verkapselung der Zellen

1. Eine 1 ml-Spritze an einem weichen Kunststoffschlauch 14G x 2 "IV-Katheter. Dies wird verwendet, um die Zellsuspension auf der Spritzenpumpe geladen werden, wie in 1 gezeigt anzusaugen.
2. Die Zellen mit vorgewärmter Alginatlösung in einer Dichte von 1,25 Millionen Zellen / ml Alginat. Vorsichtig mit der Spritze zu mischen und zu vermeiden Blasen zu erzeugen.
3. Einrichten des Wulstes Generator, Spritzenpumpe und die Luft-Durchflußmesser wie in 1 gezeigt. Weitere Details dieser Vorrichtungen sind in Tabelle der Reagenzien und Geräten angegeben.
4. Mit den Zellen in die Spritze gesaugt, verwerfen Sie den Kunststoffschlauch von IV-Katheter und legen Sie die Spritze mit der Kapselung Maschine. Stellen Sie sicher, dass es eine 10 cm Abstand sein zwischen das Ende der Einkapselungsmaschine und die Sammelstelle wie in 1 gezeigt.
5. Kapseln der Zellen, indem die Spritzenpumpe mit 20 ml / h, Luftdurchsatz in 8 l / min und einem Druck von 100 kPa (die Größe der Kapseln können durch Veränderung der Luftmenge geändert werden).
6. Sammeln Sie die verkapselten Zellen in eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 20 ml vorgewärmten Fällbad für 7 min, um die Kapseln zu stabilisieren gefüllt.
7. Übertragen Sie die verkapselten Zellen durch leichtes Ansaugen in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 20 ml 0,9% NaCl gefüllt.
8. Willkommen, dass die Kapseln in den Boden des Röhrchens absetzen dann vorsichtig der Überstand verworfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 0,9% NaCl.
9. Resuspendieren Sie die verkapselten Zellen in vorgewärmten Kulturmedium mit der RI (10 uM), Transfer in eine Kulturflasche ergänzt und bei 37 ° C / 5% CO _2.

8. Differenzierung von hES-Encapsulated zu DA-Neuronen

ve_content "> Die gekapselte hESC sind mit RI für 3 Tage vor der Differenzierung behandelt.

1. Samen der Maus Stroma-Zelllinie, PA6 Zellen bei einer Dichte von 1,0 x 10 ⁴ pro cm ² in 0,1% Gelatine beschichteten T75-Kolben und den Zustand der Zellen in PA6 DA neuronalen Differenzierung Medium (Tabelle Materialien) 24 Stunden vor der Differenzierung.
2. Übertragen der Kapseln in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, in den Boden des Rohrs zu regeln.
3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kapseln in PA6 Zelle klimatisierte DA neuronalen Differenzierung Medium.
4. Kultur der gekapselte hESC mit der PA6 Zellmonolayer (9 x 10 ⁶ hESCs pro 7,5 x 10 ⁵ PA6-Zellen) für 28 Tage mit einem Medienwechsel an Tag 4 und jeden zweiten Tag danach (ändern nur die Hälfte des Mediums jedes Mal).
5. Nach 3 Wochen in Kultur mit PA6-Zellen, zu ergänzen, die neurale Differenzierung DA-Medium mit 100 ng / ml SHH und 100 ng / ml FGF8a für die restliche Woche.

9. Decapsulation von Encapsulated hESC

1. Saugen Sie die Kapseln in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, am Boden des Röhrchens zu begleichen. Dann vorsichtig den Überstand verwerfen.
2. Waschen Sie die Kapseln mit D-PBS zweimal. Lassen Sie die Kapseln am Boden des Röhrchens absetzen entfernen Sie dann den Überstand.
3. 5 ml decapsulating Lösung für die Kapseln. Mischen Sie die Suspension gründlich durch Absaugen vor der Inkubation bei Raumtemperatur für 4-5 min.
4. Zentrifugieren Sie die nebennierenlosen Zellen bei 95 xg für 3 min und den Überstand verwerfen.
5. Waschen des Zellpellets mit D-PBS, gefolgt von Zentrifugation bei 95 × g für 3 min. Wiederholen.
6. Die nebennierenlosen Zellen können weiter kultiviert als Mono-oder verwendet für Downstream-Analyse.

10. Repräsentative Ergebnisse

Der Durchmesser der Alginat-Mikrokapseln ist 400-500 um. Die Anzahl der Zellen innerhalb der Kapsel war eine Schätzung dered durch Berechnen der Gesamtzahl der Zellen durch die Gesamtzahl von Kapseln pro Lauf unterteilt. Daher wurden etwa 5,0 × 10 ⁴ Zellen pro Kapsel geschätzt. Daraus gehen wir davon aus, dass die maximale Anzahl von Zellen kann die Kapsel enthalten etwa 1,0 x 10 ⁵ ist. Die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC ist> 80% (Abbildung 2) wie durch Verwendung Carboxyfluoresceindiacetat succinimidly Ester (CFDA) / Propidiumiodid (PI)-Assay bestimmt. Wir haben die Bedingungen von HES-Kapselung durch eine Verringerung der Alginat-Konzentration von 2,2% auf 1,1% gesunken und durch Änderung der Fällbad von Bariumchlorid zu Calciumchlorid optimiert. Von diesen Bedingungen haben wir gezeigt, dass nur die Zellen, die mit 1,1% Calciumalginat verkapselt waren, konnten überleben, vermehren sich und bilden EBs in vitro ^ein. Zur weiteren Optimierung der Bedingungen, die Auswirkungen von Kulturmedien und RI, Y-27632 wurden untersucht. Die Daten, wie in Abbildung 2 und 3 zeigen, dass die präsentierte RI Prévented Dissoziation-induzierten Apoptose und die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht erhalten und gefördert Clusterbildung ^1,6. Außerdem war die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC in HFF-CM + RI kultiviert deutlich höher als andere Gruppen ohne RI-Supplementierung, aber das war nicht signifikant unterschiedlich zu gekapselten hESC in SR + RI kultiviert. In ähnlicher Weise erhöhte Zellproliferation mit BrdU-Assay von 25% bis 75% als einzelne Zellen in Cluster (3), entwickelt. Apoptoseassay durch TUNEL zeigte, dass die einzelnen Zellen in Mikrokapseln in der SR-Medium apoptotischen waren (Daten nicht gezeigt), während die abgerufenen Cluster der HFF-CM waren überwiegend negativ für TUNEL. Bis zu einem gewissen Ausmaß, HFF-CM mit bFGF ergänzt gefördert das Überleben und die Proliferation von eingekapselten HES in Abwesenheit von Y-27632. Die Behandlung mit Y-27632 vor (2 Stunden) und nach der Verkapselung (für weitere 4 Tage) deutlich verbesserte Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Clusterbildung von verkapselten hESCin 1,1% Calcium-Alginat-Mikrokapseln.

Bisher haben wir gezeigt, dass gekapselten hESC erfolgreich auf definitive Entoderm ¹ unterschieden werden. Hier untersuchten wir die Anwendung der Verkapselung von Zellen als 3D-Plattform, um gekapselte hESC in DA-Neuronen zu differenzieren. hESC, die Embryoidkörpern (EB) in Kapseln gebildet waren direkte differenzierte und auf Entkapselung unter den beschriebenen Bedingungen zeigten eine progressive neuronale Morphologie (Abbildung 4) nach 2-3 Tagen Kultur mit mehr als 90% Lebensfähigkeit. Genexpressionsanalysen zeigten eine Down-Regulation von pluripotenten Marker, während OCT4 neuroprogenitor Marker, PAX6 und DA neuronalen Marker, TH wurden nach 7 Tagen der Differenzierung (5A) hochreguliert. Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass differenzierte HES PAX6-positiv (> 80%), aber OCT4-negativ waren am Tag 7. Weitere differenzierte hES zeigte TH-positiv (> 90%) Neuronen nach 21 Tagen (Abbildung 5B). Western-Blot-Analyse zeigte auch,eine Hochregulation der Expression TH ab Tag 14 (5C), während PAX6 Expression wurde nach Tag 21 nach unten reguliert. Im Vergleich dazu die Zellen unter zweidimensionalen (2D)-Umgebung unter ähnlichen Bedingungen kultiviert (zB RI Vorbehandlung für 2 Stunden und RI Nachbehandlung für 3 Tage vor der Differenzierung) gehalten einen hohen Prozentsatz von Pax6-positiven Zellen (> 80 %) während der Differenzierung und Zeit waren nicht so effizient bei der Differenzierung zu TH-positiven Zellen (<60%) wie in 3D-Umgebung durch Kapselung (5A und C) zur Verfügung gestellt.

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Diskussion

Mehrere Studien mit embryonalen Stammzellen der Maus und menschlichen embryonalen Stammzellen haben die Vorteile der 3D-Kultur-System in den Bereichen Biomaterialien und Tissue Engineering ^2,3 demonstriert. Wir verwendeten Kalzium-Alginat-Mikrokapseln als eine geeignete Plattform, um 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen im Vergleich zu Barium-Alginat studieren seit hESC zeigten signifikant höhere Rentabilität als in Calciumalginat als Barium-Alginat verkapselt. Diese Kultur System ermö...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Hinweise
Alginat (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	hohe Glucuronsäure Gehalt ≥ 60%, Viskosität> 200 mPa s, und Endotoxin <100 EU / g
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0,9% NaCl	Baxter Healthcare	AHF7123
Typ J1 Wulst Generator	Nisco Engineering Inc	SPA-0447
Multi-Phaser Spritzenpumpe	New Era Pump Systems Inc	Modell NE-1000
Ezi-Flow-Medical-Durchflussmesser	Gascon-Systeme	G0149
Y-27632	Merck	688000
Human Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	Millipore	SCR005
14G x 2 "IV-Katheter	Terumo	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	Für SR mittel (basal)
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	Für SR Medium (2 mM)
Knockout Serumersatz	Invitrogen	10828-028	Für SR-Medium (20%)
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063	Für SR-Medium (2,5 U / ml)
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Invitrogen	41400045	Für SR Medium (1x)
β-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Für SR-Medium (0,1 mM)
MEM NEAA Lösung	Invitrogen	11140-050	Für SR Medium (5 mM)
Glasgow Minimum Essential Medium	Invitrogen	11710035	Für DA neuronalen Differenzierung mittel (basal)
Knockout Serumersatz	Invitrogen	10828-028	Für DA neuronalen Differenzierung Medium (10%)
Natriumpyruvat	Invitrogen	11360070	Für DA neuronalen Differenzierung Medium (1 mM)
MEM NEAA Lösung	Invitrogen	11140-050	Für DA nEURAL Differenzierungsmedium (0,1 mM)
β-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Für DA neuronalen Differenzierung Medium (0,1 mM)
Sonic Hedgehog (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml)
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8a (FGF8a)	R & D Systems	4745-F8-050	Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml)