Murine fetale Echokardiographie

Zusammenfassung

Fetalen und perinatalen Tod ist ein gemeinsames Merkmal bei der Untersuchung genetischer Veränderungen beeinflussen kardiale Entwicklung. Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung hat 2-D-Auflösung verbessert und kann ausgezeichnete Informationen über frühe Herz-Entwicklung bieten und ist eine ideale Methode, um die Auswirkungen auf die kardiale Struktur und Funktion vor dem Tod zu erkennen.

Zusammenfassung

Transgene Mäuse, die Anzeige Anomalien in der kardialen Entwicklung und Funktion stellen ein leistungsfähiges Werkzeug für das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sowohl normale Herz-Kreislauf-Funktion und die pathophysiologische Grundlage des menschlichen Herz-Kreislauf-Erkrankung. Fetalen und perinatalen Tod ist ein gemeinsames Merkmal bei der Untersuchung genetischer Veränderungen beeinflussen Herzentwicklung ^1-3. Um die Rolle der genetischen oder pharmakologischen Veränderungen in der frühen Entwicklungsphase der Herzfunktion zu studieren, hat Ultraschall-Bildgebung des Live Fötus zu einem wichtigen Werkzeug zur Früherkennung von Anomalien und Längs-Follow-up. Nichtinvasive Ultraschall-Bildgebung ist eine ideale Methode für die Ermittlung und Erforschung der angeborenen Fehlbildungen und die Auswirkungen auf die Herzfunktion vor dem Tod ^4. Es ermöglicht die Früherkennung von Anomalien im Wohnzimmer Fötus und das Fortschreiten der Krankheit in utero mit Längsschnittstudien ^5,6 verfolgt werden kann.Bis vor kurzem Bildgebung des fetalen Mäuseherzen häufiger invasive Methoden. Der Fötus musste geopfert Magnetresonanz-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie durchführen oder chirurgisch zur Durchleuchtung Mikroskopie geliefert werden. Eine Anwendung von Hochfrequenz-Sonden mit herkömmlichen 2-D-und Puls-Doppler Imaging hat sich gezeigt, dass Messungen der Herzkontraktion und Herzfrequenz während der embryonalen Entwicklung bieten mit Datenbanken von normalen entwicklungsbedingten Veränderungen jetzt ^6-10. M-Modus-Bildgebung weitere wichtige funktionelle Daten, obwohl die ordnungsgemäße Abbildungsebenen sind oft schwierig zu erhalten. Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung des Fötus hat 2-D-Auflösung verbessert und kann ausgezeichnete Informationen über die frühe Entwicklung der kardialen Strukturen ^{11 zu schaffen.}

Protokoll

Ein. Vorbereiten Mice for Imaging

1. Vor dem bildgebenden Studie, betäuben den Damm (2-3% Isofluran) in der Ansaugkammer. Nehmen Sie das Tier aus der Ansaugkammer und sofort setzen die Schnauze in einem Nasenkonus mit dem Anästhesie-System. Entfernen Sie das Fell auf dem Mitte Brusthöhe an den unteren Gliedmaßen (siehe Abbildung 1) mit Haarschneidemaschinen. Entfernen Sie den restlichen Körper Haare mit Enthaarungscreme. Enthaarungscreme kann auch ohne Haarschneidemaschinen verwendet werden und sollten gründlich abgespült werden der Haut nach der Anwendung zu Reizungen zu verhindern.
2. Setzen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage auf einem Heizkissen mit eingebettetem EKG-Ableitungen, um die Körpertemperatur (Abbildung 1) zu halten. Elektroden-Gel auf den vier Pfoten und klebt sie auf die EKG-Elektroden.
3. Besorgen Sie sich ein steady-state Sedierung während des gesamten Verfahrens (1,0% bis 1,5% Isofluran mit 100% O ₂ gemischt). Das Niveau der Anästhesie kann angepasst werden maintain eine Herzfrequenz von 450 ± 50 Schläge pro Minute (bpm). Besondere Aufmerksamkeit sollte bezahlt Dosierung von Isofluran und Dauer der Sedierung auf weniger als eine Stunde zu minimieren.
4. Schieben Sie eine rektale Sonde (nach der Schmierung), um die Körpertemperatur über das Heizkissen zu überwachen. Es ist wichtig, um die Körpertemperatur in einem engen Bereich zu halten (37,0 ° C ± 0,5 ° C). Kontrollierte Betäubung und konstante Körpertemperatur ist wichtig für die hämodynamische Stabilität der Mutter und Föten.

Technische Überlegungen

Der Erwerb der fetalen Echokardiogramme kann eine Herausforderung sein. Daten aus diesen Studien erhalten können verwechselt aufgrund der Reaktion auf Stress sowohl von der Mutter und das ungeborene Kind. Idealerweise sollte die Temperatur gehalten Tieres unter Verwendung einer erhitzten Bildgebungsplattform, Zirkulieren Erwärmung Pad, Heizlampen oder autoregulierte Heizdecken werden. Zusätzlich wird routinemäßige Anwendung eines erwärmten akustischen Gels empfohlen. Alobwohl die vorherrschende Sorge über Regulierung der Körpertemperatur ist Hypothermie zu vermeiden, sollte die Entwicklung der Hyperthermie gleich Anliegen sein. Eine unkontrollierte Heizvorrichtung wie einem einfachen Heizkissen oder Gegenwart Nähe Halogenbeleuchtung kann bei schnellen und gefährliche Erhöhung der Körpertemperatur führt. Da wesentliche Körpertemperatur Schwankungen in beide Richtungen setzt das Tier in Gefahr, sollte jeder Versuch unternommen werden, um normale Körpertemperatur aufrecht zu erhalten.

Der Untersucher Erfassen der Bilder benötigt zu vermeiden, dass ein übermäßiger Druck auf den Hohlraum mit dem Wandler, da das Gewicht des Wandlers allein in veränderter Herzfunktion führen kann. Die Dauer der Bildaufnahme muss ebenfalls auf ein Minimum (idealerweise weniger als eine Stunde) gehalten werden, um die physiologischen und hämodynamischen Veränderungen durch verlängerte Sedierung reduzieren. Darüber hinaus müssen Zeitdauer und der Exposition gegenüber Isofluran für jede Studie zu einer minimu gehalten werdenm wegen der potenziellen teratogenen Effekte von Isofluran ^12.

2. Bezeichnung des Embryos

1. Bildgebung gestartet mit der Mutter Blase als Landmarke mit Feten an der linken und rechten Uterushörner als L1, 2,3, etc. (linke Seite) und R1, 2,3, etc. (rechte Seite) markiert (siehe Abbildung 1C). Notation des Fötus ist nützlich für den Abruf der Proben nach der Bebilderung.
2. Proben liegt zu tief in den Bauch werden gescannt, um ihre Anwesenheit zu dokumentieren, sind aber aus der Datenanalyse wegen der schlechten Auflösung ausgeschlossen. Die Fähigkeit zur benachbarten Embryonen scannen kann zu einem Tracking Föten (2A) zu helfen.
3. Scanebenen werden, indem die Ausrichtung der Maus mit Bezug auf die Abtastebene modifiziert. Die Bilder werden in zwei orthogonalen Ebenen für jeden Fötus (Abbildung 2) erhalten. Eine Anstrengung unternommen wird, um Ansichten Angleichung der Quer-, frontal oder Sagittalebene zu erhalten, sondern sanchmal auf schrägen Ebenen durch die Lage des Uterus im Abdomen begrenzt. Rotation des Abtastkopfes werden auch zur Modifikation der Orientierung erlauben, ohne den Damm.

Technische Überlegungen

Während handgehaltenen Betrieb der Sonde ist bei erwachsenen Maus Echokardiographie durchführbar Handbetrieb in fetalen Bildgebung nicht empfohlen. Identifizierung der Föten wird durch die variable Natur der uterinen Lage, Verwindung, und Bewegung kompliziert. Um Schwierigkeiten mit Fötus Körperregion zu minimieren, ist die Verwendung stationären Wandler (Abbildung 1) mit minimaler Bewegung über die horizontale Ebene des Dammes wesentlich.

3. Evaluation von Struktur und Funktion

1. Abtasten b-Mode-Bilder werden verwendet, um grundlegende kardiale Strukturen wie Atrien, Scheidewand, ventrikulären Kammern, und linke und rechte Ausflusstrakte (Abbildung 2) zu identifizieren.
2. M-mode-Bild,s ausgewählt sind aus der Kurzachsenansicht erhalten und werden verwendet, um eine ventrikuläre Wandstärke und Kammer Abmessungen (Abbildung 3) zu messen. Wenn die korrekte Ausrichtung ist nicht erreichbar aufgrund der fetalen liegen, können Messungen von b-Modus-Bilder verwendet werden, um% fraktionelle Verkürzung (FS) zu quantifizieren. Zeitliche Veränderungen zwischen LV End-systolischen Dimension (LVESD) und LV enddiastolische Abmessung (LVEDD) während des Herzzyklus sind für die Berechnung der Verkürzung Fraktion (FS) verwendet werden, wie folgt:
   % FS = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100
3. Die linken und rechten Ventrikels durch Abtasten vom Kopf zum Schwanz identifiziert. Linke und rechte Seiten sollten annotiert werden. Sichtbare Fließströme durch echogenen fetales Blut erzeugten erleichtert eine genaue Platzierung des Doppler Probenvolumen innerhalb des Mitralostiums. Die linksventrikuläre Anströmgeschwindigkeit aus den Mitralklappen im apikalen Vier-Kammer und LV langen Achse Ansichten (Abbildung 4, C) erhalten. Aorten-Abfluss-Messungen können verwendet werden, um SYSTO messenlic Ejektionszeit (Abbildung 4, D). Herzfrequenz kann aus der Messung einer Strömung Zyklus zum nachfolgenden Zyklus Strömung (Abb. 4, C, D) berechnet werden. Es ist darauf zu Blutfluss und die Doppler-Strahl auszurichten, um die Doppler-Winkels zu minimieren. Werte über einem Winkel von 60 Grad aufgenommen sind ungenau und sollte vermieden werden.
4. Scannen b-Modus-Bilder verwendet werden, um gemeinsame strukturelle angeborene Missbildungen wie Ventrikelseptumdefekten (Abbildung 5) zu identifizieren. Doppler Probenvolumens in den Kammern kann zur Strömung über die Ventrikelseptum identifizieren. Zusätzliche Parameter, die leicht überwacht werden, umfassen fetale Größe, Herzfrequenz, Strömungsgeschwindigkeiten, Perikarderguss und Hydrops fetalis. Die definitive Diagnose bestimmter Herzfehler erfordert zusätzliche Auswertung durch Sektion und Histopathologie.

Technische Überlegungen

Identifizierung von linken und rechten chamglieder kann in fötalen Herzbildgebung aufgrund der ähnlichen Abmessungen der ventrikulären Kammern während der Entwicklung schwierig. Eine Strategie besteht darin rechten und linken fötalen Orientierung in Echtzeit festzustellen, indem der bildgebenden Plattform in der horizontalen Ebene. Identifizierung der Schnauze, Gliedmaßen und der Wirbelsäule wird dazu beitragen, die let / Rechts-Ausrichtung des Fötus. Wenn möglich, wird Tracking des Ausflussrohrs Spur auf dem Bogen oder der Visualisierung des Haupt Bifurkation der Lungenarterie zur Identifizierung des linksventrikulären Ausflusstrakt oder rechts Ausflusstrakt jeweils ermöglichen. Für jeden Fötus untersucht wurde, ist es wichtig, die entschlossene Links-Rechts-Orientierung auf gespeicherte Bilder beachten.

Post-Imaging Tier Überwachung und Pflege

Nach Abschluss der Bildgebung, ist der Damm an den entsprechenden Gehäuse zurück und nach Norm institutionellen post-Verfahren Protokoll überwacht.Analgesie nach diesem bildgebenden Verfahren ist nicht erforderlich. Vollständige Wiederaufnahme der normalen Aktivität kann innerhalb von fünf Minuten gerechnet werden.

4. Repräsentative Ergebnisse der Echokardiographie

Die Entwicklung von Hochfrequenz-Sonden (über 8 MHz), haben kommerzielle echokardiographischen Ausrüstung gestattet, um eine axiale Auflösung von etwa 0,2 mm mit einer lateralen Auflösung von 0,3 mm aufweisen, wenn das Bild vergrößert und erworbenen in einer Tiefe von 1 cm. Die meisten der neu entwickelten Sensoren sind linear und haben den Vorteil der Vermeidung von Nahfeld Artefakte. Hochfrequenz (30-50 MHz) mechanische Sonden wurden kürzlich entwickelt, die ausreichend sind für das murine Brust und Herzfrequenz, wodurch eine axiale Auflösung von ungefähr 50 um in einer Tiefe von 5-12 mm. In jüngster Zeit haben diese hochfrequenten mechanischen Sonden Farb-Doppler-Funktionen hinzugefügt ermöglicht eine umfassende Beurteilung der ventrikulären und Klappenfunktion und Identifizierung von sJagd Läsionen in der fetalen Herzens. Die hier beschriebenen Verfahren sind auf einer VisualSonics Vevo 770 System ausgeführt und kann an fast allen äquivalenten Systemen angewendet werden. Übliche im Handel erhältlich Ultrahochfrequenz-Ultraschallsystem kann bei 40 Hz mit einer maximalen bildgebenden Tiefe von 7 bis 14 mm zu betreiben, mit bis zu 60 mm lateral und 50 bis 100 mm axiale Auflösung (Vevo770, VisualSonics, Inc.). Im Vergleich mit 60 Hz und 20 mm Bildtiefe, mit 50 bis 100 mm axial und 200 bis 500 mm laterale Auflösung mit der klinischen Acuson Sequoia Ultraschallsystem.

Aufgrund der geringen Größe des fetalen Mäuseherzens werden fetale Echokardiographie Studien an Mäusen technisch anspruchsvoll. Im Gegensatz Echokardiographie in erwachsenen Mäusen, muss der Untersucher verwenden nonconventional Ultraschall Ebenen, die durch den Fötus 'Körper Achsen definiert. Tortuosität der Gebärmutter beeinflusst auch die Orientierung des Fötus und müssen berücksichtigt werden. Zusätzlich Tiefe die inhärente Begrenzung Eindringen von Ultra-Hochfrequenz-Ultraschall kann es schwierig machen, image Alle Proben bei Schwangerschaften mit einer großen Anzahl von Föten.

Ein Ultraschall-Bildgebung Strategie ermöglicht Hochdurchsatz-Screening für angeborene Herz-Kreislauf-und extrakardialen Mängeln ^7. Jenseits der Studie von genetischen Veränderungen, kann diese Technik zum Screening auf Defekte in pharmakologischen und toxikologischen Untersuchungen verwendet werden. Diese Methodik kann auch als Führung Werkzeug für interventionelle Verfahren wie Injektionen oder Messung von ventrikulären Drücke ¹³ verwendet werden.

Die nicht-invasive Art der fetalen Ultraschall ist vorteilhaft, nicht nur weil es Herz-Kreislauf-Funktion unter physiologischen Bedingungen beurteilt werden können, sondern auch, weil damit kritische phänotypische Informationen in Echtzeit. Longitudinal Untersuchung von embryonalen Herzen, wenn technisch möglich, bleibt eine Herausforderung aus mehreren Gründen. Serielle Prüfung derselben Fötus und identification desselben Fötus an jeder Prüfung wird in der Abwesenheit von einer offensichtlichen strukturellen Defekt anspruchsvoll. Bewegung des Uterus und der Fötus kann völlig verändern die Ausrichtung der Probe und damit Längs-Tracking-und Follow-up-Messungen schwierig ^14.

Obwohl Echokardiographie ist eine leistungsstarke Technik für die Identifizierung von Herzrhythmusstörungen, erfordert die spezifische Diagnose von strukturellen Herzfehlern weitere detaillierte Phänotypisierung durch Sektion und Histopathologie ^15. Korrelation von Genotyp und einem bestimmten Fötus erfordert Ernten von Föten Hysterotomie, vorzugsweise unmittelbar nach einer Echo Studie und während der Damm noch anästhesiert, um Änderungen in der Orientierung und Embryo Lage minimieren.

Normale Werte für die Kammer Abmessungen und Funktion haben für die embryonale Mäuse und Nutzer dieser Technik berichtet wird empfohlen, die Angaben zu diesen Werten ^6-10 zitiert überprüfen. Beurteilungder Valvulärmetall Morphologie durch Bildauflösung beschränkt, jedoch ist ringförmigen Dimension Messungen und Geschwindigkeitsmessungen durch die großen Gefäße möglich sogar schon ED 9,5. Es ist darauf zu angemessenen Ausrichtung mit Blutströmung und dem Wandler ^{10, 16} zu erhalten.

Es sollte betont werden, dass die kardiale Abmessungen nach Mausstämme, Geschlecht und Alter variieren und schnell an verschiedenen embryonalen Zeitpunkten und Herzfrequenz verändern. Es ist wichtig zu überprüfen, dass Gruppen von Mäusen für diese Parameter abgestimmt sind. Fetal Bildgebung hängt vom Mausstamm als gut. Zum Beispiel kann der schwangeren CD-1 Damm routinemäßig enthält mehr Embryonen gegenüber dem C57/BL6 Stamm und damit schwieriger sein kann, um alle Proben zu visualisieren. Aus diesen Gründen des Alters zu nutzen und belasten gematchten Kontrollen für jedes Experiment sollte anstelle von Referenzwerten verwendet werden. Zusätzlich Messungen einzelner Parameter wie linksventrikuläre enddiastolische Abmessung und posteriorenWanddicke kann bei normalen Mäusen bis zu 25% ⁸ variieren.

Abbildung 1. Übersicht der Set-up mit VisualSonics Vevo 770-System. (A) VisualSonics integrierte Schienensystem mit physiologischen Überwachungseinheit. (B) Die Maus positioniert und richtig Zurückhaltung auf der Heizplatte. Die vier Schenkel sind in den EKG-Elektroden aufgezeichnet. (C) Schematische Darstellung der schwangeren Maus und das Layout Embryonen. Die Anzahl der Embryonen innerhalb jedes Uterushorn erheblich variieren kann zusätzlich zu der Ausrichtung des Fötus. (D) A positioniert Damm auf der Bildgebungsplattform mit Pfeilen unter Hinweis auf die Ebenen der Manipulation (X-Achse und Y-Achse) zu bewegen der Damm für die Bildgebung. Die Z-Achse bezieht sich auf die Bewegung des Wandlers und abwärts (in der durch den Pfeil in Panel B angegeben). B, Blase, L, links, R, right.

Abbildung 2. Vertreter b-Mode-Bilder. Diese Zahl enthält repräsentative b-Modus-Bilder von embryonalen Tag 14,5 Fötus. (A) Visualisierung von zwei benachbarten Föten. Boxen zeigen Lage des fetalen Herzens. (B) Anatomic Landmarken in einem Fötus zur Orientierung führen. Embryonale Tag 14,5 Herz in einem Vier-Kammer-Blick (C), kurz-Achse Blick auf die linken und rechten Ventrikel (D), rechts Ausflusstrakt und Lungenarterie (PA) (E) und linksventrikulärer Abfluss Takt (LVOT) und Aorta (F).

Abbildung 3. Vertreter Beurteilung der linksventrikulären Funktion. Diese Zahl enthält repräsentativeBilder der 2D Echokardiographie der langen Achse des Herzens während der embryonalen Tag 14,5 (A), und ein Vier-Kammer-Ansicht (B). (C) M-mode-Linien, die Verfolgung mit linken und rechten ventrikulären Innendurchmesser an der Diastole (R / LVIDd) und Systole (R / LVIDs) aus der Kammer vier Bildebene. Scheidewand (IVS) ist ebenfalls visualisiert.

Abbildung 4. Vertreter Doppler Einschätzung. Darin enthalten sind repräsentative Bilder von 2D-Echokardiographie von embryonalen Tag 14,5 Herzen in einer apikalen Vier-Kammer-Blick (A). Das linke Atrium und linken Ventrikel wurden skizziert. (B) Repräsentative Platzierung von Impuls-Doppler Probenvolumen zur Aufzeichnung von Mitral Zufluss. (C) Mitral Zufluss Doppler Mustern aus denen frühdiastolischen velocity (bezeichnet "E") und Vorhofkontraktion (bezeichnet "A") Geschwindigkeiten gemessen werden. (D) Repräsentative aortischen Dopplerfrequenzspektrum. Aorten Doppler-Jet kann zur Ausstoßzeit (ET) zu messen. Herzfrequenz (HR) kann aus der Messung aus einer Flow-Zyklus auf die folgenden Flow Zyklus berechnet werden. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 5. Repräsentative Detektion Ventrikelseptumdefekt. Diese Figur enthält repräsentative b-Modus-Bilder von embryonalen Tag 14,5 Herz in einem apikalen Vierkammerblick (A) mit den rechten und linken Herzkammer Hohlräume in (B) beschrieben. Beachten Sie die Anwesenheit der Scheidewand. (C) Transversalschnitt der abgebildeten Herz mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.(D) B-Modus-Bild von embryonalen Tag 14,5 Herzen mit einer ventrikulären sepal Defekt (VSD) durch den Pfeil angedeutet. (E) mit der rechten und linken Herzkammer Hohlräume mit überlagertem Platzierung von Pulse Doppler Probenvolumen sind für die Aufnahme der Strömung über die skizzierten Scheidewand. (F) Transversalschnitt mit Hämatoxylin und Eosin von abgebildeten Herzens nach Probestück-gefärbt. (G) das Absetzen von Pulse-Doppler Probenvolumen zur Aufnahme der Strömung überlagert über der Scheidewand. (H) Repräsentative Dopplerfrequenzspektrum aus (G) Demonstration Flow aus der linken zur rechten Ventrikels. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Diskussion

Die Fähigkeit zur seriellen Messungen durchzuführen und um mutierte Foeten mit Herzfehlern erkennen unterstreicht die Nützlichkeit der Echokardiographie zur Untersuchung normalen und abnormalen Herz-Kreislauf-Entwicklung. Analyse der kardialen Struktur und Funktion in vivo zu einem integralen Teil in der Beschreibung von genetischen und nicht-genetischen Modifikationen normale fetale Entwicklung. Die Verfügbarkeit von 2D-geführte Doppler macht es möglich, die Herzfrequenz und Blutströmungsmuster überwac...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 Imaging System	VisualSonics		(Toronto, Kanada)
RMV707B.15-45-MHz-Schallkopf
Tec 3 Isofluran Vaporizer
Isofluran (2-Chlor-2-(difluormethoxy) -1,1,1-Trifluor-ethan)