Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Zusammenfassung

Mitochondrium ist ein wichtiger intrazellulären Organellen für die Energieproduktion und intrazelluläre Signal in eukaryontischen Systemen verantwortlich. Mitochondriale Dysfunktion oft begleitet und trägt zur menschlichen Krankheit. Mehrzahl der Ansätze, die entwickelt wurden, um die mitochondriale Funktion und Dysfunktion beurteilen sich auf in vitro oder ex vivo-Messungen. Ergebnisse aus diesen Versuchen sind die Fähigkeit zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion in vivo begrenzt. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, die konfokale Scanning-Mikroskopie für die Abbildung von intakten Geweben im Live Aminalen, die die Bewertung der einzelnen Funktion der Mitochondrien in einer Echtzeitweise in vivo ermöglicht nutzt. Zunächst erzeugen wir transgene Mäuse, die mitochondriale gezielte Superoxid-Indikator, zirkular permutiert gelb fluoreszierende Protein (mt-cpYFP) ausdrückt. Betäubt mt-cpYFP Maus auf eine maßgeschneiderte Tischadapter und Zeitraffer-Bilder werden f genommen Festrom die freiliegenden Skelettmuskeln der hinteren Gliedmaßen. Die Maus wird anschließend getötet und das Herz wird für Langendorff-Perfusion mit physiologischen Lösungen bei 37 ° C eingestellt Perfundierten Herzen in einer speziellen Kammer auf der konfokalen Mikroskoptisch positioniert und leichtem Druck aufgebracht wird, um das Herz zu immobilisieren und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte zu unterdrücken. Superoxid Wallungen werden durch Echtzeit-2D-konfokale Bildgebung bei einer Frequenz von einem Bild pro Sekunde erfasst. Die Perfusionslösung können modifiziert werden, um verschiedene Substrate Atmung oder andere Fluoreszenzindikatoren enthalten. Die Perfusion kann auch eingestellt werden, um Krankheitsmodellen wie Ischämie und Reperfusion zu erzeugen. Diese Technik ist ein einzigartiger Ansatz zur Bestimmung der Funktion von Einzel Mitochondrium in intakten Geweben und in vivo.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Zell Bioenergetik, Radikal Signalisierung, Redox-Homöostase, Ionenregulation und Zellschicksal Bestimmung ^1,2. Mitochondrien Dysfunktion oft begleitet und die Voraussetzung für die Entstehung von Krankheiten ^6.3. Insbesondere in den Muskelsysteme wie Herz-und Skelettmuskulatur liefert mitochondrialen Atmung der meisten ATP rechtzeitige Regulierung der intrazellulären Calcium und robuste Kraftentwicklung ^7,8 unterstützen. Diese Muskeln besitzen eine große Anzahl von Mitochondrien, die oft besetzen bis 20-40% des gesamten Zellvolumens und "fixiert" zwischen Myofilamenten ^2.

Trotz der zahlreichen Studien, das Verständnis der Regulation der mitochondrialen Funktion, insbesondere in vivo und unter physiologisch relevanten Bedingungen, begrenzt. Einer der Gründe ist, dass die Mehrheit der zur Auswertung der mitochondrialen Funktion entwickelten Methoden beruhen auf in vitro-oder ex vivo-Ansätze, wie die Überwachung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien mit künstlichen Substraten ergänzt, und die indirekte Bestimmung der mitochondrialen Funktion durch Morphologie (z. B. Elektronenmikroskopie), Enzymaktivität (z. B. Aconitaseaktivität) oder intrazellulären ATP-Spiegel ^9-11 .

Kürzlich, kleines Molekül Fluoreszenzindikatoren mit relativer mitochondrialen Bereicherung wurden angewendet, um einen Einblick in die mitochondriale Signale, einschließlich Membranpotential, Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), in intakten Zellen ^11-13 bieten. Außerdem haben mehrere grün fluoreszierende Protein (GFP) und ROS basierten Redox-Indikatoren entwickelt worden, um genauere Beurteilung des Fachintrazellulären Redox-oder ROS Signale ^14-16 zu erreichen. Unter diesem, eine genetisch kodierte Superoxid-Indikator, der Kreis permutierter gelb fluoreszierendes Protein und Targete entwickelten wird in Mitochondrien (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP kann bei 405 oder 488 nm mit beiden Emissionspeaks bei 515 nm angeregt werden. Die Emission bei 488 nm Anregung, die auf Superoxid-spezifisch, wie durch vorherige in vitro-und in-vivo-Kalibrierung ^17,18 dargestellt. Die Emission bei 405 nm Anregung wird als interne Kontrolle verwendet (siehe hierzu detaillierte Informationen über die Emissions-und Anregungsspektren von mt-cpYFP unter verschiedenen Bedingungen Abbildung 1 von Lit. 17). Mit Zeitraffer-konfokale Bildgebung, erkennt diese Anzeige platzen Superoxid-Produktion Veranstaltungen, namens Superoxid Wallungen, in Einzel Mitochondrien intakter Zellen. Superoxid-Flash dient als eine zusammengesetzte Funktion der mitochondrialen Atmung, vorübergehende Begleitmitochondrienmembran Depolarisation und ROS-Produktion ^17-20. Kürzlich haben wir die pan-Gewebe mt-cpYFP transgenen Mäusen mit dem pUC-CAGGS-mt-cpYFP Vektor ^17,19 auf C57/BL6 Hintergrund generiert und verifiziert die starken Ausdrucksion dieses Indikators in Herz, Skelettmuskeln und anderen Geweben (Abbildung 2). Die transgenen Mäuse werden auf Anfrage und MTA Genehmigung durch die Universität von Washington sein für interessierte akademischen Forschern zur Verfügung.

In dieser Studie beschreiben wir in situ-Bildgebung von Superoxid blinkt Langendorff perfundierten Herzen als auch in vivo-Abbildung von von Blitzereignissen in der Skelettmuskulatur von betäubten mt-cpYFP transgenen Mäusen ^17,19. Diese Technologie ermöglicht die Echtzeitüberwachung der einzelnen mitochondrialen ROS-Produktion Ereignisse in einem physiologisch relevanten Bedingungen oder in vivo ^21,22. Es ist auch möglich, das System zu verwenden, um andere einzelne Parameter wie mitochondriale Membranpotential und Calcium mit geeigneten fluoreszierenden Indikatoren. Ferner gleichzeitige oder parallele Auswertung der mitochondrialen Funktion mit intrazelluläre Ereignisse (z. B. Calcium Transienten) oder Herzfunktion (z. B.. Ejektionsfraktion) erreicht werden. Pathologischen Störungen, wie Ischämie und Reperfusion kann perfundierten Herzen angewandt werden, um die Auswirkungen von Stress auf die einzelnen mitochondrialen Funktion im intakten Myokard zu beurteilen.

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Protokoll

1. Experiment Vorbereitung

1. Bereiten Sie die isotonische balancierte Salzlösung (50 ml), enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl ₂ und 10 mM HEPES (pH 7,2) für die in vivo-Bildgebung Skelettmuskel.
2. Herstellung von 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) enthält: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 0,5 mM EDTA und 25 mM _NaHCO3.
3. Blasen die KHB mit Gas, das 95% O _{2/5% CO &sub2;} für 10-15 min vor der Zugabe von 2 mM CaCl _2. In metabolischen Substrate (z. B. 10 mM Glucose und 0,5 mM Pyruvat).
4. Vorbereitung der chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Scheren und Pinzetten in 70% Ethanol und anschließendes Spülen in sterilisiertem ddH ₂ O.
5. Schalten Sie den Herzdurchblutung System, stellen Sie die Temperatur auf dem Wasserbad und Thermostaten, die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe bis 6 ml / min.
6. Blase der KHB mit 95% O ₂/ 5% CO _2-Gases und die Durchflussrate und Temperatur (37 ° C, durch eine faseroptische Temperatursonde) des Abwassers zu überwachen. Das System benötigt etwa 20 Minuten für Gas-und Temperaturausgleich.

2. Die konfokale Bildgebung der Skelettmuskulatur In Vivo

1. Maus anästhesiert mit Pentobarbital (80 mg / kg, ip). Das Tier wird chirurgische Anästhesie (keine Reaktion auf Zehenklemm) innerhalb von 10-15 min erreicht und bleibt in diesem Zustand für 1-1,5 h, ausreichend für die in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln.
2. Haare entfernen auf einem der Hinterbeine und Sterilisieren der Haut mit 70% Ethanol.
3. Einen Einschnitt auf der Haut entlang der Außenseite der Schenkel um die Wadenmuskeln freizulegen.
4. Nehmen Sie den Epimysium vorsichtig mit einem scharfen Zangen und einen Einschnitt durch sie mit einer Schere. Weitere sezieren, um die Epimysium entfernen und setzen die Muskelfasern unter ihm.
5. Für die in vivo Belastung der TMRM in die SkelettMuskel, gehören TMRM (500 nM) in der isotonischen Salzlösung ausgeglichen, um Muskeln für 30 Minuten eintauchen und dann waschen von Anzeige-freie Lösung.
6. Setzen Sie die Maus auf seiner Seite auf dem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510) Stufe und der hinteren Gliedmaßen in einer Position, die der freiliegenden Skelettmuskel zugewandt ist gegen das Deckglas, das den Boden der Kammer bildet, zurückhalten. Das Deckglas ist zwischen dem Muskelgewebe und dem invertierten Objektiv (40x Öl).
7. Drücken Sie das Bein leicht nach unten, um einen engen Kontakt zwischen dem Gewebe und dem Deckglas zu machen. Tauchen Sie die freiliegenden Muskeln in isotonischer Salzlösung ausgeglichen.
8. Datensatz zweidimensionale (2D, xy) konfokale Bilder mit einer Abtastrate von einer Sekunde pro Rahmen. Die Intensität jedes Pixels wird in 8-Bit-Auflösung digitalisiert. Normalerweise enthält eine serielle Scan 100 Bilder.
9. Sammeln aufeinanderfolgenden Bildern von aufregenden ersten bei 405 nm und Sammeln bei> 505 nm dann bei 488 nm, während das Sammeln bei> 505 nm für zwei Wellenlängen excitation Bild von mt-cpYFP. Verwenden sequentielle Anregung bei 405, 488 und 543 nm und Emission bei 505 bis 545 zu sammeln, 505-545 und> 560 nm, jeweils für Dreifachanregungswellenlänge Bildgebung von mt-cpYFP und TMRM.

3. Die konfokale Bildgebung von perfundierten Maus Herz

1. Unmittelbar nach der in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln, injizieren die Maus mit 200 Einheiten Heparin (ip). Zehn Minuten später einschläfern der Maus durch Thorakotomie und schnell zu entfernen, die das Herz mit Lunge und Thymus attached to it.
2. Entfernen Sie schnell die Lunge in eiskaltem Puffer. Identifizieren Sie die Lappen des Thymus und vorsichtig abziehen, um den aufsteigenden Aorta aus.
3. Entfernen Sie den Thymus und isolieren die Aorta durch vorsichtiges Entfernen von umgebenden Gewebe.
4. Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta vor dem ersten Zweig der Aortenbogen.
5. Halten Sie die Wand der Aorta vorsichtig mit zwei Mikronahtzange, um den Hohlraum freizulegen, und vorsichtig die Aorta auf die ca.nnula (PE50-Rohr). Die Aorta wird an Ort und Stelle mit einem Mikro-Gefäßklemme gehalten, während Nähte werden schnell um die Aorta verbunden.
6. Entfernen Sie die Klemme, sorgfältig zu prüfen, die Kanüle mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle über Aortenwurzel ist. Zusätzliche Verbindungen werden nach Bedarf hinzugefügt, um das Herz in Position zu halten.
7. Schalten Sie die peristaltische Pumpe und Perfusion des Herzens bei 1 ml / min. Das Herz wird wieder schlagen auf Perfusion.
8. Stellen Sie die Position des Perfusionssystems legte das Herz auf dem Mikroskoptisch. Die Bühne hat einen Adapter, der Erwärmung der Kammer, die das Herz hält kann.
9. 1 ml KHB Perfusionslösung in der Kammer, um das Herz teilweise eintauchen. Überwachung der Temperatur der Kammer bei 37 ° C Entfernen Abfluß aus der Kammer unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe.
10. Erhöhen die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe allmählich auf eine ausreichende Strömung (ca. 2 ml / min), um das Herz zu liefern.
11. Nach 10 min Stabilisierung versorgen die HEArt mit 10 uM blebbistatin und 100-500 nM TMRM. Herzschlag wird nach 10 min zu verlangsamen.
12. Sanften Druck auf das Herz, um engen Kontakt des Herzens mit dem Deckglas auf dem Boden der Kammer zu gewährleisten und um weiter zu unterdrücken Herzschlag.
13. Verfahren Sie ebenso für die konfokale Bildgebung von intakten Herzmuskel, wie in Schritt 2.8 oben beschrieben. Die Brennebene sorgfältig anpassen, um das klarste Bild möglich zu offenbaren.

4. Bildverarbeitung und Datenanalyse

1. Verwenden Sie Tools von der "Physiologische Analysis"-Modul des konfokalen Software, um Einzel mitochondriale Membranpotential Wallungen und Veränderungen zu analysieren ist. Dieses Modul ist häufig in der Bildaufnahme-Software des konfokalen Systems enthalten und ermöglicht die Bestimmung bestimmter Bildbereiche sowie Ausgangs der Fluoreszenzintensität mit der Zeit Etiketten.
2. Öffnen Sie die Datenbank und dann die Serien 2D-Image-Datei zu analysieren.
3. Klicken Sie auf die "Regionof Interest (ROI) bedeuten Mittelwert von ROIs ", um zum Schalter" "-Modus. Klicken Sie auf die" Region of Interest (ROI) Mittelwert Mittelwert von ROIs "-Modus", um zum Schalter. "
4. Schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle außer dem Kanal der cpYFP 488 nm für die Auswahl der blinkt.
5. Zoom in das Bild und bewegen manuell Schieberegler, um die seriellen 2D-Bildern zu spielen.
6. Identifizieren Einzel mitochondrialen Superoxid blinkt durch Anordnen der Ort, an dem Fluoreszenzsignal steigt vorübergehend. Verwenden Sie den entsprechenden ROI-Tool, um die Blitze zu markieren. Die Spur, die zeitabhängige Fluoreszenzänderung jedes ROI zeigen sich neben dem Bild.
7. Nach der Auswahl aller blinkt, schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle. Wählen Sie eine ROI auf das Bild außerhalb der Zelle für die Hintergrundsignal Subtraktion. Ausgangs die durchschnittliche Fluoreszenz jedes ROI zusammen mit den Zeit Etiketten.
8. Notieren Sie die Anzahl der Blitze in jeder der seriellen Scan-Image-Datei zusammen mit der Scan-Zeit und Flächedie Zelle. Verwenden von Excel zum Blitzfrequenz als Anzahl der Blitze pro 100 sec / 1000 um ² Zellfläche zu berechnen.
9. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte entwickelte Programm in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) geschrieben, um die Parameter der einzelnen Flash-(Amplitude, Zeit, Höhepunkt erreichen und Abfallzeit) zu berechnen. IDL-Software ist im Handel erhältlich und der speziell entwickelten Programm für Flash-Parameteranalyse können beim Autor angefordert werden.

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Ergebnisse

Gemäß diesem Protokoll können in vivo Bildgebung von Einzel mitochondriale Ereignisse in der Skelettmuskulatur von betäubten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von in situ-Bildgebung in perfundierten Herzen (Fig. 1). Die optimale Einstellung der Aufnahmebedingungen wird dafür sorgen, klare Bilder der intakten Muskeln und mit Einzel Mitochondrium Auflösung (Abbildung 2). TMRM wird oft verwendet, um die Position der mt-cpYFP überprüfen und sollte eine vollstä...

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Diskussion

Imaging Einzel mitochondriale Ereignisse in lebenden Tier oder durchbluteten Organen hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden für die mitochondriale Funktion Auswertung ^{17,19,21,22,24,25.} Die hier beschriebene Technik kann Echtzeit-in-situ-Bestimmung der mitochondrialen Funktion in einem echten physiologischen Zustand auf subzellulärer Auflösung zu erreichen. Dies ist besonders nützlich, wenn sie mit anderen Messungen kombiniert werden, um systemisch Studium der Rolle von Mitoch...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.