Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Riepilogo

Abbiamo ottimizzato una tecnica di microincapsulazione come una piattaforma efficace 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali per endoderma e dopaminergici (DA) neuroni. Esso fornisce inoltre l'opportunità di immuno-isolamento di cellule dall'host durante il trapianto. Questa piattaforma può essere adattato per altri tipi di cellule.

Abstract

Cellule staminali embrionali umane (hESC) stanno emergendo come una fonte alternativa per la terapia di sostituzione cellulare dal momento che possono essere espanse in coltura indefinitamente e differenziati a tutti i tipi di cellule nel corpo. Vari tipi di biomateriali sono stati utilizzati anche in colture di cellule staminali per fornire un microambiente che imita la nicchia delle cellule staminali ^1-3. Quest'ultimo è importante per promuovere cellula-cellula interazione, proliferazione cellulare, differenziazione e in lignaggi specifici nonché l'organizzazione fornendo un tessuto tridimensionale (3D) ambiente ⁴ come l'incapsulamento. Il principio della cella incapsulamento implica l'intrappolamento delle cellule viventi all'interno dei confini di membrane semipermeabili in colture 3D ^2. Queste membrane per lo scambio di nutrienti, ossigeno e stimoli attraverso le membrane, mentre gli anticorpi e le cellule immunitarie dall'host che sono maggiori delle dimensioni dei pori sono esclusi capsula ^5. Qui, si preha inviato un approccio alla cultura e differenziare hESC neuroni DA in un microambiente 3D utilizzando microcapsule di alginato. Abbiamo modificato le condizioni di coltura da ² a migliorare la redditività di hESC incapsulato. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'aggiunta di gp160-Rho-associata coiled-coil chinasi (ROCK) inibitore, Y-27.632 e fetale umano fibroblasti terreno condizionato sostituzione siero (HFF-CM) alla piattaforma 3D significativamente migliorato la redditività di hESC incapsulato in cui le cellule espresso definitive geni marcatori endoderma ^1. Abbiamo utilizzato questa piattaforma 3D per la propagazione della differenziazione hESC ed efficiente ai neuroni DA. Analisi di espressione proteica e genica dopo la fase finale di differenziazione neuronale DA mostrato un aumento dell'espressione della tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per DA neuroni,> 100 pieghe dopo 2 settimane. Abbiamo ipotizzato che la nostra piattaforma 3D con microcapsule di alginato può essere utile per studiare la proliferazione e la differenziazione direttadi hESC a vari lignaggi. Questo sistema 3D permette anche la separazione di cellule feeder dal hESC durante il processo di differenziazione e ha anche un potenziale di immuno-isolamento durante il trapianto in futuro.

Protocollo

Tutte le procedure riportate di seguito vengono eseguite con tecniche asettiche all'interno di una II classe biosicurezza Cabinet. Reagenti e attrezzature usati sono elencati nelle tabelle seguenti.

1. Preparazione del 1,1% alginato (w / v)

1. Aggiungere 0,275 g di alginato di sodio purificato (elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità> 200 mPa s, e endotossina ≤ 100 EU / g) in uno sterile tubo da 50 ml e aggiungere 25 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina preparata in precedenza (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H ₂ O e sciolto in autoclave).
2. Vortex la provetta per circa 30 secondi per sciogliere parzialmente la polvere di alginato quindi posizionare il tubo in un mixer orbitale a 10 xg per il pernottamento (temperatura ambiente).
3. Aggiungere 2,778 ml del 9% sterile di NaCl (4,5 g di NaCl/50 ml Milli-Q H ₂ O) a 25 ml di soluzione di alginato. Vortex la provetta per circa 30 secondi, seguito da centrifugazione a 95 xg per 5 min.
4. Conservare la soluzione di alginato a 4 °; C per la conservazione a breve termine (1-2 mesi) oppure a -20 ° C per la conservazione a lungo termine (circa un anno).

2. Preparazione di CaCl ₂ Bath Precipitazioni

1. Sciogliere 14.7 g di CaCl ^_2. 2H ₂ O e 2,38 g di HEPES in 1 litro di Milli-Q H ₂ O.
2. Regolare il livello di pH a 7,4.
3. Sterilizzare la soluzione con un filtro di 0,22 micron.
4. Bagno precipitazione può essere conservato a temperatura ambiente (6-12 mesi).

3. Preparazione della soluzione decapsulating

1. In 500 ml di Phosphate Buffered Saline Dulbecco (D-PBS), aggiungere 50 ml di EDTA 0,5 M e 5 ml di HEPES 1M.
2. Sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron o autoclave a 121 ° C per 20 min.
3. Conservare la soluzione decapsulating a temperatura ambiente (6-12 mesi).

4. Preparazione del siero di ricambio (SR) Medium

1. Prima di incapsulamento, preparare media SR in anticipo, come dedescritto nella tabella di reagenti e attrezzature specifiche.

5. Preparazione di Inhibitor ROCK (Y-27632)

1. Diluire Y-27.632 in polvere 0,1% albumina sierica umana (HSA) in D-PBS per ottenere una soluzione 5 mM.

6. Preparazione di hESC per l'incapsulamento

1. Pre-trattare le cellule con mezzi di coltura additivato con il 10 pM di inibitore ROCK (RI) per due ore a 37 ° C (riparo dalla luce).
2. Dopo il trattamento RI, lavare le cellule con D-PBS due volte e rimuovere le cellule da piastre di coltura enzimaticamente con accutase per 10 min a 37 ° C.
3. Raschiare delicatamente le cellule con il raschietto pipetta o cellulare e raccogliere in una provetta da 15 ml. Neutralizzare il accutase con il mezzo SR in rapporto 1:1.
4. Per preparare una sospensione di cellule singole, filtrare le cellule neutralizzati usando un filtro 40 um e raccogliere in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga.
5. Calcolare il numero totale di cellule in soluzione con un emocitometro.
6. Centrifugare la sospensione cellulare 95 xg per 5 minuti e accuratamente scartare il surnatante dopo. Lavare le cellule con pre-riscaldata 0,9% NaCl. Centrifugare 95 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.

7. Incapsulamento delle celle

1. Preparare una siringa da 1 ml collegata a un tubo di plastica morbida 14G x 2 "catetere IV. Questo viene utilizzato per aspirare la sospensione cellulare da caricare al pompa a siringa come mostrato nella Figura 1.
2. Risospendere le cellule con preriscaldata soluzione di alginato ad una densità di 1,25 milioni di cellule / ml alginato. Mescolare delicatamente con la siringa ed evitare di creare bolle.
3. Impostare il generatore tallone, pompa a siringa e il flussometro come mostrato nella Figura 1. Maggiori dettagli di questi dispositivi sono elencati nella Tabella di reagenti e attrezzature specifiche.
4. Con le cellule aspirato nella siringa, scartare il tubo di plastica del catetere IV e collegare la siringa alla macchina incapsulamento. Assicurarsi che vi sia spazio a 10 centimetri essere tra la fine della macchina incapsulamento e il punto di raccolta, come mostrato nella Figura 1.
5. Incapsulare le cellule impostando la pompa a siringa a 20 ml / h, portata d'aria a 8 L / min e una pressione di 100 kPa (la dimensione di capsule può essere modificata modificando la portata d'aria).
6. Raccogliere le cellule incapsulate in una capsula di Petri (100 x 15 mm) riempita con 20 ml di pre-riscaldato bagno precipitazione per 7 minuti per stabilizzare le capsule.
7. Trasferire le cellule incapsulate aspirando piano in provette per centrifuga da 50 ml contenenti 20 ml di 0,9% NaCl.
8. Lasciare le capsule a depositarsi nella parte inferiore del tubo poi delicatamente scartare il surnatante. Ripetere il processo di lavaggio con NaCl 0,9%.
9. Risospendere le cellule incapsulate in preriscaldata terreno di coltura supplementato con RI (10 pM), il trasferimento in un pallone di coltura e incubate a 37 ° C / 5% CO _2.

8. Differenziazione delle hESC incapsulato in neuroni DA

ve_content "> Il hESC incapsulato sono trattati con RI per 3 giorni prima della differenziazione.

1. Seme della linea cellulare topo stromale, PA6 cellule ad una densità di 1,0 x 10 ⁴ per cm ² in 0,1% di gelatina rivestita T75 pallone e le condizioni PA6 cellule in mezzo differenziamento DA neurale (Tabella Materials) 24 ore prima della differenziazione.
2. Trasferire le capsule ad una provetta da centrifuga da 50 ml e consentire loro di depositarsi nella parte inferiore del tubo.
3. Eliminare il supernatante e risospendere le capsule in PA6 cella climatizzata di media differenziazione DA neurale.
4. Cultura del hESC incapsulato con il monostrato cellulare PA6 (9 x 10 ⁶ hESC per 7,5 x 10 ⁵ cellule PA6) per 28 giorni con un cambiamento dei media il giorno 4 e ogni altro giorno successivo (cambiare solo la metà del terreno di volta in volta).
5. Dopo 3 settimane in coltura con cellule PA6, integrare il mezzo DA differenziamento neurale con 100 ng / ml SHH e 100 ng / ml FGF8a per la settimana rimanente.

9. Decapsulation di hESC Encapsulated

1. Aspirare le capsule in una provetta da centrifuga da 15 ml e consentire loro di depositano sul fondo della provetta. Poi scartare il surnatante con cura.
2. Lavare le capsule con D-PBS due volte. Lasciare le capsule si depositano sul fondo della provetta quindi rimuovere il supernatante.
3. Aggiungere 5 ml di soluzione decapsulating alle capsule. Mescolare la sospensione accuratamente tramite aspirazione prima di incubazione a temperatura ambiente per 4-5 min.
4. Centrifugare le cellule decapsulati a 95 xg per 3 min e scartare il surnatante.
5. Lavare il pellet di cellule con D-PBS seguita da centrifugazione a 95 xg per 3 min. Ripeti.
6. Le cellule decapsulate possono essere ulteriormente coltivate come monostrato o utilizzati per l'analisi a valle.

10. Risultati rappresentativi

Il diametro delle microcapsule è alginato di 400-500 micron. Il numero delle cellule all'interno della capsula era estimated calcolando il numero totale di cellule diviso per il numero totale di capsule per corsa. Pertanto, a circa 5,0 x 10 ⁴ cellule per capsula è stato stimato. Da questo, si presume che il numero massimo di cellule della capsula può contenere è di circa 1,0 x 10 ^5. La redditività di hESC incapsulato è> 80% (Figura 2) come determinato utilizzando con diacetato carbossifluoresceina succinimidly estere (CFDA) / ioduro di propidio (PI) test. Abbiamo ottimizzato le condizioni di incapsulamento hESC diminuendo la concentrazione di alginato dal 2,2% al 1,1% e modificando il bagno precipitazione da cloruro di bario cloruro di calcio. Da queste condizioni, abbiamo dimostrato che solo le cellule che sono state incapsulate con alginato di calcio 1,1% potrebbe sopravvivere, proliferare e formare EBs in vitro ^1. Per ottimizzare ulteriormente la condizione, gli effetti dei mezzi di coltura e RI, Y-27.632 sono stati esaminati. I dati presentati in Figura 2 e 3 dimostrano che prevente RId dissociazione apoptosi indotta e mantenuta la vitalità cellulare e la formazione di cluster promosso ^1,6. Inoltre, la vitalità di hESC coltivate in incapsulato HFF-CM RI + era significativamente più alta rispetto agli altri gruppi senza supplementazione RI, ma questo non era significativamente diversa da incapsulato hESC coltivate in RI SR +. Analogamente, la proliferazione cellulare mediante saggio BrdU aumentata dal 25% al ​​75% come singole cellule sviluppate in cluster (Figura 3). Apoptosi da TUNEL rivelato che le singole cellule in microcapsule coltivate in mezzo SR erano apoptotico (dati non mostrati), mentre i cluster recuperati dalla HFF-CM erano negative per lo più TUNEL. In una certa misura, HFF-CM supplementate con bFGF anche promosso la sopravvivenza e la proliferazione delle hESC incapsulati in assenza di Y-27.632. Tuttavia, il trattamento con Y-27.632 prima (2 ore) e dopo l'incapsulamento (per altri 4 giorni) marcatamente migliorata viabilità, la proliferazione e la formazione dei cluster hESC incapsulatoin microcapsule 1,1% di calcio alginato.

In precedenza abbiamo dimostrato che hESC incapsulato può essere successo differenziate per endoderma definitivo ^1. Qui, abbiamo esaminato l'applicazione di incapsulamento delle cellule come una piattaforma 3D per differenziare hESC incapsulato in neuroni DA. hESC, che formavano corpi embrionali (EB) in capsule erano diretti differenziata e decapsulation alle condizioni descritte hanno mostrato una progressiva morfologia neuronale (Figura 4) dopo 2-3 giorni di coltura con oltre il 90% vitalità. Analisi di espressione genica ha mostrato una down-regulation dei marker pluripotenti, OCT4 mentre marker neuroprogenitor, PAX6 e marker DA neuronale, TH sono up-regolati dopo 7 giorni di differenziazione (Figura 5A). Colorazione immunofluorescenza ha rivelato che hESC differenziata erano PAX6-positivi (> 80%), ma OCT4-negativi al giorno 7. Ulteriori hESC differenziato mostrato TH-positivi (> 90%) neuroni dopo 21 giorni (Figura 5B). Western blot ha dimostratoun up-regolazione dell'espressione dei TH dal giorno 14 (Figura 5C), mentre PAX6 espressione era down-regolato dopo giorno 21. In confronto, le cellule coltivate in ambiente bidimensionale (2D) in condizioni analoghe (RI esempio pretrattamento per 2 ore e RI post-trattamento per 3 giorni prima differenziazione) mantenuta un'alta percentuale di cellule positive PAX6-(> 80 %) per tutto il periodo di differenziazione e non erano così efficienti nella differenziazione di cellule TH-positive (<60%) come in ambiente 3D fornito da incapsulamento (Figura 5A e C).

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Discussione

Diversi studi che utilizzano cellule staminali embrionali di topo e hESC hanno dimostrato i benefici del sistema di coltura 3D in biomateriali e ingegneria dei tessuti ^2,3. Abbiamo usato microcapsule di alginato di calcio come una piattaforma adatta 3D per studiare la propagazione hESC e la differenziazione rispetto a quanto hESC alginato di bario hanno mostrato significativa redditività superiore quando incapsulati in alginato di calcio di alginato di bario. Questo sistema consente inoltre una coltura ad al...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Note
Alginato (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità> 200 mPa s, e endotossina <100 EU / g
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0,9% NaCl	Baxter Healthcare	AHF7123
Tipo J1 tallone generatore	Nisco engineering Inc	SPA-0447
Multi-Phaser pompa siringa	New Era Pump Systems Inc	Modello NE-1000
Ezi-Flow Flussimetro Medical	Gascon Sistemi	G0149
Y-27.632	Merck	688000
Albumina sierica umana	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	Millipore	SCR005
14G x 2 "catetere IV	Terumo	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	Per SR medio (basale)
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	Per mezzo SR (2 mM)
Knockout sostituzione Siero	Invitrogen	10828-028	Per SR mezzo (20%)
Penicillina-Streptomicina	Invitrogen	15070063	Per mezzo SR (2,5 U / ml)
Insulin-transferrina-Selenio (ITS)	Invitrogen	41400045	Per SR media (1x)
β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985-023	Per mezzo di SR (0,1 mm)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Per mezzo SR (5 mM)
Glasgow Media minimi essenziali	Invitrogen	11710035	Per mezzo di differenziazione DA neurale (basale)
Knockout sostituzione Siero	Invitrogen	10828-028	Per mezzo di differenziazione DA neurale (10%)
Sodio piruvato	Invitrogen	11360070	Per mezzo di differenziazione DA neurale (1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Per DA ndifferenziazione media EURAL (0,1 mm)
β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985-023	Per mezzo di differenziazione DA neurale (0,1 mm)
Sonic hedgehog (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	Per differenziazione DA neurale (100 ng / ml)
Fattore di crescita dei fibroblasti 8a (FGF8a)	R & D Systems	4745-F8-050	Per differenziazione DA neurale (100 ng / ml)