Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Zusammenfassung

Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.

Zusammenfassung

Inneren Organen wie Herz, Gehirn und Darm entwickeln Links-Rechts-(LR) Asymmetrien, die kritisch für ihre normale Funktion ¹ sind. Motile Zilien sind bei der Festlegung LR Asymmetrie in Wirbeltierembryonen, einschließlich Maus, Frosch und Zebrafisch ^2-6 beteiligt. Diese "LR Zilien, Generate asymmetrischen Fluidströmung, die erforderlich sind, um eine konservierte asymmetrischen Nodal (TGF-β-Superfamilie) Signalkaskade in der linken Seitenplatte Mesoderm, die vermutlich LR Strukturieren Informationen zum Entwickeln Organen ⁷ bereitzustellen wird auslösen soll. Somit, um Mechanismen LR Strukturieren zu verstehen, ist es wichtig, Gene, die die Organisation des LR Flimmerzellen, die Motilität und die Länge von LR Zilien und ihrer Fähigkeit, stabile asymmetrische Strömung erzeugen regulieren identifizieren.

In der Zebrafisch-Embryos werden LR Flimmerhärchen in Kupffer-Vesikel (KV) ^2,4,5 entfernt. KV ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen umfaßt monociliateddass ein mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum umschließen. Schicksal Mapping hat gezeigt, dass KV aus einer Gruppe von ~ 20-30 Zellen als dorsalen Vorläuferzellen (DFCs), die an der dorsalen Rand Blastoderm wandern während epiboly Stufen ^8,9 bekannt abgeleitet ist. Während der frühen Somiten Stufen, um DFCs Cluster und differenzieren sich in Flimmerepithelzellen KV in der Schwanzknospe des Embryos ^10,11 bilden. Die Fähigkeit, zu identifizieren und zu verfolgen DFCs-in Kombination mit optischen Transparenz und rasche Entwicklung des Zebrafisch-Embryos-make Zebrafisch KV ein hervorragendes Modell System LR Flimmerzellen studieren.

Interessanterweise behalten Vorläuferzellen des DFC / KV Zellstammbaums cytoplasmatischen Brücken zwischen dem Eigelb Zelle bis zu 4 Stunden nach der Befruchtung (HPF), während zytoplasmatische Brücken zwischen dem Eigelb Zelle und andere embryonalen Zellen schließen nach 2 hpf ^8. Unter Ausnutzung dieser zytoplasmatischen Brücken, entwickelten wir ein Stadium-spezifische Injektion Strategie Morpholino Oligonucleotide liefernotides (MO) ausschließlich DFCs und Knockdown die Funktion eines gerichteten Gens in diesen Zellen ^12. Diese Technik schafft chimären Embryos in dem Genfunktion in dem DFC / KV Linie entwickeln im Kontext eines Wildtyp-Embryos wird geklopft. Um asymmetrische Strömung in KV analysieren, injizieren wir fluoreszierenden Mikrokügelchen in den KV Lumen und aufzeichnen bead Bewegung mit Videomikroskopie ^2. Fluidströmung einfach visualisiert und können durch die Verfolgung bead Verschiebung im Laufe der Zeit quantifiziert werden.

Hier mit dem stufenspezifischen DFC-Zielgens Knockdown Technik und Injektion von fluoreszierenden Mikrokugeln in KV zu fließen visualisieren stellen wir ein Protokoll, das einen effektiven Ansatz, um die Rolle eines bestimmten Gens während KV Entwicklung und Funktion charakterisieren bereitstellt.

Protokoll

Übersicht der Stage-Specific Zebrafisch Embryo Injections

Antisense Oligonukleotide Morpholino (MO), die zu einer gezielten mRNA binden und stören Proteinexpression von diesem Transkript, sind weit verbreitet in Knockdown Gen verwendet (Loss-of-function) Studien im Zebrafisch ^13,14. Gene Tools, LLC bietet MOs, die entweder mit Carboxyfluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Lissamin (emittiert rote Fluoreszenz) getaggt sind, MO in injizierten Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie zu erkennen. Durch Einspritzen von MO in den Dotter Zelle in verschiedenen Stadien des Zebrafisches Entwicklung ist es möglich, die MO nach bestimmten Kompartimenten des Embryos (1A-F) zu liefern. MO in den Dotter zwischen den Zellstadien 1-4 (0-1 hpf) tritt alle embryonalen Zellen (1A, D, D ') über die Anschlüsse, die mit dem Eigelb, bis das 32-Zellen-Stadium ¹⁵ globalen Knockdown erleichtern fortbestehen injiziert. MO injiziert in den Dotter in midblastula Stufen (2.5-3 hpf) können die Vorfahren der DFCs (1B, E, E ') wahrscheinlich durch cytoplasmatische Brücken ⁸ und knockdown Genfunktion speziell in der DFC / KV Zelllinie ^12, ohne Eingabe meisten anderen embryonalen Zelllinien geben . Als wichtige Kontrollfunktion zu testen, ob Genfunktion in DFC / KV oder auch im Eigelb ^12,16 erforderlich ist, ist es auch möglich, MO nach dem Eigelb-Zelle zu beschränken durch Einspritzen zwischen den kuppelartigen 30% epiboly Stufen (~ 4,5 hpf) nach alle zytoplasmatische Brücken geschlossen (1C, F, F '). Diese Injektionen wurden in Kombination verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen ^17-24 analysieren. Um den Fluidstrom in KV beurteilen, werden fluoreszierenden Mikrokugeln in das Lumen zwischen den KV 6-10 somite Stufen (12-14 hpf) abgebildet und dann sofort mit Videomikroskopie (Abbildungen 1G-J). Eingespritzt Mikroperlen sind verfügbar, rot oder grün emittieren Fluoreszenz (oder beides), so ist es möglich, unterschiedliche verwendenKanäle Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen und MO.

Ein. Stage-spezifische Injektion von Morpholinos (MO)

Die Injektion von MO in Zebrafisch-Embryonen wurde zuvor ^25,26 demonstriert. Hier beschreiben wir kurz stage-spezifische MO-Injektionen. Nach aller Injektionen, werden Embryonen in eine Petrischale überführt und bei 28,5 ° C.

1. Globale MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und laden Sie sie in einer Injektion Platte. Legen fluoreszierende MO in eine Kapillare Nadel und montieren Sie die Nadel auf einer Mikroinjektor (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor). Brechen die Nadelspitze und justieren Injektionseinstellungen (Druck und / oder Zeit), um eine Injektion Tropfen, der ein Volumen von 1 nl beschriebenen ^25,26 weist erstellen. Verwenden eines Sezieren Stereomikroskop injizieren 1 nl von MO in den Dotter (1A) von ≥ 50 Embryonen pro Versuch. Arbeiten Sie schnell zu Injektionen mit dem 4-Zellen stag abzuschließenE.
2. DFC-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und bei 28,5 ° C inkubieren Wenn die Embryonen haben die 256-Zell-Stadium (~ 2,5 hpf) erreicht, schnell laden Sie sie in einer Injektion Platte und dann spritzen 1 nl von fluoreszierenden MO in den Dotter von ≥ 100 Embryonen zwischen den 256-Zell-und 1.000-Zell-Stadium (Abbildung 1B).
3. Yolk-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und inkubieren bei 28,5 ° C. Auf die Kuppel Stufe (~ 4 hpf), laden die Embryonen in eine Einspritzplatte und dann einzuspritzen 1 nl fluoreszierender MO im Eigelb von ≥ 100 Embryonen zwischen der Kuppel und 30% epiboly Stufen (Abbildung 1C).

2. Auswahl injizierten Embryonen für die Analyse

1. Wenn MO Embryonen erreichen die 75%-epiboly Stufe (8 hpf) eingespritzt wird, zu entfernen und tote unbefruchteten Eizellen und dann Bildschirm lebenden Embryonen unter Fluoreszenz Präpariermikroskop zur Verteilung der fluoreszierenden MO. Dann allow gewählt Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C.
   1. Für globale MO-Injektionen, wählen Embryonen, die Fluoreszenz gleichmäßig in in allen embryonalen Zellen (Abbildung 1D; 2A) verteilt.
   2. Für gezielte DFC-MO Injektionen, auszuwählen, in denen Embryonen fluoreszierende MO gesamten Dotter diffundiert ist und scheint an der dorsalen Blastoderm Marge (DFCs) (1E; 2B) eingeengt. In dieser Phase kann es schwierig sein, fluoreszierenden DFCs durch helle Fluoreszenz in der darunterliegenden Dotter visualisieren. Achten Sie darauf, Embryonen, in denen das fluoreszierende MO in embryonale Zellen außer DFCs eingebaut wurde oder bleibt aggregiert an der Injektionsstelle (Abbildung 2D) auszuschließen.
   3. Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, in denen MO Fluoreszenz gleichmäßig über das Eigelb verteilt wird und nicht in einem embryonalen Zellen (1F, 2C) beobachtet. Wiederum entfernen Embryonen in der die fluoreszierende MO bleibtaggregiert an der Injektionsstelle.
2. Zwischen den 2-4-somite Stufen (~ 11 hpf), Embryonen Bildschirm ein zweites Mal unter einem Fluoreszenzmikroskop mit stärkerer Vergrößerung. Dann lassen ausgewählten Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C.
   1. Für globale MO Injektionen, sicherzustellen ausgewählten Embryonen MO Fluoreszenz gleichmäßig in KV und alle embryonalen Zellen (1D '; Abbildung 2E) verteilt.
   2. Für DFC-gezielte MO Injektionen, sorgfältig auszuwählen Embryonen, MO Fluoreszenz nur in KV-Zellen und das Eigelb (1E) haben. Transgenen Embryos, die Ausdruck GFP in KV Zellen wie Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, bei der Identifizierung von Embryonen in der MO erfolgreich an KV Zellen (2F) geliefert unterstützen kann. Verwerfen von Embryonen mit MO Fluoreszenz in embryonalen Zellen anderen, dass KV-Zellen.
   3. Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, die MO-Fluoreszenz haben ausschließlich im Eigelb (1F ': Abbildung2G).

3. Montage Embryonen Fluid Flow in KV Analysieren

1. Um asymmetrische Strömung in KV der globalen MO analysieren, MO oder Eigelb-gezielte MO injizierten Embryonen DFC-gezielte, sorgfältig dechorionate ~ 20 Embryonen zwischen 4-6 Somiten Stufen (~ 11-12 hpf) mit scharfen Pinzette.
2. Planen 50 ml 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und Aliquot in 5 ml Röhrchen als Flüssigkeit in einem trockenen Bad bei 42 ° C gehalten werden
3. Übertragen eines Embryos zu einem Glas Depressionen slide (United Scientific Supplies, Inc.) und entfernen Sie so viel wie möglich am Wasser. Immobilisierung des Embryos, indem genügend warme 1% niedrig schmelzende Agarose gerade bedeckt den Embryo (zu viel Agarose mit anschließender Bildgebung stören). Wie die Agarose erstarrt, verwenden Pinzette, um den Embryo einer solchen Position, dass KV nach oben (dorsal) (Abbildung 1H). Montieren 10 Embryonen mit einem Embryo pro Folie. Arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass alle Injektionen in den nächsten Schritt komplETED vom 10 Somiten-Stadium (14 hpf).

4. Die Injektion von Fluorescent Microbeads in KV

1. Verdünnte Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 Mikron Durchmesser Mikrokugeln (Polysciences, Inc.) bis 1:50 in sterilem Wasser in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
2. Mischen Sie die 1:50-Verdünnung von Mikroperlen gründlich durch Antippen des Röhrchens und laden 3 ul in eine Kapillare Nadel. Mit der gleichen Mikroinjektor für MO-Injektionen (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor) verwendet, brechen die Nadelspitze mit einer Pinzette und passen Sie die Injektion Einstellungen, um die kleinstmögliche (<0,5 nl) Injektion Tropfen zu erzeugen.
3. Unter einem Binokular, richten Sie die Nadel mit der KV Lumen der ersten montiert Embryo. Führen Sie die Nadel in das Lumen und injizieren ein kleines Volumen (<0,5 nl) von Perlen (1G). Eine kleine Nadelspitze und kleinen Injektionsvolumen sind entscheidend, um eine Beschädigung KV vermeiden.
4. Inject alle gemounteten Embryonen. Sobald ein Embryo war injected, ein Tropfen von sterilem Wasser kann auf der Oberseite der Agarose gegeben werden, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Im Verlauf der Injektionen, werden die Kügelchen oft behindern die Nadelöffnung. Das erfordert ein Brechen der Nadelspitze und Einstellen der Einspritzvolumen durch Modulieren des Drucks oder Zeiteinstellung des Mikroinjektionsvorrichtung. Ersetzen Sie die Nadel, wenn es stumpf genug, um erhebliche Schäden während der Injektion verursacht wird.
5. Bildschirm die injizierten Embryonen für die erfolgreiche Durchführung der Perlen unter einer aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop (zB Zeiss AxioImager M1) mit einem 20x-Objektiv. Erstens, festzustellen, ob KV intakt mit Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 1J) ist, und verwenden Sie dann Fluoreszenz, um die Perlen zu beobachten. Wählen Embryonen, in denen Perlen vorhanden sind und sich innerhalb des KV Lumen. Verwerfen von Embryonen mit KV Schäden oder ohne schwimmende Perlen in KV. Es ist leicht zu KV verpassen und liefern Perlen umliegendes Gewebe oder der zugrunde liegenden Eigelb. Wenn erfolglos, mount anoweitere 10 Embryonen und wiederholen Sie die Injektion.

5. Visualisierung und Analyse von KV Strömungstechnik

1. Für jeden ausgewählten Embryos mit Perlen im Inneren KV, einen Tropfen von sterilem Wasser, um die Agarose zu decken und dann beobachten, KV unter dem aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop unter Verwendung eines 63X Wasser Eintauchen Ziel (Abbildung 1I). Alternativ kann ein Deckglas für die Verwendung mit Wasser nicht Eintauchen Ziele und / oder inverse Mikroskope aufgebracht werden.
2. Verwenden Sie ein High-Speed-Kamera auf dem Mikroskop montiert (z. B. Zeiss AxioCamHSm), um eine 10 sec Film aufzuzeichnen. Notieren Sie sowohl die Perlen mit dem fluoreszierenden Kanal (ca. 70 Bilder / s) und die KV Lumen mit einer Hellfeld-oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Kanal.
3. Um alle bead Bewegungen im Laufe der Zeit zu visualisieren, importieren Sie den Film von fluoreszierenden Kügelchen in ImageJ-Software (kostenloser Download unter http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) einend eine maximale Projektion aller Fluoreszenzsignale im Film. Um die maximale Projektion in ImageJ durchzuführen, klicken Sie auf "Bild → Stacks → Z-Projekt." In der "Z-Projekt" Fenster Projekt Scheiben mit Projektionsfläche Art von "Max Intensität". Dieses Bild kann auf einem Bild des DIC KV in denen die Perlen abgebildet (3A-B) wurden übereinandergelegt werden.
4. Die Bewegungen der einzelnen Perlen, können sie mithilfe ImageJ werden. Ein Plugin ("Manual Tracking") kann heruntergeladen werden unter http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Öffnen Sie das fluoreszierende Kügelchen Film in ImageJ und führen Sie das manuelle Tracking-Funktion. In dem Fenster der manuellen Tracking, zu überprüfen "show parameters" und Eingabeparameter für "Zeitintervalle" und "x / y-Kalibrierung". Manuell auswählen Perlen, die in der Brennebene des Films für ≥ 50 Frames bleiben und dann zu verfolgen ≥ 5 Perlen pro Embryo. Der Weg und die Geschwindigkeit eines jeden Wulstes durch th erzeugtene Software (Abbildungen 3 CD).

Ergebnisse

Stufenspezifischen MO Injektionen stellen einen nützlichen Ansatz Genfunktion in bestimmten Kompartimenten des Embryos zu analysieren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Injektion Strategien verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen und wie zu testen, um fluoreszierende Beads einzuführen, um den Fluidstrom zu visualisieren in KV. Die Verteilung der fluoreszierenden MO in erfolgreichen stufenspezifischen injizierten Embryonen ist schematisch in den 1D-F ...

Diskussion

Mit stage-spezifischen Injektionen MO dem DFC / KV Zelllinie Ziel ist ein nützlicher Ansatz zur Zell-Autonomie der Genfunktion zu studieren und zu vermeiden pleiotrope Phänotypen verursacht durch die globale Gen knockdown. Allerdings können diese Injektionen technisch anspruchsvoll. Injektion von MO zwischen den 256-Zelle und 1000-Zellen-Stufen können in drei möglichen Ergebnissen führen: 1) die MO bleibt aggregiert an der Injektionsstelle, 2) die MO diffundiert während des Eigelbs und tritt DFC / KV Zellen oder ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer
Standard Control Oligo-Lissamine getaggt	Gene Tools, LLC
Benutzerdefinierte Rock2b Morpholino Oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 Mikron Microspheres	Polysciences, Inc.	24054