글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

요약

지속성 길이 또는 biopolymers의 굽힘 강성을 측정 할 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 실험적으로 개별 미소의 지속성 길이를 결정하는 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석을 사용하고 고를 기반 글라이딩 assays에 적용 할 수 있습니다.

초록

미소는 cytoskeletal 세포 분열에 역할을 고분자, 세포 역학, 그리고 세포 내 수송 있습니다. 이 함수는 각각 뻣뻣하고 세포 직경의​​ 중요한 일부를 기간을 직선 충분 미소가 필요합니다. 그 결과, 미세 소관 지속성 길이, 강성의 측정은 적극적으로 지난 20 년 ¹ 연구되었습니다. 짧은 미소 긴 미소 ^2-4보다 10-50 배 더 치열한 있으며, 심지어 긴 미소는 진도 ^5-9의 순서에 따라 다를 수 지속성 길이를 측정했습니다 그럼에도 불구하고, 오픈 질문이 남아있다.

여기, 우리는 미세 소관 지속성 길이를 측정하는 방법을 제시한다. 방법은 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석 ^10를 기준으로합니다. 미세 소관에 부착 된 개인 fluorophores의 단일 입자 추적, glidin과 개별 미소의 스파 스 형광 라벨을 결합하여하나 미소의 g의 탄도는 나노 미터 수준의 정밀도로 추적합니다. 궤도의 지속성 길이는 ¹¹ 사용 조건에서 미세 소관의 지속성 길이와 동일합니다. 자동화 된 추적 루틴은 개별 미소에 첨부 fluorophores에서 미세 소관의 탄도를 만드는 데 사용되는,이 탄도의 지속성 길이를 IDL로 작성된 루틴을 사용하여 계산됩니다.

이 기술은 빠르게 implementable, 그리고 실험 하루에 100 미소의 지속성 길이를 측정 할 수 있습니다. 방법은 미소를 따라 길이의 함수로 지속성 길이 등의 다양한 조건 아래에서 지속성 길이를 측정하기 위해 확장 될 수 있습니다. 또한, 사용 된 분석 루틴은 잘 고를의 필라멘트의 지속성 길이를 측정하기 위해, 마이 오신 기반의 연기 글라이딩 assays로 확장 할 수 있습니다.

서문

세포 골격은 대부분의 진핵 세포에서 발견 biopolymers의 네트워크, 휴대 조직, 세포 내 수송과 세포 역학의 역할을합니다. 세포 골격 (주로 고를와 미소)의 biopolymers의 기계적 특성은 전체 ¹² 세포의 기계적 특성을 결정에 중요한 역할을한다. 전체 세포 역학이 건강하고 병에 걸린 세포에게 ^13,14을 특성화 할 수 있으며 세포 운동성 ^15에 관여되어 있기 때문에, 기본 cytoskeletal 구성 요소의 기계적 성질은 지난 20 년 ¹ 연구의 활성 영역했습니다.

biopolymers의 유연성 (또는 강성)은 지속성 길이, 주위 온도에서 열 변동에 따라 약 방 사부에 의해 구부러 폴리머의 길이에 의해 특징입니다. 기술의 수는 examp에 대한 지속성 길이 ^16, 측정하기 위해 개발되었습니다유체 흐름, 광학 트랩, 또는 전기 분야 ^4,17,18, 및 솔루션 ^5,6에서 무료로 고분자의 변동을 측정 수동적 인 기술을 사용하여 폴리머를 절곡 참여 르중인 기술. 활성 측정 단, 전문 설정은 마이크로 미터 규모라고 힘을 구현하도록 요구하고, 자유 변동 측정은 사용 현미경의 초점 비행기의 확산 아웃으로 인해 도전 할 수 있습니다.

이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이, cytoskeletal 폴리머를 측정 할 수있는 보완, 수동, 기술에 대해 설명합니다. 기술은 폴리머는 항상 ¹⁹ 초점 비행기에 남아 있도록 글라이딩 assays를 포함합니다. 또한,이 폴리머 따라 특정 위치가 잘 특징 있도록 관심 폴리머에 영구적으로 부착 된 추적 한 fluorophores을 포함합니다.

방법의 만화는 Figur에 표시됩니다E 1. Kinesin는 미소의 + 끝으로 구체적으로 이동하므로 글라이딩 분석에 미소가 unidirectionally 추진되어 있습니다. 미세 소관의 선두 끝은 첨부 마지막 kinesin 넘어, 주변 솔루션의 열 군사 변동 할 수있다. 미세 소관이 앞으로 추진되면서 끝은 유리 슬라이드를 따라 더 새로운 kinesin 분자에 바인딩 할 때까지 주어진 변동에 정지 다를 수 있습니다. kinesin가 매우 강력하게 미소를 연결하기 때문에, 미세 소관은 선도적 인 엔드의 경로를 따라 제한됩니다. 따라서 미세 소관 궤도에 냉동 통계 변동 미소 ^(11)의 자유 단의 통계 변동과 동일합니다, 따라서 ^20에 따라 지속성 길이를 계산하는 데 사용할 수 있습니다

리터 _P는 미세 소관의 지속성 길이이고, θ _{s이 (가)} 등고선의 길이 S로 구분하여 궤도에 접선 사이의 각도이며, <> 존재라는 증거 윤곽 길이의로 구분하여 위치의 모든 쌍 이상의 평균.

글라이딩 분석 자체는 특별히 streptavidin - 비오틴의 연계를 통해 유리 슬라이드에 바인딩 된 코일 코일 ^21시 kinesin biotinylated 사용합니다. 이 첨부 파일은 모터 도메인에 바인딩하고 미소를 추진 자유롭게 보장합니다. 미세 소관의 탄도를 따라하기 위해, 미소가 띄엄 띄엄 유기 fluorophores ^22,23으로 분류됩니다 - 라벨 하나 fluorophores는 단일 분자 형광 현미경을 사용하여 확인할 수있는 것을 충분히 희박한해야합니다. 싱글 fluorophores은 IDL로 작성된 이미지 분석 루틴을 사용하여 추적하고 있습니다. 각 형광의 궤도는 주어진 마이크에 바인딩rotubule은 자동으로 ²⁴ 복합 미세 소관 궤도로 결합되어 있습니다. 궤도를 따라 각 지점에 θ 탄젠트 각도가 계산되며,이 접하는 각도에서 S> 값이 각 등고선의 길이 s에 대한 계산됩니다. 마지막으로, 이러한 데이터는 EQ에 맞게되어 있습니다. 1 주어진 미세 소관에 대한 지속성 길이를 추출하기 위해, 또는 같은 글라이딩 분석에 많은 미소를위한.

방법은 조건의 다양한 (행 미세 소관 관련 단백질 (지도)이나 점성 솔루션의 다양한, 미세 소관에 바인딩 된 다른 안정화 대리인 또는 다른 작은 분자 포함)에서 조리 미소와 함께 일을 할 수있을만큼 강력합니다. 우리가 실험실에서, 기술은 다른 안정화 에이전트와 미소와 미소를 따라 길이의 함수로 미소의 지속성 길이를 특성화하는 데 사용되었습니다. 주요 제한은 미소는 여전히해야upport kinesin의 운동성. kinesin는 강력한 모터 효소이기 때문에이 상당히 느슨한 제한됩니다. 마이 오신 가족 효소를 고를와 kinesin과 미소를 대체함으로써, 고를의 지속성 길이가 같은 기술을 사용하여 측정 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 미세 소관 글라이딩 검정 주식 솔루션

앞서 글라이딩 분석의 준비.

1. 띄엄 띄엄 밝은 유기 형광 ²² 분류 0.5 MG의 미소를 중합. 대상 레이블 농도가 1 마이크로 미터 미세 소관의 당 형광, 또는 1500 tubulin의 dimers 당 약 1 형광의 라벨 밀도입니다. 객실 온도, 빛의 저장소가 최대 두 주를 위해 알루미늄, 호일로 보호되고 있습니다.
2. 약 1 μM에서 비오틴 - kinesin ²¹ 정화. -80에서 저장 ° C 각각의 실험에 사용 5 μl aliquots 인치
3. 50 밀리미터 imidiazole의 분석 버퍼 (AB), 50 MM의 칼륨 염화물 (KCl), 4 밀리미터 염화 마그네슘 (MgCl _2), 2 MM 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA), pH를 6.7를 준비합니다. 4에 살균 필터 및 저장 ° C.
4. 2 밀리그램 / AB의 ML에 biotinylated 소 혈청 알부민 (BSA 비오틴 -)을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다.-80에서 스토어 4에 오랜 기간 100 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 1 개월하십시오.
5. 10 MG / AB의 ML에 streptavidin (SA)을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다. -80에서 매장까지 2 주에 ° 4에 오랜 기간 20 μl aliquots에서 C, ° C.
6. 5 AB의 MG / ML에 α-카제인을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다. -80에서 스토어 4에 오랜 기간 100 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 2 주에.
7. 200 MM의 탈 이온수에 dithiothreitol (DTT)을 분해. 100 μl aliquots에서 -20 ° C에서 스토어는, 해동 8 시간 이내에 사용합니다. refrozen 할 수 있습니다.
8. 4 MM에서 HPLC 급 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 paclitaxel (PT)을 분해. -80 10 μl aliquots에 저장 ° C 장기적으로, -20 ° C 단기. 해동 8 시간 이내에 사용하십시오. refrozen 할 수 있습니다.
9. 120 MG / ML의 탈 이온수에서 포도당을 분해. -20 ° C. 100 μl aliquots에 저장 refrozen 할 수 있습니다.
10. 비밀입니다150 음, 산도 7.0에서 탈 이온수에 아데노신 삼인산 (ATP)를 해결. -80에서 5 μl aliquots에 저장 ° C는 해동 8 시간 이내에 사용합니다.
11. 600 μl 총 검정 버퍼에 카탈라아제 만 단위의 포도당 산화 효소와 156,000 단위를 용해하여 100x 산소를 청소 재고품 ²⁵ 준비합니다. 펠렛 고체에 microcentrifuge에 간단히 원심 분리기, 0.2 μm의 주사기 필터 필터 표면에 뜨는. -80에서 스토어 4에 오랜 기간에 10 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 일주일하십시오.

2. 미세 소관 글라이딩 검정, 당일 솔루션 준비

실험 당일 2.1-2.6의 솔루션을 준비합니다. 연습으로, 솔루션 2.2-2.6는 흐름 세포 세척 동안 준비 할 수 있습니다. 별도로 명시하지 않는 한, 얼음 재고 솔루션을 유지.

1. DTT 주식의 10 μl (2 MM DTT와 AB)와 AB, 검정 버퍼 1 ML을 준비합니다. 실온에서 보관.
2. 바이오 BSA 버퍼, 40 & 무 준비, 비오틴-BSA 주식과 AB의 1:1 혼합물의 리터. 실온에서 보관.
3. 5.5 μl BSA (AB 1 MG / ML BSA)과 AB의 645 μl를 혼합 BSA 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관.
4. 3 μl streptavidin 재고 (AB의 0.5 MG / ML streptavidin)와 AB의 57 μl를 혼합, SA 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관.
5. BSA 버퍼, 50 μl 카세인 재고 및 15 μM ATP (1 MG / ML α-카세인, 0.8 MG / ML BSA, AB에서 50 nm의 ATP)의 0.8 μl 200 μl를 혼합, α-카세인 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관.
6. 95 μl α-카세인 버퍼, 2.5 μl 포도당 재고, 1 μl 100x 산소 청소 믹스, 1 μl paclitaxel 재고, 1 μl 2 메르 캅토 에탄올을 (βME) 혼합, 형광 반 표백 버퍼를 준비합니다. 배기함에 넣고 βME을 추가합니다. 준비 1 시간 이내에 형광 반 표백 버퍼를 사용하여주의 :. βME은 높은 독성이며, 끔찍한 냄새. 만 배기함에 넣고 열해야합니다. 에 저장 병빛의 부재, 빛 βME과 photobleaching을 줄일 수있는 능력을 방해합니다.

3. 미세 소관 글라이딩 분석

1. 스페이서로 피펫 팁을 통해 주사기에서 압출 진공 그리스를 사용하는 24 X 60mm의 coverslip 22 X 22mm의 coverslip 사이 네 흐름 차선,에 대해 구성합니다. 각 흐름 차선는 볼륨의 약 10 μl (규모의 후속 권 따라)해야합니다.
2. 각 차선에 바이오 BSA 버퍼 10 μl을 씻는다. BSA는 코트의 유리 표면을 할 수 있도록 5 분 알을 품다.
3. 슬라이드 표면을 차단하는 계속하는 동안, 비오틴-BSA 무료 제거 15 μl BSA 버퍼 각 차선을 세 번 씻으십시오. 공기 거품이 흐름 챔버 통과 할 수 있도록하지 않도록하는 것 흐름 챔버의 반대편에서 버퍼를 제거하는 Kimwipe 또는 거름 종이를 사용합니다.
4. 각 차선에 15 μl SA-버퍼를 씻으십시오. 10 분, 또는 최대 2 시간을 기다립니다. streptavidin는 표면에 바인딩 비오틴-BSA에 바인딩됩니다.
5. 슬라이드 표면을 차단하기 위해 계속하는 동안 무료로 SA를 제거하는 15 μl BSA 버퍼 각 차선을 세 번 씻으십시오.
6. 15 μl α-카세인 버퍼 각 차선을 씻는다. α-카세인은 또한 유리에 비 특정 kinesin의 구속하며 미소를 차단하는 데 도움이됩니다.
7. α-카세인 버퍼에서 10 나노 미터로 kinesin를 희석이 kinesin의 15 μl 각 차선을 씻고 - α-카세인 솔루션입니다. 표면에 바인딩 streptavidin에 구체적으로 바인딩 biotinylated kinesin 15 분 (또는 최대 한 시간까지) 기다립니다. kinesin 모터 도메인은 바인드 미소를 무료로 유지됩니다.
8. 방 온도 40 μM α-카세인 버퍼에 paclitaxel을 희석, 무료 kinesin을 씻어하고 depolymerizing에서 미소를 방지 할 수있는 paclitaxel 솔루션으로 각각의 흐름 챔버를 미리로드하려면이 솔루션의 15 μl 각 차선을 씻는다. 감기는 미소를 depolymerizes 때문에 방 temperatu로 실온에서 다음 단계가 발생했는지 확인솔루션을 다시.
9. 휘황 1 ㎜ ATP와 형광 안티 - 표백제를 버퍼에 미소 1:100-1:1,000이라는 희석. 한 차선에 15 μl을 씻고 30 분 이내에 관찰한다.

4. 데이터 수집

1. 형광 현미경을 사용하여 미소 글라이딩을 관찰, 이러한 상업적 또는 집에서 빌드 TIRF 설정과 같은 단일 fluorophores를 해결 할 수있는 현미경은 ²⁶ (그림 2)가 필요합니다.
   미소는 온도에 따라 약 0.5 μm / s의 기판 위에 kinesin 모터에 의해 추진되어야한다. 현미경의 뷰 필드가 50 μm 경우, 각각의 미소는 약 100 초 동안 표시됩니다. 단일 fluorophores 더 빨리 100 초보다 photobleach하지 않도록 조명 강도를 설정합니다. 레이저 여기를 사용하는 경우, 약 3-5 MW의 전력 설정이 적합합니다.
2. 분석을위한 이미지의 시퀀스를 수집합니다. 600 이미지에서5 Hz에서 (2 분 총)는 잘 작동합니다. 충분히 미소는 전체 뷰 필드를 통과하는 시퀀스를 사용하십시오.

5. 데이터 분석

IDL 루틴, get_lp.pro가 첨부되어 있습니다. 이 루틴은 주어진 이미지 시퀀스의 모든 미소 글라이딩에 따라 지속성 길이 값을 반환합니다. 어느 특정 현미경 설정에 따라 강도 매개 변수를 수정, 각 이미지 시퀀스에서이 루틴을 실행하거나 다음을 수행하십시오 :

1. 형광의 탄도를 만들 수있는 미세 소관에 부착 된 각각의 형광을 추적 할 수 있습니다.
2. 이미지 시퀀스의 각 미세 소관 (그림 3)을 반복, 전체 미세 소관 궤도에 주어진 미세 소관에 fluorophores의 모든 궤도를 결합합니다.
3. 궤적을 따라 각 지점의 접선 각도 (그림 4) 계산및 계산 θ _S> EQ 인치 (그림 5) 경로 길이 S로 구분하여 지점의 모든 쌍에 대한 각도 차이의 코사인을 평균하여 1. θ _S> EQ에 맞는 θ _s의 독립적 인 값의 개수로 적합의 개별 데이터 포인트.

결과

글라이딩 분석에서 스냅 샷은 그림 2에 표시됩니다. 좋은 미세 소관 밀도는 시야 당 1-10 미소이다; 미소가 서로 교차으로 실질적으로 더 많은 mistracking 될 것이다. 그림 2의 글라이딩 분석에서 11 미세 소관의 탄도의 플롯은 그림 3에 표시됩니다. 일반적으로 궤도는 10-30 μm 길이 한쪽 미세 소관이 서로 교차 곳을 몇 궤도는 차이가 있습니다. 이 궤도는 분석에서 ...

토론

지속성 길이 측정은 개별 biopolymers의 기계적 성질의 좋은 특성입니다. 이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이를 측정하는 방법을 설명합니다. 으로 도입에 명시된 바와 같이,이 방법은 쉽게 간단하게 글라이딩 검정, 3.9의 최종 단계에서 시약, 온도, 또는 점도를 변화하거나 polymerizing 미소, 스텝 1.1의 다양한 조건에 미세 소관 기계적 특성을 조사에 연장됩니다 다른 조건 하에서.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이미 다졸	시그마 - 알드리치	I2399
칼륨 염화물	시그마 - 알드리치	P9541
염화 마그네슘	시그마 - 알드리치	M8266
EGTA	시그마 - 알드리치	E3889
BSA	Calbiochem	126615
biotinylated BSA	열 과학	29,130
α-카세인	시그마 - 알드리치	C6780
streptavidin	열 과학	21,125
dithiothreitol	시그마 - 알드리치	D0632
paclitaxel	LC 연구소	P-9600
포도당 산화 효소	시그마 - 알드리치	G2133
카탈라아제	시그마 - 알드리치	C100
포도당	시그마 - 알드리치	G8270
ATP	시그마 - 알드리치	A2383
2 메르 캅토 에탄올	시그마 - 알드리치	M3148	독성. 작은 금액을 구매합니다.
24X60 mm 번호 1 1 / 2 커버 유리	VWR	48393-252
22X22 mm 제 1 커버 유리	골드 인감	3306
높은 진공 그리스	다우 코닝 -	NA
TIRF 현미경	많은	NA	이 방법에 사용되는 TIRF 현미경은 집에서 만든이었습니다.
IDL (소프트웨어)	Exelis	NA	는 MATLAB, ImageJ, 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어를 대체 할 수 없습니다.