Automatisierte, Quantitative Kognition / Verhalten Screening der Mäuse: Für Genetik, Pharmakologie, Animal Cognition und Undergraduate-Unterricht

Zusammenfassung

Vollautomatisches System zur Messung physiologisch sinnvollen Eigenschaften der Mechanismen der Vermittlung räumliche Lokalisierung, zeitliche Lokalisierung, Dauer, Geschwindigkeit und Wahrscheinlichkeitsschätzung, Risikobewertung, Impulsivität und die Genauigkeit und Präzision der Erinnerung, um die Auswirkungen der genetischen und pharmakologischen Manipulationen bewerten grundlegenden Mechanismen der Kognition bei Mäusen.

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-, High-Volume, voll automatisiert, live-in 24/7 Verhaltenstestsystem für die Beurteilung der Auswirkungen von genetischen und pharmakologischen Manipulationen zu den grundlegenden Mechanismen der Wahrnehmung und des Lernens in Mäusen. Ein Standard-Polypropylen-Maus Gehäusewanne wird durch eine Acrylröhre in eine handelsübliche Maus Test-Box verbunden. Das Testfeld hat drei Trichtern, 2 davon sind mit Pellet-Feeder. Alle sind intern beleuchtbar mit einer LED und durch Infrarot (IR) für Kopf-Einträge überwacht Balken. Mäuse leben in der Umgebung, die Handhabung beim Screening eliminiert. Sie erhalten ihre Nahrung während zwei oder mehr tägliche Fütterung Zeiten, indem in der operanten (instrumental) und Pawlowschen (klassische)-Protokolle, für die wir geschrieben haben, Protokoll-Steuersoftware und Quasi-Echtzeit-Datenanalyse-und Grafiksoftware. Die Datenanalyse-und Grafikroutinen sind in einer MATLAB-basierte Sprache erstellt, um stark vereinfachen die Analyse von großen Zeit-s geschriebenStampfverhaltensmäßigen und physiologischen Ereignisdatensätze und eine vollständige Datenpfad von Rohdaten über alle Zwischen Analysen zu den veröffentlichten Grafiken und Statistiken in einer einzigen Datenstruktur zu bewahren. Die Datenanalysecode erntet die Daten mehrmals am Tag und unterwirft sie statistische und grafische Auswertungen, die automatisch in der "Wolke" in-lab Computer gespeichert werden und auf. Daher wird der Fortschritt der einzelnen Mäusen visualisiert und quantifiziert täglich. Die Daten-Analyse-Code spricht mit dem Protokoll-Steuercode und ermöglicht die automatisierte Nachnahme Protokoll zu Protokoll der einzelnen Themen. Die Verhaltensprotokolle implementiert passenden, autoshaping, Zeitschalt Trichter-, Risikobewertung im Zeit Trichter-Schalt, Impulsivität Messung und der circadianen Vorfreude auf die Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln. Open-Source-Protokoll-Steuerung und Datenanalyse-Code macht die Zugabe von neuen Protokollen einfach. Acht Testumgebungen passen in eine 48 x 24 x 78 in Schrank, zwei solche Kabineinets (16 Umgebungen) kann durch einen Computer gesteuert werden.

Einleitung

Um die leistungsfähigen Techniken der Genetik, Molekulargenetik, Molekularbiologie und Neuropharmakologie zu bringen, um auf die Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen, die grundlegenden Mechanismen der Erkenntnis vermitteln zu tragen, brauchen wir High-Volume-, Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, die psychophysischen physiologisch sinnvoll zu quantifizieren Eigenschaften von kognitiven Mechanismen. Ein psychophysisch messbare physiologische sinnvolle quantitative Eigenschaft eines Mechanismus ist eine Eigenschaft, die von Verhaltens Mittel, durch elektrophysiologische oder biochemische Mittel gemessen und auch werden kann. Beispiele sind das Absorptionsspektrum von Rhodopsin, die freilaufende Periode der circadianen Uhr und die Refraktärzeit der Belohnung Axone im medialen Vorderhirnbündel ^1,2. Psychophysikalische Messungen, die zellulären und molekularen Messungen verglichen werden können, eine Grundlage für die Verknüpfung von zellulären und molekularen Mechanismen, die psychologischen Mechanismen, durch quantitative Korrespondenz. Für example, die Tatsache, dass die in situ-Absorptionsspektrum des Rhodopsin in Stäbchenaußensegmenten überlagert auf den menschlichen skotopischen spektrale Empfindlichkeitsfunktion gibt starke Hinweise, dass das Photon ausgelöste Isomerisierung von Rhodopsin ist der erste Schritt bei skotopischer. Die quantitativen Aspekte der komplexen Verhaltensmuster sind auch zentral für die Nutzung von QTL-Methoden in der Verhaltensgenetik ^3,4.

Die Leistung von Mäusen (und Ratten) auf etablierten Instrumental-und Pawlowschen Lernprotokolle hängt von Gehirnmechanismen, die abstrakte Größen wie die Zeit messen, die Anzahl, Dauer, Geschwindigkeit, Wahrscheinlichkeit, Risiko und räumliche Lage. Beispielsweise die Geschwindigkeit der Akquisition von Pavlovian bedingter Reaktionen hängt von dem Verhältnis zwischen dem durchschnittlichen Abstand zwischen den Verstärkungs Ereignisse (typischerweise Lebensmittellieferungen) und der mittleren Latenz zur Bewehrung nach dem Einsetzen des Verstärkungssignals für bevorstehende ^5-7. Für eine zweite Blutzuckerwerle, das Verhältnis der durchschnittlichen Dauer der Besuche, zwei Aufgabetrichter in einem passenden Protokoll etwa gleich dem Verhältnis der Geschwindigkeiten der Verstärkung an diesen beiden Trichtern ^10.08.

Die Verhaltenstestverfahren derzeit im breiten Einsatz von Neurowissenschaftlern interessiert zugrunde liegenden Mechanismen sind zum größten Teil, geringes Volumen, geringe Durchlauf und arbeitsintensiv ^26. Außerdem haben sie keine Mengen, die mit durch elektrophysiologische und biochemische Verfahren Meßgrößen verglichen werden kann, zu messen, wie zum Beispiel können die verhaltens gemessenen Perioden und Phasen der zirkadianen Oszillatoren elektrophysiologische und biochemische Maßnahmen der zirkadianen Periode und Phase verglichen werden. Aktuelle Verhaltenstestverfahren konzentrieren sich auf Kategorien von Lernen, wie räumliches Lernen, Lernen zeitliche oder Angst lernen, anstatt auf zugrunde liegenden Mechanismen. Die weit verbreitete Wasserlabyrinth Test der räumlichen Lernen ^11-15 ist ein Beispiel für diesen shortcomings. Räumliche Lernen ist eine Kategorie. Lernen in dieser Kategorie hängt von vielen Mechanismen, von denen einer der Mechanismus der Koppel ^16,17. Koppelnavigation hängt wiederum auf dem Tacho, den Mechanismus, der Streckenlauf ¹⁸ misst. Ebenso ist eine zeitliche Lern ​​Kategorie. Eine innere Uhr gehört zu den Mechanismen auf dem Lernen in dieser Gruppe abhängig ist, da ein Oszillator mit einer etwa 24-Stunden-Zeitraum ist für die Tiere benötigt, um die Tageszeit, zu der Ereignisse auftreten ^17,19 erfahren. Die Uhr, die Nahrung ermöglicht Vorfreude noch zu ¹⁹ entdeckt werden.

Ein Takt ist eine Zeitmesseinrichtung. Endogene Oszillatoren mit einer Vielzahl von Perioden ermöglichen das Gehirn Ereignisse in der Zeit durch Aufzeichnung der Phasen dieser Uhren ^16,17 lokalisieren. Die Fähigkeit, Positionen in der Zeit aufzuzeichnen ermöglicht die Messung von Zeitdauern, dh Abstände zwischen Positionen in der Zeit. Assoziatives Lernen hängt von ter Messungen der Laufzeiten ^5,6,20,21 Gehirns. Zähler gibt Anzahl Messmechanismen. Anzahl Mess ermöglicht Wahrscheinlichkeitsschätzung, da eine Wahrscheinlichkeit, das Verhältnis zwischen der numerosity einer Teilmenge und dem numerosity des Ober. Anzahl Messdauer und Mess ermöglichen Ratenschätzung, da eine Rate ist die Anzahl der Ereignisse, geteilt durch die Dauer des Intervalls, über die die Zahl gemessen. Messungen der Dauer, Anzahl, Geschwindigkeit und Wahrscheinlichkeit ermöglichen Verhaltensanpassungen an veränderte Risiken. ^22,23 Unsere Methode konzentriert sich auf die Messung der Genauigkeit und Präzision dieser grundlegenden Mechanismen. Genauigkeit ist das Ausmaß, in dem das Gehirn die Maßnahme entspricht einem objektiven Maßstab. Präzision ist die Variation oder Unsicherheit im Gehirn die Maßnahme von einem festen objektiven Wert, beispielsweise eine feste Dauer. Weber-Gesetz ist die älteste und sicher etabliert Ergebnis in der Psychophysik. Sie behauptet, dass die Genauigkeit derGehirn Maß einer Menge ist ein fester Bruchteil dieser Menge. Die Weber-Fraktion, die die Statistiker der Variationskoeffizient in einer Verteilung (σ / μ), misst Präzision. Das Verhältnis der psychophysischen Mittel (z. B. bedeuten, beurteilt Dauer) auf das Ziel Mittelwert (Mittelwert Ziel Dauer) ist das Maß der Genauigkeit.

Das hier vorgestellte Verfahren maximiert Volumen (Anzahl der Tiere, die zu einem beliebigen Zeitpunkt in einer gegebenen Menge von Laborraum abgeschirmt) und Durchsatz (Menge an Informationen erhalten, dividiert durch die mittlere Dauer der Überprüfung von einem einzigen Tier) bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Human Arbeit erforderlich, um die Messungen zu machen und die Maximierung der Unmittelbarkeit, mit der die Ergebnisse des Screening bekannt geworden.

Die Daten-Analyse-Software-Architektur stellt hier vorge automatisch die Rohdaten und all die Zusammenfassung der Ergebnisse und Statistiken aus der Daten zusammen in einer einzigen d abgeleitetata Struktur, mit Feldüberschriften, die verständlich die Weltmeere von Zahlen machen darin enthalten sind. Die analytische Software arbeitet nur Daten in dieser Struktur und speichert jeweils die Ergebnisse ihrer Operationen in Bereichen innerhalb derselben Struktur. Dies gewährleistet eine intakte Weg von Rohdaten zu veröffentlichen Zusammenfassungen und Grafiken.

Die Software schreibt automatisch in die Struktur der Experiment-Kontrollprogramme, die die vollautomatische Prüfung geregelt, und es wird automatisch angezeigt, welche Rohdaten aus, welches Programm kam. So bewahrt sie eine tadellose Datenspur, ohne Zweifel, auf die experimentellen Bedingungen in Kraft waren, für jedes Tier an jedem Punkt in der Prüfung und keinen Zweifel daran, wie die zusammenfassende Statistiken wurden aus den Roh-Daten abgeleitet. Diese Methode der Datensicherung erleichtert die Entwicklung von standardisierten Verhaltens Screening-Datenbanken, die es ermöglicht, anderen Labors weiter zu analysieren, diese reichen von Datensätzen.

Dieses Verfahren minimiert das Risiko von Verlust der Unterstützung für die Firmware und Software von denen es abhängt. Das Prüfgerät ist trivialerweise aus einer alteingesessenen Handelsquelle modifiziert. Die Programmiersprachen sind die individuelle Sprache, die von der Hardware-Hersteller, für die Protokollsteuerung vorgesehen, und für die Datenanalyse und Grafik, ein speziell angefertigtes, nicht kommerziellen Open-Source-Werkzeugkasten (TSsystem) in einem sehr weit unterstützt Handels wissenschaftliche Programmierung, Daten geschrieben Analyse-und Grafiksprache. Die Toolbox enthält High-Level-Befehle für das Extrahieren von Strukturinformationen und Auswertungsstatistiken von langwierigen Zeitstempel versehen Ereignisdatensätze. Die Protokoll-Umsetzung der Programme und die Daten-Analyse-Programme sind Open-Source und gründlich dokumentiert.

Das Screening-System ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Zehn Schränke, können mit jeweils 8 Testumgebungen in einem 10 ft x 15 ft Laborraum eingerichtet werden, so dass 80 Mäuse to gleichzeitig ausgeführt werden. Kabel durch eine Öffnung in einer Wand Partei sollte die Umgebungen der elektronischen / elektrischen Schnittstellenkarten und PCs in einem anderen Raum zu verbinden. Die PCs laufen die Protokoll-Steuerprogramme. Ein Computer ist für alle 2 Schränke (16 Testumgebungen) erforderlich. Die PCs sind über ein Local Area Network auf einem Server mit der Datenanalyse und Grafik-Software verbunden werden.

Protokoll

Die drei voll automatisierten Protokolle in der TSsystem (Matching, appetitive Instrumental-und klassische Konditionierung) und der Switch-Protokoll wurden von der Tierpflege und Einrichtungen Ausschuss an der Rutgers New Brunswick genehmigt worden.

1. Einrichten des physikalischen Systems

1. Bis die Testumgebungen in den Schränken (siehe Abbildung 1).
2. Installieren Sie das Experiment-Steuersoftware mit den Testumgebungen auf den Protokoll-Steuerrechner zur Verfügung gestellt.
   Hinweis: diese Computer nicht verwenden für andere Zwecke!

2. Einrichten der Software System

1. Richten Sie die LAN (local area network), so dass der Server, auf dem Daten-Analyse-Software installiert ist, kann die Festplatten des Computers (s), die die Testumgebungen (siehe Abbildung 1) zugreifen.
2. Stellen Sie die Datei-Synchronisation-Konto für die Datenspeicherung in der "Wolke".
3. Put den Ordner TSsystem und seinen Unterordnern auf dem Suchpfad des Handels Programmiersprache in einem Cloud-Ordner synchronisiert.
   Hinweis: Die TSsystem ist ein Software-Werkzeugkasten, das heißt, eine Bibliothek von über 30 High-Level-Funktionen, die das Erstellen von komplexen Datenanalyse-und Datengrafikcode zu erleichtern, die automatisch verarbeitet die Daten, wann immer es von den Ausgabedateien erzeugt geerntet das Experiment-Steuerprogramms. Alle Befehle wirken auf Daten in Feldern des Experiments Struktur und stellen die Ergebnisse in anderen Bereichen in der gleichen Struktur (siehe Fig. 2). Diese Open-Source-Befehle werden in einer der am häufigsten verwendeten kommerziellen wissenschaftlichen Programmierung und Grafik-Sprachen geschrieben. Es hat viele andere "Werkzeugkästen", darunter die meisten sinn einem Statistik-Toolbox.

3. Starten eines Experiment

1. Rufen TSbegin (siehe Abbildung 3).
   Hinweis: TSbegin ist ein interactive GUI (G matogra phische U ser I nterface) in der TSsystem Toolbox. Es führt den Benutzer durch den Prozess der Erstellung der hierarchischen Datenstruktur, in die die Rohdaten und alle Ergebnisse daraus abgeleitet werden von den anderen Funktionen in der Toolbox TSsystem platziert werden.
2. Rufen TSaddprotocol (siehe Abbildung 4).
   Hinweis: TSaddprotocol ist ein GUI in der TSsystem Toolbox. Es führt den Benutzer durch den Prozess der Regelparameter für die Angabe einer Versuchsprotokoll unter Angabe Entscheidung Code, der die Entscheidung, das Protokoll zu beenden und gehen auf die nächste automatisieren und Angabe der Entscheidungskriterien verwendet werden.
3. Zeigen Mäuse in den 24/7 Live-in Testumgebungen, eine Maus pro Umwelt.
   Hinweise: Achten Sie darauf, beachten Sie die ID-Nummer der Maus, die in jede der nummerierten Testumgebungen (Box 1, Box 2, etc.) geht. Beachten Sie auch, den Brief, den das Experiment-Steuerung identifiziertComputer im lokalen Netzwerk (LAN) und die IP-Adresse.
4. Nennen TSstartsession (Abbildung 5).
   Hinweis: TSstartsession ist ein GUI in der TSsystem Toolbox. Es führt den Benutzer durch den Prozess des Startens eines experimentellen Sitzung. Experimentelle Sitzungen dauern ein oder zwei Wochen, in denen mehrere verschiedene Verhaltenstests Protokolle ausgeführt werden. TSstartsession speichert die Informationen, die in das Makro, das Protokoll-Steuersoftware liest, wenn eine Sitzung gestartet geht. Eingeschlossen ist der Pfad und Name der Code-Datei, die der Protokoll-Steuersoftware liest. TSsystem der analytischen Software liest den Code in das hierarchische Datenstruktur, so dass es nie Zweifel über den genauen Protokoll in Kraft zu jeder Zeit.
5. Gehen Sie auf die Steuerungsrechner und rufen Sie die Makros des MedPC Ordner geschrieben, um die Sitzung für die Boxen von diesem Computer gesteuert starten.

4. Datenanalyse

1. Wenn Sie ein neues Protokoll erstellt haben, schreiben Sie geeignete Daten-Analyse-und Grafikcode mit Hilfe der Befehle in der TSsystem Toolbox, die erheblich vereinfachen die Erstellung von komplexen Datenanalysen.
   Hinweis: Die Daten-Analyse-und Grafikcode für die drei Protokolle, deren Ergebnisse im Folgenden beschrieben werden in der TSsystem Toolbox enthalten. Denn sie sind Open Source, können sie nach Belieben modifiziert werden. Der Code für diese Analysen ist ausführlich kommentiert, die es einfacher, um Code für die Analyse der Ergebnisse von Benutzer angegebene Protokolle zu erstellen macht.
2. Für die Dauer des Experiments (24 h bis viele Wochen), E-Mail-Überwachung für Benachrichtigungen vom Server anzeigt, Fehlfunktionen möglich Anlagen (Stromausfälle, spontan, Steuer-Computer neu gestartet, Pellet-Zufuhrstörungen, etc.), die der TSsystem Daten-Analyse Programm erkennt.
3. Studieren Sie die Grundleistung, dass die Daten-Analyse-Code in TSsystem geschrieben produziert jedes Mal, es wird von th genannte Analyse Timer (typischerweise 2-4 mal / Tag).
   Hinweis: Die Analyse Timer ruft die Datenanalyse-und Grafikprogramm an benutzerspezifischen Abständen. Das aufgerufene Programm mit Funktionen TSsystem geschrieben. Er liest in der hierarchischen Datenstruktur, die Rohdaten aus der Datei, auf die das Protokoll-Steuerungssoftware schreibt geerntet. Dann analysiert die Daten und Abbildungen sind die Ergebnisse der Analysen. Die Datei mit dem hierarchischen Datenstruktur wird in einer Datei-Synchronisation Ordner in der Cloud gespeichert. Dies sorgt für die automatische Offsite-Backup. Die automatische Dateisynchronisierung speichert Kopien der Strukturdatei auf den Computern aller Personal und Mitarbeiter, die Zugriff gewährt haben. Spezifizierte Grafiken werden automatisch auf schriebene Personal und Mitarbeiter per E-Mail. Ein Hauptforscher können den Fortschritt der Prüfung von jedem Ort der Welt zu jeder Zeit zu überwachen und, wenn nötig, zu revidieren die Versuchsprotokoll, auf Linie, von der Remote-site, wo die Mäuse getestet.
4. Verwenden TSbrowser, um die Daten-und Auswertungsstatistiken in der hierarchischen Datenstruktur zu studieren, wie sie geworden sind, in quasi Echtzeit (siehe Abbildung 2).

Ergebnisse

Das System kann und sollte verwendet werden, um Protokolle, um die Ziele der einzelnen Prüfer oder Klassenlehrer zugeschnitten ausgeführt werden. Das passende Protokoll, das 2-Trichter autoshaping Protokoll, und der Switch-Protokoll: Wir haben jedoch eine Reihe von 3-Protokolle, die bei großen Screening von genetisch manipulierten Mäusen und Groß pharmakologischen Tests beweisen entwickelt. Der passende Protokoll misst die Kapazität der Maus, die Einkommen (Futterpellets pro Zeiteinheit) an zwei verschiedenen Orte...

Diskussion

Unsere Methode liefert eine Vielzahl von physiologischen sinn, quantitative Ergebnisse über die Funktionsweise der verschiedenen Mechanismen der Kognition, Lernen und Gedächtnis, für viele Mäuse auf einmal, in einer minimalen Menge an Zeit mit einem Minimum an menschlicher Arbeitskraft, und ohne Behandlung der Versuchspersonen während der Tage, Wochen oder Monaten der Prüfung. Diese Attribute passen sie für die genetische und pharmakologische Screening-Programme. Es nutzt minimal modifiziert off-the-shelf Hardwar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartCtrl Connection Panel	Med Associates	SG-716B (115)	control panel for inputs/outputs
SmartCtrl Interface Module	Med Associates	DIG-716B (114)	smart card for each chamber
Universal Cable	Med Associates	SG-210CB (115)	cable from smart card to control panel
Tabletop Interface Cabinet	Med Associates	SG-6080C (109)	cabinet to hold smart cards
Rack Mount Power Supply	Med Associates	SG-500 (112)	28 volt power
Wide Mouse Test Chamber	Med Associates	ENV-307W (31)	test chamber
Filler Panel Package	Med Associates	ENV-307W-FP (32)	various-size panels for test chamber
Wide Mouse Modular Grid Floor	Med Associates	ENV-307W-GF (31)	test chamber floor grid
Head Entry Detector	Med Associates	ENV-303HDW (62)	head entry/pellet entry into hopper
Pellet Dispenser	Med Associates	ENV-203-20 (73)	feeder
Pellet Receptacle	Med Associates	ENV-303W (61)	hopper
Pellet Receptacle Light	Med Associates	ENV-303RL (62)	hopper light
House Light	Med Associates	ENV-315W (43)	house light
IR Controller	Med Associates	ENV-253B (77)	entry detector for tube between nest and test
Fan	Med Associates	ENV-025F28 (42)	exhaust fan for each chamber
Polypropylene Nest Tub			nest box
Acrylic Connection Tube			connection between nest and test areas
Steel Cabinet			cabinet to hold test chambers (78"H, 48"W, 24"D)
Windows computer			running MedPC experiment-control software
Server			running Matlab, linked to exper-control computer by LAN
Software
MedPC software	Med Associates		proprietary process-control programming language
Matlab w Statistics Toolbox	Matlab		proprietary data analysis and graphing programing system
TSsystem		in Supplementary Material w updates from senior author	Open-source Matlab Toolbox
Note: This is the euipment needed for one cabinet, containing 8 test environments. Hardware must be replicated for each such cabinet. However one computer can control 2 cabinets (16 test environments)