Automatizada, Quantitative Cognitiva / Screening Comportamental de Ratos: Para Genética, Farmacologia, Cognição Animal e Instrução Graduação

Resumo

Sistema totalmente automatizado para a medição de propriedades fisiologicamente significativas dos mecanismos de mediação de localização espacial, localização temporal duração, taxa e estimativa de probabilidade, avaliação de risco, impulsividade e da exatidão e precisão da memória, a fim de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas sobre mecanismos fundamentais da cognição em camundongos.

Resumo

Descreve-se um alto rendimento, de alto volume, totalmente automatizado, live-in 24/7 sistema de testes comportamentais para avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas sobre os mecanismos básicos da cognição e aprendizagem em ratos. Um rato de polipropileno banheira habitação padrão está ligado através de um tubo de acrílico para uma caixa de teste de mouse padrão comercial. A caixa de teste tem três funis, 2 dos quais estão ligados a pelota alimentadores. Todos são iluminado interiormente com um diodo emissor de luz e monitorizado para a entrada da cabeça por infravermelhos (IR) vigas. Ratos viver no ambiente, o que elimina a manipulação durante a triagem. Eles obtêm seus alimentos durante dois ou mais períodos de alimentação diárias realizando em operante (instrumental) e pavloviana protocolos (clássicos), para o qual temos escrito software de controle de protocolo e em tempo quase real, análise de dados e gráficos software. A análise dos dados e gráficos rotinas são escritos em uma linguagem baseada em MATLAB criado para simplificar a análise do grande tempo-ssocada registros de eventos fisiológicos e comportamentais e preservar uma trilha de dados completa de dados brutos por meio de todas as análises intermédias para os gráficos e estatísticas publicadas dentro de uma única estrutura de dados. O código-análise de dados colhe os dados várias vezes ao dia e submete a análises estatísticas e gráficos, que são automaticamente armazenados na "nuvem" e em computadores de laboratório. Assim, o progresso de ratinhos individuais é visualizado e quantificado por dia. O código-análise de dados de fala com o código de controle de protocolo, permitindo o avanço automático de protocolo para protocolo de sujeitos individuais. Os protocolos comportamentais implementadas estão combinando, autoshaping, programado hopper-switching, avaliação de risco em cronometrado hopper-switching, medição de impulsividade, ea antecipação circadiano da disponibilidade de alimentos. Open-source protocolo de controle e análise de dados de código faz a adição de novos protocolos simples. Oito ambientes de teste caber em um 48 em x 24 em x 78 em gabinete, dois como táxiinets (16 ambientes) pode ser controlado por um computador.

Introdução

Para trazer as poderosas técnicas da genética, genética molecular, biologia molecular e neurofarmacologia para carregar em elucidar os mecanismos celulares e moleculares que medeiam mecanismos básicos da cognição, precisamos de alto volume, métodos de rastreio psicofísicos alta colocá-through que quantificam fisiologicamente significativa propriedades dos mecanismos cognitivos. Uma propriedade psicofisicamente mensurável, fisiológico significativo quantitativo de um mecanismo é uma propriedade que pode ser medido por meio de comportamento e também por meios bioquímicos ou electrofisiológicos. Exemplos disso são o espectro de absorção da rodopsina, o período livre de funcionamento do relógio circadiano, eo período refratário de axônios de recompensa no cérebro anterior medial ^1,2 pacote. Medições psicofísicas que podem ser comparados com as medidas celulares e moleculares estabelecer uma base para a ligação de mecanismos celulares e moleculares de mecanismos psicológicos por meio de correspondência quantitativa. Para example, o facto de que o espectro de absorção in situ da rodopsina dos segmentos exteriores das hastes sobrepõe sobre a função de sensibilidade espectral escotópica humana é uma forte evidência de que a isomerização de rodopsina desencadeada fotões é o primeiro passo para a visão escotópica. Os aspectos quantitativos dos padrões de comportamento complexos também são fundamentais para o uso de métodos de QTLs em genética comportamental ^3,4.

O desempenho de ratos (e ratos) em protocolos de aprendizagem instrumental e pavlovianas bem estabelecidos depende de mecanismos cerebrais que medem quantidades abstratas como o tempo, número, duração, taxa, probabilidade, risco e localização espacial. Por exemplo, a velocidade de aquisição de respostas condicionadas Pavlovianos depende da relação entre o intervalo médio entre os eventos de reforço (tipicamente, entrega de comida) e a latência média ao reforço após o início do sinal de reforço iminente ^5-7. Por um segundo example, o rácio entre a duração média das visitas aos dois funis de alimentação de acordo com um protocolo correspondente aproximadamente igual a relação entre as taxas de reforço nesses dois funis ^8-10.

Os métodos de análise comportamental atualmente em uso de largura por neurocientistas interessados ​​em mecanismos subjacentes são, em sua maior parte, de baixo volume, de baixo ciclo produtivo e trabalho intensivo ^26. Além disso, eles não medir quantidades que podem ser comparadas com as quantidades medidas através de métodos electrofisiológicos e bioquímicos, tal como, por exemplo, os períodos de medição comportamentalmente e fases de osciladores circadianos pode ser comparado com medidas electrofisiológicos e bioquímicos de período circadiano e fase. Métodos de análise de comportamento atuais concentrar em categorias de aprendizagem, tais como a aprendizagem espacial, temporal, aprendizagem ou medo de aprendizagem, em vez de sobre os mecanismos subjacentes. O teste do labirinto aquático utilizado de aprendizagem espacial ^11-15 é um exemplo dessas shortcomings. Aprendizagem espacial é uma categoria. Aprender nessa categoria depende de muitos mecanismos, um dos quais é o mecanismo da conta inoperante ^16,17. Estima-se, por sua vez depende do hodômetro, o mecanismo que mede a distância percorrida ^18. Da mesma forma, a aprendizagem temporal é uma categoria. Um relógio circadiano está entre os mecanismos em que a aprendizagem em que categoria depende, por um oscilador com um período de cerca de 24 horas é necessário para os animais aprendem a hora do dia em que os eventos ocorrem ^17,19. O relógio que permite a antecipação de alimentos tem ainda a ser descoberto ^19.

Um relógio é um mecanismo de medição de tempo. Osciladores endógenos com uma vasta gama de períodos de permitir que o cérebro para localizar eventos em tempo através da gravação das fases destes relógios ^16,17. A capacidade de gravar localizações no tempo permite a medição da duração, isto é, as distâncias entre os locais em tempo. Aprendizagem associativa depende de tele medições do cérebro de durações ^5,6,20,21. Contadores são mecanismos de números de medição. Número de medição permite estimar a probabilidade, porque a probabilidade é a proporção entre a numerosidade de um subconjunto ea numerosidade do superconjunto. Medição número e duração de medição permitir estimar a velocidade de, por causa de uma taxa é o número de eventos, dividida pela duração do intervalo durante o qual o número foi medido. Medidas de duração, número, taxa e probabilidade permitir ajustes comportamentais para mudança riscos. ^22,23 Nosso método concentra-se em medir a precisão e exatidão desses mecanismos fundamentais. A precisão é o grau em que a medida do cérebro corresponde a uma medida objetiva. A precisão é a variação ou incerteza na medida do cérebro de um valor objectivo fixado, por exemplo, uma duração fixa. A lei de Weber é o resultado mais antigo e mais firmemente estabelecida em psicofísica. Ele afirma que a precisão domedida do cérebro de uma quantidade é uma fração fixa de que quantidade. A fração de Weber, que é o coeficiente de estatístico da variação em uma distribuição (σ / μ), mede precisão. A relação entre a média psicofísica (por exemplo, a duração média julgado) para a média objetivo (média duração objetiva) é a medida de precisão.

O método aqui apresentado maximiza o volume (número de animais selecionados a qualquer momento em uma determinada quantidade de espaço de laboratório) e throughput (quantidade de informações obtidas dividido pela duração média do exame de um único animal), minimizando a quantidade de recursos humanos trabalho necessário para fazer as medições e maximizando a rapidez com que os resultados da despistagem tornou conhecido.

A arquitetura de software de análise de dados aqui apresentado coloca automaticamente os dados brutos e todos o resumo dos resultados e estatísticas derivadas dos dados juntos em um único destrutura ata, com títulos de campo que processam inteligíveis os vastos mares de números nele contidas. O software de análise só funciona em dados em que a estrutura, e sempre armazena os resultados de suas operações em campos dentro dessa mesma estrutura. Isto garante uma trilha intacta a partir de dados brutos para resumos e gráficos publicados.

O software grava automaticamente para a estrutura dos programas de controlo da experiência que reguladas a testes totalmente automatizado, e indica que os dados brutos automaticamente veio a partir do qual programa. Assim, ele preserva uma trilha de dados impecável, sem nenhuma dúvida a respeito de que condições experimentais estavam em vigor para cada animal em cada ponto no teste e não há dúvida sobre a forma como as estatísticas de resumo foram obtidas a partir dos dados brutos. Este método de preservação de dados facilita muito o desenvolvimento de bases de dados de rastreamento de comportamento padronizados, tornando possível que outros laboratórios para análise destes conjuntos de dados ricos.

Este método minimiza o risco de perda de apoio para o firmware e software do qual ele depende. O aparelho de ensaio é trivialmente modificado a partir de uma fonte comercial de longa data. As linguagens de programação são a linguagem personalizado fornecido pelo fabricante do hardware, para o controle de protocolo e, para a análise de dados e gráficos, uma, não comercial, caixa de ferramentas de código aberto construído para o efeito (TSsystem) escrito em uma programação científica comercial amplamente apoiado, os dados análise e linguagem gráfica. A caixa de ferramentas contém comandos de alto nível para a extração de informações estruturais e estatísticas de resumo de registros de eventos com carimbo de tempo longo. Os programas de implementação de protocolo e os programas de análise de dados são de código aberto e totalmente documentado.

O sistema de rastreio é esquematizada na Figura 1. Dez armários, cada um contendo oito ambientes de teste podem ser criados em um 10 pés x 15 pés sala de laboratório, permitindo que 80 ratos to ser executado ao mesmo tempo. Cabos que passam através de uma porta em uma parede partido deve conectar os ambientes para os cartões eléctricos / electrónicos de interface e PCs em outra sala. Os PCs executar os programas de controle de protocolo. Um computador é necessário para cada 2 armários (16 ambientes de teste). Os PCs devem ser ligados através de uma rede local para um servidor que execute o-análise de dados e gráficos software.

Protocolo

Os três protocolos totalmente automatizados no TSsystem (correspondência, apetitivo condicionamento instrumental e clássica) eo protocolo de comutação foram aprovados pelo Comitê de Animal Care e Instalações em Rutgers New Brunswick.

1. Configurando o sistema de física

1. Configure os ambientes de teste nos armários (ver Figura 1).
2. Instale o software de controle de experiência fornecido com os ambientes de teste nos computadores de controle de protocolo.
   Nota: Não use esses computadores para qualquer outra finalidade!

2. Configurando o Sistema de Software

1. Configure a LAN (local area network) de modo que o servidor no qual o software de análise de dados está instalado pode acessar os discos rígidos do computador (s) que controlam os ambientes de teste (ver Figura 1).
2. Estabelecer uma conta de sincronização de arquivo para armazenamento de dados na "nuvem".
3. Put a pasta TSsystem e suas subpastas no caminho de busca da linguagem de programação comercial em uma pasta sincronizada em nuvem.
   Nota: O TSsystem é uma caixa de ferramentas de software, que é, uma biblioteca de mais de 30 funções de alto nível, que facilitam a criação de um complexo de análise de dados e gráficos, dados de código que processa automaticamente os dados sempre que é colhido a partir dos ficheiros de saída gerados pela o programa de controle de experimento. Todos os comandos para operar em campos de dados da estrutura Experimento e colocar os resultados em outros campos na mesma estrutura (ver Figura 2). Estes comandos de código aberto são escritos em uma das linguagens de programação científica e gráficos comerciais mais utilizados. Tem muitas outras "caixas de ferramentas", incluindo mais útil uma caixa de ferramentas estatísticas.

3. Começar um Experimento

1. Chame TSbegin (ver Figura 3).
   Nota: TSbegin é um interactive GUI (G raphic U SER I Nterface) na caixa de ferramentas TSsystem. Isso leva o usuário através do processo de criação da estrutura de dados hierárquica em que os dados brutos e todos os resultados dele derivados serão colocados por outras funções na caixa de ferramentas TSsystem.
2. Chame TSaddprotocol (ver Figura 4).
   Nota: TSaddprotocol é um GUI na caixa de ferramentas TSsystem. Isso leva o usuário através do processo de especificação parâmetros de controle para um protocolo experimental, especificando código decisão que irá automatizar a decisão de denunciar o protocolo e ir para o próximo, e especificar os critérios de decisão a ser utilizado.
3. Coloque ratos em 24/7 ambientes de teste ao vivo-in, um rato por ambiente.
   Notas: Tome cuidado de anotar o número de identificação do mouse que vai para cada um dos ambientes experimentais numeradas (Caixa 1, caixa 2, etc.) Além disso, observe a letra que identifica o controle de experiênciacomputador na rede de área local (LAN) e seu endereço IP.
4. Chamar TSstartsession (Figura 5).
   Nota: TSstartsession é um GUI na caixa de ferramentas TSsystem. Isso leva o usuário através do processo de iniciar uma sessão experimental. Sessões experimentais durar uma ou duas semanas, durante as quais vários protocolos de testes de comportamento diferentes são executados. TSstartsession armazena as informações que vai para a macro que o software de controle de protocolo lê quando uma sessão é iniciada. Incluído é o caminho eo nome do arquivo de código que o software de controle de protocolo lê. Software de análise de TSsystem lê este código para a estrutura de dados hierárquica, de modo que nunca há dúvidas quanto à exata protocolo em vigor a qualquer momento.
5. Ir para os computadores de controle e chamar as macros escritas para a pasta MedPC, a fim de iniciar a sessão para as caixas controladas por computador.

4. Análise de Dados

1. Se você tiver criado um novo protocolo, escreva-análise de dados apropriado e código de gráficos usando os comandos na caixa de ferramentas TSsystem, que simplificam muito a criação de dados complexas análises.
   Nota: Os dados de análise de código e representação gráfica para os três protocolos, cujos resultados são descritos abaixo estão incluídos na caixa de ferramentas TSsystem. Porque, eles são de código aberto, que pode ser modificado à vontade. O código para estas análises é amplamente comentado, o que torna mais fácil para criar o código para analisar os resultados dos protocolos especificados pelo usuário.
2. Para a duração do experimento (24 horas a muitas semanas), monitorar e-mail para os alertas do servidor, indicando mau funcionamento possível de equipamentos (falhas de energia, reboots espontâneos, controle por computador, falhas de alimentação da pelota, etc), que a análise de dados-TSsystem programa detecta.
3. Estude as parcelas de desempenho que o código de análise de dados escrito em TSsystem produz cada vez que é chamado por diatemporizador de análise e (tipicamente 2-4 vezes / dia).
   Nota: O temporizador de análise chama a análise de dados e gráficos do programa em intervalos especificados pelo usuário. O chamado programa é escrito com as funções em TSsystem. Lê-se na estrutura de dados hierárquica dos dados brutos colhidos a partir do arquivo para o qual o software de controle de protocolo escreve. Em seguida, analisa-se os dados e gráficos dos resultados das análises. O arquivo que contém a estrutura de dados hierárquica é armazenado em uma pasta de sincronização de arquivos na nuvem. Isto fornece backup automático off-site. Os automáticos de sincronização de arquivo armazena cópias do arquivo de estrutura nos computadores de todos os funcionários e colaboradores que tenham obtido acesso. Especificados gráficos são automaticamente enviadas para o pessoal especializado e colaboradores. Um investigador principal pode monitorar o progresso dos testes a partir de qualquer lugar do mundo a qualquer momento, e, se necessário, rever o protocolo experimental, na linha, distante do site em que os ratos são testados.
4. Use TSbrowser para estudar os dados e as estatísticas de resumo da estrutura hierárquica de dados à medida que se tornarem disponíveis, em tempo quase real (ver Figura 2).

Resultados

O sistema pode e deve ser usado para executar os protocolos adaptados aos objectivos do investigador individual ou de professor em sala de aula. No entanto, temos desenvolvido um conjunto de três protocolos que devem ser úteis na triagem em larga escala de ratos geneticamente manipulados e testes farmacológicos de grande escala: o protocolo de correspondência, o protocolo autoshaping 2-hopper, eo protocolo de comutação. O protocolo correspondente mede a capacidade do rato para estimar os rendimentos (peletes de al...

Discussão

Nosso método produz uma ampla gama de resultados fisiológicos significativos, quantitativos sobre o funcionamento dos diferentes mecanismos de cognição, aprendizagem e memória, para muitos ratos de uma vez, em um montante mínimo de tempo, com um mínimo de trabalho humano, e sem manuseio dos sujeitos experimentais, durante dias, semanas ou meses de teste. Estes atributos adequá-lo para programas de triagem genéticas e farmacológicas. Ele usa minimamente modificado hardware off-the-shelf (caixas de teste e banhe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartCtrl Connection Panel	Med Associates	SG-716B (115)	control panel for inputs/outputs
SmartCtrl Interface Module	Med Associates	DIG-716B (114)	smart card for each chamber
Universal Cable	Med Associates	SG-210CB (115)	cable from smart card to control panel
Tabletop Interface Cabinet	Med Associates	SG-6080C (109)	cabinet to hold smart cards
Rack Mount Power Supply	Med Associates	SG-500 (112)	28 volt power
Wide Mouse Test Chamber	Med Associates	ENV-307W (31)	test chamber
Filler Panel Package	Med Associates	ENV-307W-FP (32)	various-size panels for test chamber
Wide Mouse Modular Grid Floor	Med Associates	ENV-307W-GF (31)	test chamber floor grid
Head Entry Detector	Med Associates	ENV-303HDW (62)	head entry/pellet entry into hopper
Pellet Dispenser	Med Associates	ENV-203-20 (73)	feeder
Pellet Receptacle	Med Associates	ENV-303W (61)	hopper
Pellet Receptacle Light	Med Associates	ENV-303RL (62)	hopper light
House Light	Med Associates	ENV-315W (43)	house light
IR Controller	Med Associates	ENV-253B (77)	entry detector for tube between nest and test
Fan	Med Associates	ENV-025F28 (42)	exhaust fan for each chamber
Polypropylene Nest Tub			nest box
Acrylic Connection Tube			connection between nest and test areas
Steel Cabinet			cabinet to hold test chambers (78"H, 48"W, 24"D)
Windows computer			running MedPC experiment-control software
Server			running Matlab, linked to exper-control computer by LAN
Software
MedPC software	Med Associates		proprietary process-control programming language
Matlab w Statistics Toolbox	Matlab		proprietary data analysis and graphing programing system
TSsystem		in Supplementary Material w updates from senior author	Open-source Matlab Toolbox
Note: This is the euipment needed for one cabinet, containing 8 test environments. Hardware must be replicated for each such cabinet. However one computer can control 2 cabinets (16 test environments)