Análise da função do gene e Visualização de Cilia-Generated fluxo de fluidos em vesículas de Kupffer

Resumo

Cílios gerado o fluxo de fluido na vesícula de Kupffer (KV) controla esquerda-direita padronização do embrião do peixe-zebra. Aqui, nós descrevemos uma técnica para modular a função do gene especificamente em células KV. Além disso, vamos mostrar como entregar partículas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo de fluido.

Resumo

Órgãos internos como o coração, cérebro, intestino e desenvolver esquerda-direita (LR) assimetrias que são críticos para suas funções normais ^1. Cílios móveis estão envolvidos no estabelecimento LR assimetria em embriões de vertebrados, incluindo rato, sapo, e zebrafish ^2-6. Estes 'LR' cílios gerar fluxo de fluido assimétrica que é necessária para desencadear uma conservada assimétrica Nodal (TGF-β superfamília) cascata de sinalização na mesoderme da placa lateral esquerda, que é pensado para proporcionar informação LR padronização para o desenvolvimento de órgãos ^7. Assim, para compreender os mecanismos subjacentes à padronização LR, é essencial identificar os genes que regulam a organização das células ciliadas LR, a motilidade e tempo de LR cílios e a sua capacidade de gerar um fluxo assimétrico robusto.

No embrião do peixe-zebra, cílios LR estão localizados na vesícula de Kupffer (KV) ^2,4,5. KV é composta de uma única camada de células epiteliais monociliatedque encerram um lúmen cheias de líquido. Mapeamento de destino tem mostrado que KV é derivado a partir de um grupo de ~ 20-30 células conhecidas como células de precursor dorsal (DFC) que migram para a margem dorsal blastoderme, durante os estágios epiboly ^8,9. Durante as fases iniciais somito, DFC cluster e diferenciam-se em células epiteliais ciliadas, para formar KV no tailbud do embrião ^10,11. A capacidade de identificar e rastrear DFC em combinação com transparência óptica e rápido desenvolvimento do peixe-zebra-embrião zebrafish KV fazer um sistema excelente modelo para estudar as células ciliadas LR.

Curiosamente, os progenitores da linhagem de células DFC / KV reter pontes citoplasmáticas entre a célula de gema até 4 horas pós-fertilização (hpf), enquanto pontes entre o citoplasma de células de gema e de outras células embrionárias perto após 2 hpf ^8. Aproveitando essas pontes citoplasmáticas, desenvolvemos uma estratégia de injeção de estágio específico para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente para SFD e knockdown da função de um gene alvo nestes ¹² células. Esta técnica cria embriões quiméricos em que a função do gene é derrubados na linhagem DFC / KV desenvolvimento no contexto de um embrião de tipo selvagem. Para analisar o fluxo de fluido assimétrica na KV, injetamos microesferas fluorescentes para o lúmen KV e movimento recorde talão usando videomicroscopia ^2. O fluxo do fluido é facilmente visualizado e pode ser quantificado seguindo o deslocamento do grânulo ao longo do tempo.

Aqui, o uso da fase específica DFC segmentada técnica knockdown do gene e a injecção de microesferas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo, apresenta um protocolo que proporciona uma abordagem eficaz para caracterizar o papel de um gene específico durante o desenvolvimento e função KV.

Protocolo

Visão de Estágio Específicos Injeções Embrião Zebrafish

Os oligonucleótidos anti-morfolino (MO), os quais se ligam a um ARNm alvo e interromper a expressão de proteína a partir dessa transcrição, são amplamente utilizados no gene knockdown (perda de função) Estudos em peixes-zebra ^13,14. Ferramentas de genes, LLC oferece MOs que são marcados com um carboxifluoresceína (emite fluorescência verde) ou lissamina (emite fluorescência vermelha) para detectar MO em embriões injetados usando microscopia de fluorescência. Por injecção de MO na célula gema em diferentes estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, é possível entregar o MO para compartimentos específicos do embrião (Figuras 1A-F). MO injectado na gema entre os estágios de células 1-4 (0-1 hpf) entra todas as células embrionárias (Figuras 1A, D, D '), através de ligações com a gema que persistem até que a fase de 32 de células ¹⁵ para facilitar o knockdown global. MO injectado na gema durante midblastfases ula (2,5-3 hpf) pode introduzir os progenitores das DFC (Figuras 1B, E, E ') provavelmente através de pontes citoplasmáticas ⁸ e função do gene knockdown especificamente na linhagem celular DFC / KV ^12, sem introduzir mais outras linhagens de células embrionárias . Como um controlo importante para testar se a função do gene é requerido em DFC / KV ou também na gema ^12,16, também é possível restringir o MO para a célula por injecção de gema entre as fases epiboly de cúpula de 30% (~ 4,5 hpf) depois todas as pontes citoplasmáticas ter fechado (Figuras 1C, F, F '). Estas injecções foram utilizados em combinação para analisar a função do gene na DFC / KV células ^17-24. Para avaliar o fluxo de fluido em KV, microesferas fluorescentes são injectados para dentro do lúmen KV entre as etapas 6-10 somito (12-14 hpf) e, em seguida, imediatamente fotografada usando videomicroscopia (Figuras 1G-J). Microesferas estão disponíveis, que emitem fluorescência vermelha ou verde (ou ambas), de modo que é possível a utilização de diferentescanais para imagem fluorescente micro e MO.

1. Fase específica de injeção de morpholinos (MO)

Injecção de MO em embriões de peixe-zebra foi demonstrado anteriormente ^25,26. Aqui, descrevemos brevemente injeções de estágio específicas MO. Seguindo todas as injecções, os embriões são transferidos para uma placa de Petri e incubou-se a 28,5 ° C.

1. Injeção MO Global: Coletar embriões logo após a fertilização e carregá-los em uma placa de injeção. Carregar MO fluorescente em uma agulha capilar e montar a agulha para um microinjector (por exemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector). Quebrar a ponta da agulha de injecção e ajustar as configurações (pressão e / ou tempo) para criar uma queda de injecção que tem um volume de 1 nl, como descrito ^25,26. Usando um estereomicroscópio de dissecação, injectar 1 nl de MO na gema (Figura 1A) de ≥ 50 embriões por experiência. Trabalhe rapidamente para completar injeções pelo veado de 4 célulase.
2. DFC-alvo injeção MO: Coletar embriões logo após a fertilização e incubar a 28,5 ° C. Quando os embriões terem atingido a fase 256 células (~ 2,5 hpf), rapidamente carregá-los em uma placa de injecção e, em seguida, injectar 1 nl de MO fluorescente na gema de ≥ 100 embriões entre os estágios de células 256 e 1000 células (Figura 1B).
3. Gema-alvo injeção MO: Coletar embriões logo após a fertilização e incubar a 28,5 ° C. Na fase de cúpula (~ 4 hpf), carregar os embriões em uma placa de injecção e, em seguida, injectar 1 nl de MO fluorescente na gema de ≥ 100 embriões entre a cúpula e os estágios epiboly 30% (Figura 1C).

2. Seleção de Embriões injetados para Análise

1. Quando MO embriões injectados atingir o estágio 75%-epiboly (8 hpf), remover os embriões não fertilizados e em seguida os embriões mortos e vivos tela sob um microscópio de dissecação para a distribuição de fluorescência da MO fluorescente. Então allow selecionados embriões para desenvolver a 28,5 ° C.
   1. Por mundial MO injecções, seleccionar os embriões que foram distribuídos uniformemente na fluorescência ao longo de todas as células embrionárias (Figura 1D; Figura 2A).
   2. Para DFC-alvo MO injecções, seleccionar os embriões em que MO fluorescente tem espalhado por toda a gema e aparece concentrada na margem dorsal blastoderme (DFC) (Figura 1E; Figura 2B). Nesta fase, pode ser difícil de visualizar SFD fluorescentes devido à fluorescência brilhante na gema subjacente. Ter o cuidado de excluir embriões em que o MO fluorescente tem incorporadas outras células embrionárias de DFC ou agregados permanece no local de injecção (Figura 2D).
   3. Para gema-alvo MO injeções, selecionar embriões em que MO fluorescência é uniformemente distribuídos por toda a gema e não observado em todas as células embrionárias (Figura 1F; Figura 2C). Mais uma vez, os embriões em que remover a MO fluorescente permaneceagregados no local da injeção.
2. Entre as fases 2-4-(~ 11 somito hpf), tela embriões uma segunda vez com um microscópio fluorescente utilizando uma ampliação maior. Em seguida, permitir embriões selecionados para desenvolver a 28,5 ° C.
   1. Para preparações injectáveis ​​globais MO, assegurar embriões seleccionados têm MO fluorescência distribuída uniformemente no KV e todas as células embrionárias (Figura 1D '; Figura 2E).
   2. Para DFC-alvo MO injeções, cuidadosamente selecionar embriões que têm MO fluorescência apenas em células KV ea gema (Figura 1E). Embriões transgénicos que expressam GFP em células KV, como Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, pode auxiliar na identificação de embriões em que MO tem sido entregue com sucesso para células KV (Figura 2F). Descartar embriões com MO fluorescência em células embrionárias de outras células que KV.
   3. Para gema-alvo MO injeções, selecionar embriões que têm fluorescência MO exclusivamente no (gema Figura 1F ': Figura2G).

3. Embriões de montagem para analisar o fluxo de fluidos em KV

1. Para analisar o fluxo de fluido assimétrica na KV mundial de MO, DFC-alvo MO ou gema-alvo embriões injetados MO, cuidadosamente dechorionate ~ 20 embriões entre 4-6 estágios somito (~ 11-12 hpf) com pinças afiadas.
2. Preparar 50 ml de 1% de baixo ponto de fusão e ponto de agarose aliquota em 5 ml tubos de ser mantidas como um líquido num banho seco a 42 ° C.
3. Transferir um embrião de uma lâmina de vidro a depressão (Supplies Unidos Scientific, Inc.) e remover o máximo de água possível. Imobilizar o embrião adicionando bastante morna 1% ponto de fusão baixo ponto de agarose para cobrir apenas o embrião (muito agarose pode interferir com a imagem seguinte). À medida que a agarose solidificar, fórceps para posicionar o embrião de tal modo que esteja voltada para cima KV (vista dorsal) (Figura 1H). Montar 10 embriões com um embrião por slide. Trabalhe rapidamente para garantir a todas as injeções na próxima etapa são completed pela fase somito 10 (14 hpf).

4. A injeção de microesferas fluorescentes em KV

1. Diluir Fluoresbrite Multifuorescent de 0,5 micron de diâmetro Microesferas (Polysciences, Inc.) a 1:50 em água estéril num tubo Eppendorf de 1,5 ml.
2. Misture a diluição de 1:50 de micro-esferas cuidadosamente tocando o tubo e colocar em 3 ul de uma agulha capilar. Usando o mesmo utilizado para microinjetor MO injeções (por exemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector), quebrar a ponta da agulha com uma pinça e ajustar as configurações de injeção para gerar a queda de injeção menor possível (<0,5 nl).
3. Sob um microscópio de dissecação, o alinhamento da agulha com o lúmen KV do primeiro embrião montado. Inserir a agulha no interior do lúmen e injectar um volume pequeno (<0,5 nl) de pérolas (Figura 1G). A ponta da agulha pequena e volume de injeção de pequeno porte são fundamentais para evitar KV prejudicial.
4. Injetar todos os embriões montados. Uma vez que o embrião tem sido injected, uma gota de água estéril pode ser adicionado em cima da agarose para impedir que sequem. Durante o curso das injecções, as pérolas frequentemente obstruir a abertura da agulha. Isto requer re-quebrar a ponta da agulha e ajustando o volume de injecção através da criação de modulação de pressão ou o tempo do aparato de microinjecção. Substituir a agulha se torna-se cega o suficiente para causar danos significativos durante a injeção.
5. Tela os embriões injectados para a entrega bem sucedida de grânulos sob um microscópio composto fluorescente na vertical (por exemplo, Zeiss AxioImager M1), utilizando uma objectiva de 20X. Em primeiro lugar, determinar se a estrutura está intacta KV usando iluminação de campo claro (Figura 1J), e, em seguida, usar fluorescência para observar os grânulos. Selecionar embriões cujas contas estão presentes e se movendo dentro do lúmen KV. Descartar embriões com danos KV ou nenhum grânulos flutuantes em KV. É fácil perder KV e entregar contas para tecidos próximos ou a gema subjacente. Se não tiver êxito, montagem AnoTher 10 embriões e repita o procedimento de injeção.

5. Visualização e análise de KV Fluido

1. Para cada embrião seleccionado com os grânulos no interior KV, adicionar uma gota de água estéril para cobrir a agarose e em seguida observar KV sob o microscópio composto fluorescente vertical utilizando uma objectiva 63X de água de imersão (Figura 1I). Alternativamente, uma lamela pode ser aplicado para utilização com objectivos de água não-imersão e / ou de microscópios invertidos.
2. Utilizar uma câmara de alta velocidade montado no microscópio (por exemplo Zeiss AxioCamHSm) para gravar um filme 10 seg. Gravar ambos os grânulos através do canal fluorescente (cerca de 70 fotogramas / segundo) e o lúmen KV utilizando um campo claro ou de contraste de interferência diferencial (DIC) do canal.
3. Para visualizar todos os movimentos de contas ao longo do tempo, importar o filme de partículas fluorescentes em ImageJ software (download gratuito em http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) umnd criar uma projeção máxima de todos os sinais fluorescentes no filme. Para realizar a projeção máxima em ImageJ, clique em "Imagem → → Pilhas projeto Z". No projeto "Z" janela, projetar todas as fatias com o tipo de projeção de "intensidade Max". Esta imagem pode ser sobreposta sobre uma imagem da DIC KV em que as contas foram clonados (Figuras 3A-B).
4. Os movimentos de contas individuais podem ser rastreados usando ImageJ. Um plugin ("Tracking Manual") pode ser baixado em http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Abra o filme pérolas fluorescente no ImageJ e executar a função rastreamento manual. Na janela de rastreamento manual, verifique "parâmetros Show" e os parâmetros de entrada para "intervalos de tempo" e "calibração x / y". Selecionar manualmente contas que permanecem no plano focal do filme para ≥ 50 quadros e acompanhar ≥ 5 contas por embrião. O caminho e velocidade de cada pérola é gerado por the software (Figuras CD 3).

Resultados

Injecções fase específicos MO proporcionar uma abordagem útil para a análise da função dos genes em compartimentos específicos do embrião. Figura 1 apresenta um diagrama de fluxo das estratégias de injecção utilizados para testar a função de genes em DFC / KV células e como introduzir partículas fluorescentes para visualizar o fluxo do fluido em KV. A distribuição de MO fluorescente em fase de sucesso específicos embriões injectados está representado esquematicamente nas fig...

Discussão

Usando estágio específicos injeções para atingir MO à linhagem de células DFC / KV é uma abordagem útil para o estudo de células-autonomia da função do gene e evitar fenótipos pleiotrópicos causados ​​por knockdown do gene global. No entanto, essas injeções pode ser tecnicamente desafiadora. Injecção de MO entre os estágios de células 256 e 1000 células pode resultar em três resultados possíveis: 1) o MO permanece agregados no local da injecção, 2) se difunde ao longo do MO gema e entra DFC /...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo
Norma de controlo oligo-marcado Lissamine	Gene Ferramentas, LLC
Personalizado Rock2b morfolino oligo	Gene Ferramentas, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 mícron Microesferas	Polysciences, Inc.	24054