Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Résumé

Microscopie confocale à balayage est appliqué pour l'imagerie des événements mitochondriaux simples dans le cœur perfusé ou les muscles squelettiques dans les animaux vivants. Surveillance en temps réel des processus mitochondriaux simples tels que les bouffées de superoxydes et les fluctuations potentielles membrane permet l'évaluation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinente et pendant perturbations pathologiques.

Résumé

Mitochondrie est un organite intracellulaire critique responsable de la production d'énergie et la signalisation intracellulaire dans les systèmes eucaryotes. Dysfonction mitochondriale accompagne souvent et contribue à la maladie humaine. La majorité des approches qui ont été développées pour évaluer la fonction mitochondriale et le dysfonctionnement sont basées sur in vitro ou ex vivo mesures. Les résultats de ces expériences ont la capacité à déterminer la fonction mitochondriale in vivo est limitée. Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui utilise la microscopie à balayage confocal pour l'imagerie de tissus intacts en aminals vivants, ce qui permet l'évaluation de la fonction mitochondriale unique d'une manière en temps réel in vivo. Tout d'abord, on génère des souris transgéniques exprimant la cible mitochondriale indicateur de superoxyde, la protéine fluorescente jaune circulairement permuté (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anesthésiés souris est fixé sur un adaptateur de platine sur mesure et images de time-lapse sont prises felon les muscles squelettiques exposées de la patte arrière. La souris est ensuite sacrifiée et le coeur est mis en place pour la perfusion de Langendorff avec des solutions physiologiques à 37 ° C. Le cœur perfusé est placé dans une chambre spéciale sur la platine du microscope confocal et une légère pression est appliquée pour immobiliser le cœur et supprimer rythme cardiaque induite par l'artefact de mouvement. Superoxydes sont détectés par les bouffées de 2D en temps réel imagerie confocale à une fréquence d'une image par seconde. La solution de perfusion peut être modifié pour contenir des substrats différents de respiration ou d'autres indicateurs fluorescents. La perfusion peut également être ajustée pour produire des modèles de maladies telles que l'ischémie et la reperfusion. Cette technique est une approche unique pour déterminer la fonction de mitochondrie unique dans les tissus intacts et in vivo.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle central dans la bioénergétique cellulaire, la signalisation des radicaux libres, homéostasie redox, la régulation ionique, et le destin des cellules détermination ^1,2. le dysfonctionnement des mitochondries et accompagne souvent la base de la pathogenèse des maladies ^6.3. En particulier dans les systèmes musculaires tels que le cœur et les muscles squelettiques, la respiration mitochondriale fournit la majorité de l'ATP pour soutenir la réglementation en temps opportun de calcium intracellulaire et robuste ^7,8 de développement des forces. Ces muscles possèdent un grand nombre de mitochondries qui occupent souvent jusqu'à 20 à 40% du volume total de la pile et qui sont "fixées" entre ^deux myofilaments.

Malgré de nombreuses études, notre compréhension de la régulation de la fonction mitochondriale, notamment in vivo et dans des conditions physiologiquement pertinents, est limitée. Une des raisons est que la majorité des méthodes développées pour évaluer la fonction mitochondriale forte dans vitro ou ex approches in vivo, tels que la surveillance de la consommation d'oxygène des mitochondries isolées supplémentées avec des substrats artificiels, et la détermination indirecte de la fonction mitochondriale par l'intermédiaire morphologie (microscopie par exemple électrons), l'activité enzymatique (par exemple, l'activité aconitase), ou les taux d'ATP intracellulaire ^11.9 .

Récemment, de petites molécules fluorescentes indicateurs avec enrichissement mitochondrial rapport ont été appliquées à fournir un aperçu des signaux mitochondriaux, y compris le potentiel de membrane, de calcium et d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), dans des cellules intactes ^11-13. En outre, plusieurs protéine fluorescente verte (GFP) et les indicateurs redox à base de ROS ont été développés pour réaliser une évaluation plus précise de l'redox intracellulaire ou compartimentée signaux ROS ^14-16. Parmi cela, nous avons développé un indicateur codé génétiquement superoxyde, la protéine fluorescente jaune permuté circulaire, et Targeted dans les mitochondries (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP peut être excité à 405 ou 488 nm avec deux pics d'émission à 515 nm. L'émission à 488 nm excitation est particulièrement sensible à la superoxyde comme le montre précédente in vitro et in vivo étalonnages ^17,18. L'émission à 405 nm excitation est utilisé comme contrôle interne (s'il vous plaît se référer à la figure 1 de la référence 17 pour des informations détaillées sur les spectres d'émission et d'excitation de mt-cpYFP dans diverses conditions). Avec time-lapse imagerie confocale, cet indicateur détecte l'éclatement des événements de production de superoxyde dismutase, nommés clignote, dans les mitochondries de simples cellules intactes. Superoxyde éclair sert une fonction composite de la respiration mitochondriale, d'accompagnement transitoire dépolarisation de la membrane mitochondriale et la production de ROS ^17-20. Récemment, nous avons généré les pan-tissus mt-cpYFP souris transgéniques en utilisant le vecteur pUC-CAGGS-mt-cpYFP ^17,19 sur C57/BL6 fond et vérifié les expres fortssion de cet indicateur dans le cœur, les muscles du squelette et d'autres tissus (figure 2). Les souris transgéniques sera disponible pour des chercheurs universitaires intéressés sur demande et d'approbation MTA par l'Université de Washington.

Dans cette étude, nous décrivons l'imagerie in situ des superoxydes clignote dans Langendorff perfusé coeur ainsi que l'imagerie in vivo des événements flash dans les muscles squelettiques de mt-cpYFP souris transgéniques anesthésiés ^17,19 en. Cette technologie permet la surveillance en temps réel de simples événements mitochondriaux de production de ROS dans un état ​​physiologiquement pertinent ou in vivo ^21,22. Il est également possible d'utiliser le système pour surveiller d'autres paramètres mitochondriaux simples tels que le potentiel de membrane et de calcium avec des indicateurs fluorescents appropriés. Évaluation plus, simultanément ou en parallèle de la fonction mitochondriale des événements intracellulaires (par exemple, les transitoires de calcium) ou la fonction cardiaque (par exemple,. Fraction d'éjection) peut être obtenue. Perturbations pathologiques tels que l'ischémie et de la reperfusion, peuvent être appliquées au cœur perfusé à évaluer l'impact du stress sur la fonction mitochondriale unique dans le myocarde intact.

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Protocole

Une. Expérience Préparation

1. Préparer la solution isotonique équilibrée de sel (50 ml) contenant: 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM de _CaCl2, 2 mM de _MgCl2 et 10 mM de HEPES (pH 7,2) pour l'imagerie du muscle squelettique in vivo.
2. Préparer 1 L de tampon Krebs-Henseleit (KHB) contenant: 118 mM de NaCl, KCl 5,3, 1,2 mM MgSO _4, EDTA 0,5 mM et 25 mM NaHCO _3.
3. La bulle KHB avec un gaz contenant 95% d'O _{2/5% de} CO2 pendant 10 à 15 min avant l'addition de 2 mM de _CaCl2. Ajouter substrats métaboliques (glucose par exemple 10 mM et de pyruvate 0,5).
4. Préparer les instruments chirurgicaux en stérilisant la pince, ciseaux, pinces et dans 70% d'éthanol et de rinçage dans le trou DDH ₂ O. stérilisé
5. Mettre en marche le système de perfusion cardiaque, régler la température sur le bain d'eau et de circulateur, régler la vitesse de la pompe péristaltique à 6 ml / min.
6. La bulle KHB avec 95% O ₂/ 5% de CO ₂ gazeux, et surveiller la vitesse d'écoulement et de la température (37 ° C, par une sonde de température à fibre optique) de l'effluent. Le système a besoin d'environ 20 min pour le gaz et la température équilibrage.

2. Imagerie confocale de muscles squelettiques in vivo

1. Anesthésier souris avec du pentobarbital (80 mg / kg, ip). L'animal va atteindre une anesthésie chirurgicale (pas de réponse au pincement de l'orteil) dans les 10 à 15 min et de rester dans cet état ​​pendant 1 à 1,5 heures, suffisante pour que l'imagerie in vivo des muscles squelettiques.
2. Enlever les poils sur l'un des membres postérieurs et stériliser la peau avec de l'éthanol 70%.
3. Faire une incision sur la peau le long de la face extérieure de la branche d'exposer les muscles gastrocnémiens.
4. Décrochez le épimysium doucement avec une forte pince et faire une incision à travers avec des ciseaux. Disséquer pour enlever la épimysium et exposer les fibres musculaires en dessous.
5. Pour le chargement de TMRM in vivo dans le squelettemuscle, comprennent TMRM (500 nM) dans la solution saline équilibrée isotonique à plonger muscle pendant 30 minutes et puis laver par une solution sans indicateur.
6. Mettre la souris sur le côté, sur le microscope confocal (Zeiss LSM 510) de phase et de retenir la patte arrière dans une position qui le muscle squelettique est exposée face contre la lamelle qui forme le fond de la chambre. La lamelle couvre-objet est entre le tissu musculaire et l'objectif inversée (à l'huile de 40X).
7. Appuyez sur la jambe doucement à prendre contact serré entre le tissu et la lamelle. Plonger les muscles exposés dans une solution isotonique de sel équilibrée.
8. Enregistrer deux dimensions (2D, xy) images confocales à un taux de une seconde par base de sondage. L'intensité de chaque pixel est numérisé à une profondeur de 8 bits. Habituellement, un balayage en série contient 100 images.
9. Recueillir des images séquentielles de première excitant à 405 nm et la collecte à> 505 nm à 488 nm, puis lors de la collecte à> 505 nm pour une longueur d'onde double excitation imagerie de mt-cpYFP. Utilisez excitation séquentielle à 405, 488 et 543 nm, et de recueillir émission à 505-545, 505-545 et> 560 nm, respectivement, pour le triple longueur d'onde d'excitation de l'imagerie mt-cpYFP et TMRM.

3. Imagerie confocale de coeur perfusé de souris

1. Immédiatement après l'imagerie in vivo des muscles squelettiques, injecter la souris avec 200 unités d'héparine (ip). Dix minutes plus tard, euthanasier la souris par thoracotomie et rapidement retirer le cœur avec les poumons et le thymus qui s'y rattachent.
2. Enlever rapidement le poumon dans un tampon glacée. Identifier les lobes du thymus et retirez délicatement pour exposer l'aorte ascendante.
3. Retirez le thymus et isoler l'aorte en enlevant soigneusement toute les tissus environnants.
4. Faites une entaille à l'extrémité supérieure de l'aorte ascendante avant la première branche de l'arc aortique.
5. Maintenez la paroi de l'aorte doucement avec deux micro pince de suture pour exposer la lumière et placer soigneusement l'aorte sur le cannula (PE50 tube). L'aorte est maintenu en place par un navire micro pince tandis que les sutures sont rapidement attachés autour de l'aorte.
6. Retirez la bride, vérifier soigneusement la canule avec une pince pour s'assurer que la pointe de la canule est au-dessus racine aortique. Liens supplémentaires sont ajoutés si nécessaire pour maintenir le coeur en place.
7. Tournez sur la pompe péristaltique et perfuser le coeur à 1 ml / min. Le cœur battant reprendra à perfusion.
8. Ajustez la position du système de perfusion et de mettre le coeur sur la platine du microscope. Le stade dispose d'un adaptateur qui permet le chauffage de la chambre qui tient au cœur.
9. Ajouter 1 ml de solution de perfusion dans la chambre de KHB à immerger partiellement le coeur. Surveiller la température de la chambre à 37 ° C. Retirer effluent provenant de la chambre à l'aide d'une pompe péristaltique.
10. Augmenter la vitesse de la pompe péristaltique progressivement pour assurer un écoulement suffisant (environ 2 ml / min) vers le coeur.
11. Après 10 minutes de stabilisation, perfuser la HEArt avec 10 uM et de 100 à 500 nM blebbistatin TMRM. Battement de coeur va ralentir après 10 min.
12. Appliquer une légère pression sur le coeur pour assurer un contact étanche avec le coeur de la lamelle au fond de la chambre et de supprimer davantage le rythme cardiaque.
13. Suivez la même procédure pour l'imagerie confocale de myocarde intact, comme décrit dans l'étape 2.8 ci-dessus. Réglez soigneusement le plan focal pour révéler l'image la plus claire possible.

4. Traitement de l'image et l'analyse des données

1. Utilisez les outils fournis par le module «Analyse physiologique" du logiciel confocal à analyser clignote et la membrane mitochondriale changements potentiels simples. Ce module est souvent inclus dans le logiciel d'acquisition d'image du système à foyer commun et permet la détermination de certaines zones de l'image ainsi que la sortie de l'intensité de fluorescence avec des étiquettes temporelles.
2. Ouvrez la base de données et le fichier d'image 2D série à analyser.
3. Cliquez sur le "Régiond'intérêt (ROI) signifie "pour basculer sur la" moyenne des ROI mode ". Cliquez sur le" région d'intérêt (ROI) signifie "pour passer en mode" moyenne de ROI ".
4. Désactiver l'affichage des autres canaux sauf le canal de cpYFP 488 nm pour sélectionner les éclairs.
5. Zoom dans l'image et déplacer manuellement barre de défilement pour lire les images 2D en série.
6. Identifiez simples mitochondriales superoxyde clignote en localisant le site où signal augmente transitoirement fluorescentes. Utilisez l'outil de ROI approprié pour marquer les éclairs. La trace montrant en fonction du temps de changement de fluorescence de chaque ROI sera affiché à côté de l'image.
7. Après avoir sélectionné tous les flashs, activer l'affichage des autres canaux. Sélectionner un retour sur investissement de l'image à l'extérieur de la cellule pour le fond de signal soustraction. La sortie de fluorescence moyenne de chaque ROI avec les étiquettes de temps.
8. Notez le nombre de bouffées dans chaque fichier image de balayage de série avec le temps de cycle et de la zone dela cellule. Utiliser Excel pour calculer la fréquence de flash comme nombre d'éclairs par 100 sec 1000 pm ² / zone de cellule.
9. Utilisez un programme développé sur mesure écrite en langue Interactive Data (IDL, ResearchSystems) pour calculer les paramètres de chaque flash (amplitude, temps au pic et de temps de décroissance). Logiciel IDL est disponible dans le commerce et le programme développé sur mesure pour l'analyse des paramètres du flash peut être obtenu à partir de l'auteur sur demande.

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Résultats

Selon ce protocole, l'imagerie in vivo des événements mitochondriaux simples peut être fait dans les muscles squelettiques de souris anesthésiées suivie par imagerie in situ coeur perfusé (figure 1) en. Le réglage optimal des conditions d'imagerie permettra d'assurer des images claires des tissus musculaires intactes et à la résolution de mitochondrie unique (figure 2). TMRM est souvent utilisé pour vérifier l'emplacement du mt-cpYFP...

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Discussion

Imagerie des événements mitochondriaux simples dans l'animal vivant ou organes perfusés a avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles pour évaluation de la fonction mitochondriale ^{17,19,21,22,24,25.} La technique décrite ici peut obtenir en temps réel la détermination in situ de la fonction mitochondriale dans un véritable état ​​physiologique à la résolution subcellulaire dans. Ceci est particulièrement utile, lorsque combinés à d'autres mesures,...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.