Ecocardiografia Fetal murino

Resumo

Morte fetal e perinatal é uma característica comum quando se estuda alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco. De alta freqüência ultra-sonografia tem melhorado 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o desenvolvimento cardíaco precoce e é um método ideal para detectar o impacto sobre a estrutura e função cardíaca antes da morte.

Resumo

Camundongos transgênicos apresentam anormalidades no desenvolvimento e função cardíaca representa uma poderosa ferramenta para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes tanto a função cardiovascular normal e base fisiopatológica da doença cardiovascular humano. Morte fetal e perinatal é uma característica comum ao estudo de alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco ^1-3. A fim de estudar o papel de alterações genéticas ou farmacológicas no desenvolvimento inicial da função cardíaca, a ultra-sonografia do feto vivo tornou-se uma importante ferramenta para a identificação precoce de anomalias e acompanhamento longitudinal. Ultra-sonografia é um método não invasivo ideal para detecção e estudo de malformações congênitas e do impacto sobre a função cardíaca antes da morte ^4. Ele permite o reconhecimento precoce de anomalias no feto vivo e a progressão da doença pode ser seguido no útero com estudos longitudinais ^5,6.Até recentemente, imagens de corações fetais de camundongos acometidos de métodos invasivos. O feto tinha que ser sacrificado para realizar microscopia de ressonância magnética e microscopia eletrônica ou cirurgicamente entregue para microscopia transiluminação. Uma aplicação de alta freqüência convencional sondas com 2-D e pulsado de onda Doppler foi mostrado para fornecer medições de contração cardíaca e freqüência cardíaca durante o desenvolvimento embrionário, com bases de dados de mudanças normais de desenvolvimento já disponíveis ^6-10. M-modo de imagem ainda fornece importantes dados funcionais, embora, os planos de imagem apropriados são muitas vezes difíceis de obter. De alta freqüência ultra-sonografia do feto melhorou 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o início do desenvolvimento das estruturas cardíacas ^11.

Protocolo

1. Preparando Ratos de Imaging

1. Antes do estudo de imagem, anestesiar a barragem (2-3% de isoflurano) na câmara de indução. Remover o animal a partir da câmara de indução e colocar imediatamente o focinho dentro de um cone de nariz ligado ao sistema de anestesia. Remover pêlos do peito nível médio e membros inferiores (ver Figura 1) com cortar cabelo. Remover o cabelo do corpo restante com creme depilatório. Creme depilatório também pode ser utilizado sem cortar cabelo, e deve ser cuidadosamente lavados para fora da pele depois da utilização para evitar a irritação.
2. Colocar o rato anestesiado numa posição supina sobre uma almofada de aquecimento com embutidos ECG a fim de manter a temperatura do corpo (Figura 1). Aplique o gel eletrodo para as quatro patas e fita-los para os eletrodos de ECG.
3. Se obter um nível de sedação em estado estacionário ao longo do procedimento (1,0% a 1,5% de isoflurano misturado com 100% de O _2). O nível de anestesia pode ser ajustado para mantenha uma freqüência cardíaca alvo de 450 ± 50 batimentos por minuto (bpm). Uma atenção cuidadosa deve ser dada a minimizar a dose de isoflurano e duração da sedação para menos de uma hora.
4. Suavemente inserir uma sonda rectal (depois de lubrificação) para monitorizar a temperatura do corpo por meio da almofada de aquecimento. É importante manter a temperatura do corpo dentro de um intervalo estreito (37,0 ° C ± 0,5 ° C). Controlled anestésico e a temperatura corporal constante é essencial para a estabilidade hemodinâmica da mãe e fetos.

Considerações Técnicas

A aquisição de ecocardiogramas fetais pode ser um desafio. Os dados obtidos a partir destes estudos pode confundidos devido à resposta ao stress, tanto a barragem e do feto. Idealmente, a temperatura do animal deve ser mantida usando uma plataforma de imagem aquecida, circulando almofada de aquecimento, aquecimento lâmpadas, ou cobertores de aquecimento autoregulado. Além disso, o uso rotineiro de um gel acústico aquecido é recomendada. Alembora a preocupação predominante em relação ao controle de temperatura do corpo é o de evitar a hipotermia, hipertermia do desenvolvimento deve ser de grande preocupação. Um aparelho de aquecimento não monitorizada como uma almofada de aquecimento simples, ou a presença de estreita proximidade com a iluminação de halogénio pode resultar em elevação rápido e perigoso da temperatura corporal. Desde flutuações substanciais de temperatura do corpo em qualquer direção coloca o animal em risco, todo esforço deve ser feito para manter a temperatura normal do corpo.

A aquisição das imagens sonographer precisa de forma a evitar o excesso de pressão sobre a cavidade com o transdutor, uma vez que o peso do transdutor só pode resultar na alteração da função cardíaca. A duração de aquisição de imagem deve também ser mantido a um mínimo (idealmente menos do que uma hora), a fim de reduzir as alterações fisiológicas e hemodinâmicas resultantes de sedação prolongada. Além disso, a duração do tempo e exposição ao isoflurano para cada estudo deve ser mantido a um minimum devido a potenciais efeitos teratogênicos de ¹² de isoflurano.

2. Identificação de Embriões

1. Imagem é iniciado usando bexiga da mãe como um marco, com fetos sobre os chifres esquerda e direita uterinos rotulados como L1, 2,3, et cetera (lado esquerdo) e R1, 2,3, et cetera (lado direito) (ver Figura 1C). Notação de localização feto é útil para a recuperação das amostras após a criação de imagens.
2. Espécimes situados muito profundo no abdômen são digitalizados para documentar sua presença, mas são excluídos da análise de dados por causa da baixa resolução. A capacidade de digitalizar embriões adjacentes podem ajudar em fetos de rastreamento (Figura 2A).
3. Planos de verificação são modificadas através da alteração da orientação do rato em relação ao plano de digitalização. As imagens são obtidas em dois planos ortogonais de cada feto (Figura 2). É feito um esforço para obter opiniões aproximam as transversais, planos frontal, ou sagital, mas sometimes está limitado a planos oblíquos pela posição do útero no abdómen. Rotação da cabeça de varredura irá também permitir a modificação da orientação sem mover a barragem.

Considerações Técnicas

Enquanto a operação de mão da sonda é viável em ecocardiografia rato adulto, não a operação de mão em imagens fetal em recomendado. Identificação de fetos é complicado devido à natureza variável de localização uterina, tortuosidade, e movimento. Para minimizar as dificuldades com localização feto, o uso do transdutor estacionária (Figura 1) com o mínimo movimento para além do plano horizontal da barragem é essencial.

3. Avaliação da Estrutura e Função

1. B digitalização modo de imagens são usados ​​para identificar estruturas básicas cardíacas, tais como átrios, septo interventricular, câmaras ventriculares, e vias de saída esquerdo e direito (Figura 2).
2. M-mode imagems são obtidos a partir do eixo curto e são usados ​​para medir a espessura da parede ventricular e dimensões da câmara (Figura 3). Se o alinhamento correcto não possam ser obtidas devido à mentira fetal, a partir de medições b imagens no modo pode ser usado para quantificar o encurtamento fraccional% (FS). Alterações temporais entre LV dimensão sistólica final (LVESD) ea dimensão diastólica final do VE (DDVE) durante todo o ciclo cardíaco são utilizados para o cálculo da percentagem de encurtamento (FS), como se segue:
   % FS = [(DDVE - LVESD) / DDVE] x 100
3. Os ventrículos esquerdo e direito são identificados por varredura da cabeça à cauda. Os lados esquerdo e direito deve ser anotada. Correntes de fluxo visíveis gerados pelo sangue fetal ecogénica facilita a colocação precisa do volume da amostra no interior do orifício de Doppler mitral. Velocidade de entrada do ventrículo esquerdo é obtido das válvulas mitral em apical quatro câmaras e vistas eixo LV longos (Figura 4, C). Medições de escoamento da aorta pode ser usado para medir sistotempo de ejecção lic (Figura 4, D). A frequência cardíaca pode ser calculada a partir da medição de um ciclo de fluxo para o fluxo de ciclo seguinte (Figura 4, C e D). Deve ser tomado cuidado para alinhar o fluxo de sangue e o feixe de Doppler para minimizar o ângulo Doppler. Os valores tomados para além de um ângulo de 60 graus são imprecisos e deve ser evitado.
4. B digitalização modo de imagens são usados ​​para identificar estruturais comuns anomalias congênitas, como defeitos do septo ventricular (Figura 5). Doppler volume da amostra dentro dos ventrículos pode ser usado para identificar o fluxo através do septo ventricular. Os parâmetros adicionais que são facilmente monitoradas incluem o tamanho do feto, batimentos cardíacos, velocidade de fluxo, efusões pericárdicas, hidropsia fetal. O diagnóstico definitivo de determinados defeitos cardíacos requer avaliação adicional por necropsia e histopatologia.

Considerações Técnicas

Identificação de cham esquerda e à direitabers pode ser difícil em imagem cardíaca fetal devido às dimensões similares de câmaras ventriculares durante o desenvolvimento. Uma estratégia é estabelecer direita e esquerda orientação fetal, em tempo real, movendo a plataforma de imagem no plano horizontal. Identificação de focinho, brotos de membros e coluna vai ajudar a identificar a orientação let / direito do feto. Se possível, seguindo a pista de escoamento do arco ou a visualização da bifurcação principal da artéria pulmonar permitirá a identificação da via de saída ou da via de saída direita, respectivamente. Para cada feto estudado, é importante notar a orientação da esquerda para a direita em determinado imagens guardadas.

Pós-imagem de Monitoramento Animal e Cuidados

Após a realização de imagem, a barragem é retornado para a caixa apropriada e controlada de acordo com o protocolo padrão da pós-procedimento institucional.Analgesia após este procedimento de imagem não é necessária. Retomada completa da actividade normal, podem ser antecipadas em cinco minutos.

4. Resultados representativos de Ecocardiografia Fetal

O desenvolvimento de sondas de alta frequência (acima de 8 MHz), permitiram equipamento ecocardiográfico comercial para ter uma resolução axial de aproximadamente 0,2 mm, com uma resolução lateral de 0,3 mm, quando a imagem é ampliada e adquirida a uma profundidade de 1 cm. A maior parte dos transdutores desenvolvidos recentemente são lineares, que têm a vantagem de evitar artefactos de campo próximo. De alta frequência (30-50 MHz) sondas mecânicas que foram recentemente desenvolvidos, que são adequados para o peito de murino e do ritmo cardíaco, o que permite uma resolução axial de cerca de 50 um, a uma profundidade de 5-12 mm. Mais recentemente, essas sondas mecânicas de alta freqüência adicionaram potencialidades Doppler colorido permitindo uma avaliação completa da função ventricular e valvar e identificação de scaça lesões no coração fetal. Os métodos descritos aqui são realizados num sistema de VisualSonics Vevo 770 e pode ser aplicado a quase todos os sistemas equivalentes. Corrente comercialmente disponível de ultra-alta frequência do sistema de ultra-som pode operar a 40 Hz com uma profundidade máxima de imagem, de 7 a 14 mm, com até 60 mm lateral e 50 a 100 mm resolução axial (Vevo770, VisualSonics, Inc.). Isto compara com 60 Hz e 20 profundidade de imagem mm, com 50 a 100 mm axial e 200 a resolução de 500 mm lateral com o sistema de ultra-clínica Acuson Sequoia.

Dado o pequeno tamanho do coração do rato fetal, os estudos em ecocardiografia fetal em ratos são tecnicamente desafiante. Ao contrário de ecocardiografia em ratos adultos, o ultra-sonografista deve usar aviões não-convencionais de imagem de ultra-som definidos por eixos do feto do corpo. Tortuosidade do útero também afecta a orientação do feto e deve ser tomado em consideração. Além disso, a profundidade da penetração da limitação inerente de ultrum ultra-som de alta frequência pode tornar difícil a imagem de todos os espécimes em gravidezes com um grande número de fetos.

Uma estratégia de imagem de ultra-som permite uma seleção de alto rendimento para defeitos congênitos cardiovasculares e extracardíaca ^7. Além do estudo de alterações genéticas, esta técnica pode ser usada para triagem de defeitos em estudos farmacológicos e toxicológicos. Esta metodologia pode também ser utilizada como um instrumento de orientação para procedimentos de intervenção, tais como injecções ou de medição das pressões ventriculares ^13.

A natureza não invasiva do ultrassom fetal é vantajosa, não só porque ela permite que a função cardiovascular para ser avaliado sob condições fisiológicas, mas também porque esta fornece informações fenotípica essencial em tempo real. Exame longitudinal de corações embrionárias, embora tecnicamente possível, ainda é um desafio por diversas razões. Exame de série do mesmo feto e identification do feto mesmo em cada exame é um desafio, na ausência de um defeito evidente estrutural. Movimento do útero e do feto pode mudar completamente a orientação da amostra e, assim, fazer acompanhamento longitudinal e de acompanhamento, medições difíceis ^14.

Embora a ecocardiografia é uma técnica poderosa para a identificação de anormalidades cardíacas, o diagnóstico específico de defeitos estruturais do coração requer fenotipagem detalhada por necropsia e histopatologia ^15. Correlação do genótipo e um feto específico requer fetos de colheita por histerotomia, de preferência imediatamente depois de um estudo de eco e enquanto a barragem é ainda anestesiados para minimizar as alterações de orientação e localização do embrião.

Os valores normais para dimensões da câmara e da função têm sido relatados para camundongos embrionárias e usuários desta técnica são aconselhados a rever as referências citadas para estes ^6-10 valores. Avaliaçãoda morfologia valvar é limitada pela resolução da imagem, no entanto, medidas de dimensão anulares e medições de velocidade através dos grandes vasos é viável, mesmo tão cedo quanto ED 9.5. Deve ser tomado cuidado para se obter o alinhamento adequado com o fluxo de sangue e o transdutor ^{10, 16.}

Deve ser enfatizado que as dimensões cardíacas variam de acordo com ratos cepas de gênero e idade, e mudar rapidamente em diferentes pontos do tempo embrionárias e os batimentos cardíacos. É importante verificar que os grupos de ratinhos são comparadas para estes parâmetros. Imagem fetal varia de acordo com tensão mouse também. Por exemplo, a grávida CD-1 barragem rotineiramente contém mais embriões em comparação com a estirpe C57/BL6 e, assim, podem ser mais difíceis de visualizar todas as amostras. Por estas razões, o uso de idade e estirpe controles pareados para cada ensaio, devem ser usados ​​em vez de valores de referência. Além disso, as medições dos parâmetros individuais, como a do ventrículo esquerdo dimensão diastólica final e posteriora espessura da parede pode variar em ratos normais até 25% ^8.

Figura 1. Visão de set-up usando VisualSonics Vevo sistema 770. (A) VisualSonics sistema ferroviário integrado com a unidade de monitorização fisiológica. (B) O mouse é posicionado corretamente e contenção na placa de aquecimento. Os quatro membros são gravadas para os eletrodos de ECG. (C) Esquema de rato grávidas e layout de embriões. O número de embriões em cada trompa do útero pode variar significativamente, para além da orientação do feto. (D) Uma barragem posicionado na plataforma de imagem com setas assinalando os planos de manipulação (eixo X e do eixo Y) para mover a barragem para geração de imagens. O eixo Z refere-se ao movimento do transdutor para cima e para baixo (como indicado pela seta no painel B). B, bexiga, L, para a esquerda, R, right.

Figura 2. B representativos do modo de imagens. Esta figura contém representativas b imagens no modo de embrionário feto 14,5 dias. (A) Visualização de dois fetos vizinhos. Caixas de indicar a localização do coração fetal. (B) marcos anatômicos em um feto para guiar a orientação. Embrionário 14,5 dias coração em uma visão de quatro câmaras (C), visão de curto eixo dos ventrículos esquerdo e direito (D), via de saída do ventrículo direito e artéria pulmonar (AP) (E), eo tato saída do ventrículo esquerdo (VSVE) e aorta (F).

Figura 3. Avaliação representativa da função ventricular. Esta figura contém representanteimagens de ecocardiografia 2D da vista do eixo longo do coração no dia embrionário 14,5 (A), e uma vista de quatro câmaras (B). (C) M-mode o rastreio com linhas que indicam diâmetro ventricular esquerdo e direito interno a diástole (R / LVIDd) e a sístole (R / LVIDs) a partir do plano de imagem de quatro câmaras. Septo interventricular (SIV) também é visualizado.

Figura 4. Representante Doppler. Esta figura contém as imagens representativas de ecocardiografia 2D do coração embrionário 14,5 dias, numa vista de quatro câmaras apical (A). O átrio esquerdo e cavidade ventricular esquerda foram delineadas. (B) colocação Representante do pulso volume de amostra Doppler para a gravação do fluxo mitral. (C) os padrões de fluxo transvalvar mitral Doppler a partir do qual velocit diastólica precocey (denotadas "E") e contração atrial (denotadas "A") velocidades pode ser medido. (D) representativas da aorta Doppler de onda. Aórtica Doppler jacto pode ser utilizado para medir o tempo de ejecção (ET). A frequência cardíaca (FC), pode ser calculada a partir da medição de um ciclo de fluxo para o fluxo de ciclo seguinte. para ver figura maior .

Figura 5. Representante da detecção de defeitos do septo ventricular. Esta figura contém representativas b modo de imagens de coração embrionário 14,5 dias em um apical quatro câmaras (A), com cavidades ventriculares direita e esquerda descritas em (B). Note a presença do septo interventricular. (C) seção transversal do coração com imagens coradas com hematoxilina e eosina.(D) a imagem modo B do coração embrionário 14,5 dias com um defeito ventricular sépala (VSD) indicado pela seta. (E) cavidades ventriculares direita e esquerda são descritas com a colocação sobreposta de pulso volume de amostra Doppler para a gravação do fluxo através do septo interventricular. (F) seção transversal corado com hematoxilina e eosina com imagens de coração após a recuperação da amostra. (G) Sobreposto colocação de pulso volume de amostra Doppler para a gravação do fluxo através do septo interventricular. (H) Representante Doppler traçado a partir de (G) demonstrando fluxo da esquerda para o ventrículo direito. Clique aqui para ver maior figura .

Discussão

A capacidade de realizar medições em série e para detectar fetos com defeitos cardíacos mutantes destaca a utilidade do ecocardiograma para investigar normal e anormal desenvolvimento cardiovascular. Análise da estrutura e função cardíaca in vivo tornou-se parte integrante na descrição de modificações genéticas e não genéticas para o desenvolvimento fetal normal. A disponibilidade de 2D-guiada Doppler torna possível monitorizar a frequência cardíaca e padrões de fluxo de sangue, enquanto a ob...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 Imaging System	VisualSonics		(Toronto, Canadá)
RMV707B.15 transdutor de 45 MHz
Tec Vaporizador 3 isoflurano
Isoflurano (2-cloro-2-(dif luorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano)