Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Zusammenfassung

Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Zusammenfassung

Mikrotubuli sind Zytoskelett Polymere, die eine Rolle bei der Zellteilung, Mechanik und intrazellulären Transport. Jede dieser Funktionen erfordert Mikrotubuli, die steif und gerade genug, um eine signifikante Fraktion des Zelldurchmessers überspannen sind. Als Ergebnis hat die Persistenzlänge Mikrotubuli, ein Maß der Steifigkeit, aktiv in den vergangenen zwei Jahrzehnten ¹ untersucht. Dennoch bleiben Fragen offen: kurze Mikrotubuli sind 10-50 mal weniger steif als lange Mikrotubuli ^2-4, und noch lange Mikrotubuli Persistenz Längen, die von einer Größenordnung ^5-9 unterschiedlich gemessen.

Hier präsentieren wir eine Methode, um Mikrotubuli Persistenz Länge zu messen. Das Verfahren basiert auf einem Kinesin angetriebenen Gleitflug Mikrotubulus Assay ¹⁰ basiert. Durch die Kombination von spärlichen Fluoreszenzmarkierung einzelner Mikrotubuli mit single particle tracking einzelner Fluorophore an der Mikrotubuli, die gliding Trajektorien einzelner Mikrotubuli sind mit Nanometer-Ebene Präzision verfolgt. Die Persistenzlänge der Trajektorien ist die gleiche wie die Persistenzlänge des Mikrotubulus unter den verwendeten Bedingungen ^11. Ein automatisiertes Tracking Routine wird verwendet, um Mikrotubuli Trajektorien aus Fluorophoren an einzelnen Mikrotubuli zu erstellen, und die Persistenzlänge dieser Trajektorie wird anhand Routinen in IDL geschrieben.

Diese Technik ist rasch umsetzbar, und eine Messung des Persistenzlänge von 100 Mikrotubuli in einem Tag des Experimentierens. Das Verfahren kann erweitert werden, um Persistenzlänge unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich Persistenzlänge als Funktion der Länge entlang von Mikrotubuli zu messen. Darüber hinaus können die Auswerteroutinen zur Myosin-basierten Assays wirkenden Gleiten verlängert werden, um die Persistenzlänge Aktinfilamente sowie messen.

Einleitung

Das Zytoskelett, einem Netzwerk von Biopolymeren in den meisten eukaryotischen Zellen gefunden wird, spielt eine Rolle in der zellulären Organisation, den intrazellulären Transport und Zellmechanik. Die mechanischen Eigenschaften der Biopolymere des Cytoskeletts (primär Aktin und Mikrotubuli) spielen eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften der Zelle als Ganzes ^12. Da Ganzzell Mechanik charakterisieren gesunden und kranken Zellen ^13,14 und wird in zellulären Motilität ¹⁵ beteiligt sind, haben sich die mechanischen Eigenschaften der zugrundeliegenden Zytoskelett-Komponenten ein aktiver Bereich der Studie in den vergangenen zwei Jahrzehnten ^ein.

Die Flexibilität (oder Steifigkeit) von Biopolymeren erhält Persistenzlänge kann die Länge des Polymers, welche Biegungen um etwa ein Bogenmaß unter thermischer Schwankungen bei Umgebungstemperatur ist. Eine Anzahl von Techniken entwickelt worden, um Persistenzlänge ^16, zum Beispi messenle aktiven Techniken, die das Biegen des Polymers mit hydrodynamischen Fluss, optische Fallen, oder elektrische Felder ^4,17,18 und passive Techniken, die die Schwankungen der freien Polymeren in Lösung ^5,6 messen zu beteiligen. Die aktive Messungen erfordern jedoch spezielle Setups bekannten Kräfte im Mikrometerbereich zu implementieren und die freien Fluktuationsmessungen kann schwierig sein, durch Diffusion aus der Fokusebene des Mikroskops verwendet.

In diesem Artikel beschreiben wir einen komplementären, passiv, Technik, um die Persistenz Länge der Mikrotubuli, ein Zytoskelett Polymers zu messen. Die Technik umfasst Gleiten Assays, was bedeutet, dass das Polymer bleibt immer in der Brennebene ¹⁹ sicherzustellen. Darüber hinaus ist es Tracking einzelnen Fluorophore dauerhaft mit dem Polymer von Interesse gebunden sind, so dass spezifische Stellen entlang der Polymer gut charakterisiert sind.

Eine Karikatur des Verfahrens ist in Figur gezeigt,e 1. Kinesin bewegt speziell auf die + Ende der Mikrotubuli, so dass die Mikrotubuli in einem gleitenden Assays sind unidirektional angetrieben. Das führende Ende des Filaments, jenseits der letzten Kinesin befestigt, frei unter den thermischen Kräften der umgebenden Lösung schwanken. Da die Mikrotubuli vorn angetrieben wird, schwankt das Ende, bis die Bindung an eine neue Kinesin-Molekül weiter entlang der Glasträger friert in einem bestimmten Fluktuation. Weil Kinesin misst Mikrotubuli sehr stark, wird der Mikrotubulus gezwungen, den Weg des vorderen Endes folgen. Daher sind die statistischen Schwankungen in den Mikrotubuli Trajektorie eingefroren dieselben wie die statistischen Schwankungen des freien Endes der Mikrotubuli ^11, und können daher verwendet werden, um die Persistenzlänge nach Anspruch ²⁰ zu berechnen

wobei l _p die Persistenzlänge des Mikrotubuli ist, θ _ist der Winkel zwischen Tangenten an die Bahn durch eine Konturlänge s getrennt sind, und <> bedeutet einen Durchschnitt über alle Paare von Positionen durch eine Konturlänge s getrennt.

Das Gleiten Assay selbst verwendet Kinesin biotinyliert am Coiled-Coil ²¹ spezifisch an den Glasobjektträger über eine Streptavidin-Biotin-Verknüpfung gebunden ist. Diese Befestigung gewährleistet, dass die Motor-Domänen frei, zu binden und zu treiben Mikrotubuli sind. Um Mikrotubuli Trajektorien folgen, werden Mikrotubuli spärlich mit organischen Farbstoffen ^22,23 beschriftet - die Etiketten müssen spärlich genug, dass einzelne Fluorophore auflösbar sind mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie. Einzelne Fluorophore verfolgt werden mittels Bildanalyse-Routinen in IDL geschrieben. Die Trajektorien der einzelnen Fluorophor zu einem bestimmten mic gebundenrotubule werden in ein zusammengesetztes Mikrotubulus Trajektorie automatisch ²⁴ kombiniert. Die Tangentenwinkel θ zu jedem Punkt entlang einer Trajektorie berechnet werden; dieser Tangentenwinkel die s> Wert wird für jede Kontur Länge s berechnet. Schließlich werden diese Daten an Gl passen. Ein um eine Persistenzlänge bei gegebener Mikrotubuli zu extrahieren, oder für viele Mikrotubuli in der gleichen Gleiteigenschaften Assay.

Das Verfahren ist robust genug, um mit Mikrotubuli in einer großen Vielzahl von Bedingungen (mit verschiedenen Stabilisierungsmitteln oder andere kleine Moleküle, verbunden mit den Mikrotubuli, mit gebundenen Mikrotubulus-assoziierte Proteine ​​(MAPs), oder mit einer Vielzahl von viskosen Lösungen) hergestellt arbeiten. Im Test wurde die Technik verwendet worden, um die Persistenzlänge Mikrotubuli als Funktion der Länge entlang der Mikrotubuli und Mikrotubuli mit verschiedenen Stabilisierungsmitteln charakterisieren. Die wichtigste Einschränkung ist, dass die Mikrotubuli muss noch support Kinesin Motilität. Da Kinesin ist ein robuster Motor Enzym, ist dies eine ziemlich lockere Einschränkung. Mikrotubuli durch Ersetzen mit Aktin und Myosin-Kinesin mit einer Familie Enzym kann die Persistenzlänge Actin unter Verwendung der gleichen Technik werden.

Protokoll

Ein. Mikrotubuli Gliding Assay Stammlösungen

Bereiten Sie vor der gleitenden Assay.

1. Polymerisieren 0,5 mg Mikrotubuli spärlich mit hellen organischen Fluorophor ²² markiert. Die Zielmarke Konzentration 1 Fluorophors pro Mikrometer Mikrotubuli, oder eine Kennzeichnung Dichte von ungefähr 1 pro 1500 Fluorophor Tubulindimere. Lagerung bei Raumtemperatur, Licht mit Aluminium, Folie für bis zu zwei Wochen geschützt.
2. Entschlacken Biotin-Kinesin ²¹ bei etwa 1 uM. Lagerung bei -80 ° C in 5 ul Aliquots für den Einsatz in einzelnen Experimenten.
3. Bereiten Sie die Assaypuffer (AB) von 50 mM imidiazole, 50 mM Kaliumchlorid (KCl), 4 mM Magnesiumchlorid (MgCl _{2), 2} mM Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA), pH 6,7. Sterile Filter und bei 4 ° C.
4. Aufzulösen biotinylierten Rinderserumalbumin (Biotin-BSA) und 2 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter.Lagerung bei -80 ° C in 100 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu einem Monat.
5. Aufzulösen Streptavidin (SA) zu 10 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 20 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu zwei Wochen.
6. Aufzulösen α-Casein bis 5 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 100 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu zwei Wochen.
7. Aufzulösen Dithiothreitol (DTT) in entionisiertem Wasser bei 200 mM. Lagerung bei -20 ° C in 100 ul Aliquots innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen verwenden. Kann wieder eingefroren werden.
8. Aufzulösen Paclitaxel (PT) in HPLC-Qualität Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 4 mM. Shop in 10 ul Aliquots bei -80 ° C langfristig -20 ° C kurzfristig. Verwenden Sie innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen. Kann wieder eingefroren werden.
9. Aufzulösen Glucose in deionisiertem Wasser bei 120 mg / ml. Shop in 100 ul Aliquots bei -20 ° C. Kann wieder eingefroren werden.
10. Dislösen Adenosintriphosphat (ATP) in entionisiertem Wasser auf 150 mM, pH 7,0. Shop in 5 ul Aliquots bei -80 ° C innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen verwenden.
11. Bereiten 100x sauerstoffabfangende Lager ²⁵ durch Lösen 10.000 Einheiten Glucoseoxidase und 156.000 Einheiten Katalase in 600 ul Gesamtvolumen Assay-Puffer. Zentrifuge kurz in einer Mikrozentrifuge zu pelletieren Feststoffe, Filter Überstand mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 10 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu einer Woche.

2. Mikrotubuli Gliding Assay, Same Day Herstellung der Lösung

Bereiten der Lösungen in 2,1 bis 2,6 am Tag des Experiments. Mit etwas Übung können Lösungen 2,2-2,6 während Durchflusszelle Waschen vorbereitet werden. Sofern nicht anders angegeben, halten Stammlösungen auf Eis.

1. Bereiten AB, 1 ml Assay-Puffer mit 10 ul DTT Lager (AB mit 2 mM DTT). Halten Sie bei Raumtemperatur.
2. Bereiten bio-BSA-Puffer, 40 & mu; L einer 1:1-Mischung aus dem Biotin-BSA Lager und AB. Halten Sie bei Raumtemperatur.
3. Planen BSA-Puffer, 645 ul Mischen AB mit 5,5 ul BSA (1 mg / ml BSA in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur.
4. Bereiten SA-Puffer, Mischen 57 ul der AB mit 3 ul Streptavidin Lager (0,5 mg / ml Streptavidin in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur.
5. Bereiten α-Casein-Puffer, Mischen von 200 ul der BSA-Puffer, 50 ul Casein Lager, und 0,8 ul 15 uM ATP (1 mg / ml α-Casein, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur.
6. Bereiten Fluoreszenz anti-bleach-Puffer, Mischen von 95 ul α-Casein-Puffer, 2,5 ul Glucose-Lager, 1 ul 100x sauerstoffabfangende mix, 1 ul Paclitaxel Lager, 1 ul 2-Mercaptoethanol (βME). Fügen βME unter Abzug vornehmen. Verwenden Fluoreszenz anti-bleach Puffer innerhalb 1 Stunde der Vorbereitung. ACHTUNG: βME ist hochgiftig und riecht schrecklich. Achten Sie darauf, nur unter dem Abzug zu öffnen. Shop Flasche imAbwesenheit von Licht; Licht verschlechtert βME und seine Fähigkeit, Photobleichen reduzieren.

3. Mikrotubuli Gliding Assay

1. Konstrukt etwa vier Fahrspuren Strömung zwischen einem 24 x 60 mm Deckglas und 22 x 22 mm Deckglas mit Vakuumfett, extrudiert aus einer Spritze durch eine Pipettenspitze, als Abstandshalter. Jede Flow lane sollte etwa 10 ul Volumen (Skala nachfolgenden Volumina entsprechend) sein.
2. Waschen 10 ul Bio-BSA-Puffer in jede Spur. Inkubieren 5 min zu ermöglichen BSA zur Beschichtung der Glasflächen.
3. Waschen Sie jede Spur dreimal mit 15 ul BSA-Puffer zu entfernen freiem Biotin-BSA, während sie weiterhin die Gleitfläche zu blockieren. Verwenden Sie einen Kimwipe oder Filterpapier, um Buffer von der gegenüberliegenden Seite des Flusses Kammer zu entfernen, wobei Sie nicht zu erlauben, Luftblasen durch die Flusskammer gehen.
4. Waschen 15 ul SA-Puffer in jede Spur. 10 min warten, oder bis zu 2 Stunden. Das Streptavidin an die Oberfläche gebundene Biotin-BSA zu binden.
5. Waschen Sie jede Spur dreimal mit 15 ul BSA-Puffer auf freie SA zu entfernen, während weiterhin die Gleitfläche zu blockieren.
6. Waschen Sie jede Spur mit 15 ul α-Casein-Puffer. α-Casein hilft weiter blockieren, nicht-spezifische Bindung von Kinesin und Mikrotubuli auf das Glas.
7. Verdünnen Kinesin bis 10 nM in α-Casein-Puffer waschen und jede Gasse mit 15 ul dieser Kinesin - α-Casein-Lösung. Warte 15 min (oder bis zu einer Stunde) für das biotinylierte Kinesin spezifisch an der Oberfläche gebundenen Streptavidin. Die Kinesin-Motor-Domänen bleibt frei zu binden Mikrotubuli.
8. Verdünnen Paclitaxel bis 40 uM in Raumtemperatur α-Casein-Puffer, und waschen Sie jede Spur mit 15 ul dieser Lösung zu waschen freien Kinesin und vorab geladen jede Strömungskammer mit einer Paclitaxel-Lösung Mikrotubuli aus Depolymerisation zu verhindern. Kalte auch depolymerisiert Mikrotubuli, so stellen Sie sicher, dass diese Schritte erfolgen bei Raumtemperatur mit Raum-temperaturre Lösungen.
9. Fluoreszenzmarkierten verdünnten Mikrotubuli 1:100-1:1,000 der Fluoreszenz anti-bleach-Puffer mit 1 mM ATP. Waschen 15 ul in einer Fahrspur und beobachten innerhalb von 30 min.

4. Data Collection

1. Beachten Sie die Mikrotubuli Gleiten mittels Fluoreszenzmikroskopie, ein Mikroskop auflösen können einzelne Fluorophore wie einer gewerblichen oder home-build TIRF Setup ²⁶ (Abbildung 2) erforderlich.
   Die Mikrotubuli sollte durch die Kinesin-Motoren über das Substrat werden bei etwa 0,5 &mgr; m / s angetrieben, je nach Temperatur. Wenn das Feld-of-view des Mikroskops 50 um, sollten die einzelnen Mikrotubuli sichtbar sein für ca. 100 sek. Set Beleuchtungsstärke, so dass einzelne Fluorophore nicht schneller als 100 sec Photobleichmittels tun. Bei der Verwendung von Laser-Anregung, ist eine Leistungseinstellung von etwa 3-5 mW angemessen.
2. Collect Bildfolgen zur Analyse. 600 Bilder auf5 Hz (2 min gesamt) gut funktioniert. Verwenden Sequenzen lange genug, dass Mikrotubuli das gesamte Feld-of-view zu durchqueren.

5. Data Analysis

Ein IDL-Routine, get_lp.pro , ist beigefügt. Diese Routine gibt eine Persistenzlänge Wert auf allen Mikrotubuli Gleiten in einem gegebenen Bild Sequenz. Entweder laufen diese Routine auf jeder Bildsequenz, Modifizieren Intensität Parameter je nach Ihren speziellen Mikroskop-Setup, oder führen Sie die folgenden Schritte aus:

1. Verfolgen Sie jedes Fluorophor an einem Mikrotubulus zu Fluorophor Trajektorien erstellen.
2. Vereinen alle Trajektorien von Fluorophoren auf einer gegebenen Mikrotubuli in ein Gesamtsystem Mikrotubulus Trajektorie; Wiederholung für jede Mikrotubuli in der Bildsequenz (Abbildung 3).
3. Berechnen den Tangentenwinkel an jedem Punkt entlang der Trajektorie (Abbildung 4)Und berechnen θ _s> in Gl. Ein durch Mittelung des Kosinus des Winkels Differenz für jedes Paar von Punkten durch eine Weglänge getrennt s (Abbildung 5). Finden Sie die Persistenzlänge für eine einzelne Mikrotubuli oder eine Gruppe von Mikrotubuli durch den Einbau θ _s> Gl. 1, Gewichten der einzelnen Datenpunkte in der Passung der Anzahl von unabhängigen Werten von cos θ _s, mit dem der durchschnittliche berechnen sind.

Ergebnisse

Ein Schnappschuss von einem Gleiten Test wird in Abbildung 2 dargestellt. Eine gute Mikrotubulus Dichte beträgt 1-10 Mikrotubuli je Sichtfeld; wesentlich in Falschabtastungen führen, wie Mikrotubuli einander kreuzen. Ein Plot der 11 Mikrotubulus Trajektorien aus den Segelflugplatz Assay in 2 ist in 3 gezeigt. Typische Trajektorien sind 10 bis 30 &mgr; m lang, einige Bahnen haben Lücken, wo ein Mikrotubuli überquert anderen. Diese Trajektorien kann von der Analys...

Diskussion

Persistenzlänge Messungen sind eine gute Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Biopolymeren. In diesem Artikel, haben wir ein Verfahren zur Messung der Persistenzlänge Mikrotubuli beschrieben. Wie in der Einleitung erwähnt, wird dieses Verfahren ohne weiteres zu prüfen Mikrotubulus mechanischen Eigenschaften in einer Vielzahl von Bedingungen durch einfaches Variieren der Reagenzien, die Temperatur oder Viskosität im letzten Schritt der gleitenden Assay, 3.9, oder durch Polymerisation von Mi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Biotinylierten BSA	Thermo Scientific	29130
Α-Casein	Sigma-Aldrich	C6780
Streptavidin	Thermo Scientific	21125
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Glucose-Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Katalase	Sigma-Aldrich	C100
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Kaufen kleinen Betrag.
24x60 mm Nr. 1 1/2 Deckglas	VWR	48393-252
22x22 mm Nr. 1 Deckglas	Gold Seal	3306
Hochvakuumfett	Dow-Corning	NA
TIRF-Mikroskop	Viele	NA	Die TIRF-Mikroskop in diesem Verfahren eingesetzt war hausgemacht.
IDL (Software)	Exelis	NA	Könnte ersetzen MATLAB, ImageJ oder andere Software zur Bildanalyse.