Methoden zur Charakterisierung Spontan und Startle-induzierte Locomotion in einer Rotenon-induzierten Parkinson-Krankheit Modell der<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die aus der Degeneration der dopaminergen Neuronen im Zentralnervensystem führt, wodurch Bewegungsfehler. Rotenon Modellen der Parkinson-Krankheit in Drosophila. In diesem Dokument werden zwei Tests, die sowohl spontan als auch erschrecken-induzierten Bewegungsmangel durch Rotenon verursacht charakterisieren.

Zusammenfassung

Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die aus der Degeneration der dopaminergen Neuronen führt das Zentralnervensystem, vor allem in der Substantia nigra. Die Krankheit verursacht motorischen Defiziten, die als Steifigkeit, Zittern und Demenz bei Menschen zu präsentieren. Rotenon ist ein Insektizid, das oxidative Schäden verursacht durch die Hemmung der Funktion der Elektronentransportkette in den Mitochondrien. Es wird auch zur Behandlung der Parkinson-Krankheit in Drosophila zu modellieren. Fliegen haben eine inhärente negativen geotactic Antwort, die sie nach oben zu klettern, auf Erschrecken zwingt. Es wurde festgestellt, dass Rotenon verursacht frühe Sterblichkeit und Mängel, die Fortbewegung der Fliegen Fähigkeit zu klettern, nachdem sie zuvor nach unten geklopft zu stören. Jedoch ist die Wirkung auf die spontane Bewegung Rotenon nicht gut dokumentiert. Diese Studie beschreibt zwei empfindliche, reproduzierbare und Hochdurchsatz-Assays Rotenon-induzierten Mängel kennzeichnenkurzfristige Schreck-induzierten Fortbewegung und langfristige spontane Fortbewegung in Drosophila. Diese Assays können leicht angepasst, um andere Drosophila Modelle von Bewegungsfehlern und Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln zu charakterisieren.

Einleitung

Fortbewegungsmangel sind ein Hauptsymptom der Parkinson-Krankheit und sind weitgehend durch Verschlechterung der dopaminergen Neuronen der Substantia nigra ¹ verursacht. Rotenon ist ein Insektizid, das Keton eingehend untersucht worden ist, um die Parkinson-motorische Defizite in Drosophila ^2-6 modellieren. Rotenon verursacht oxidativen Schäden durch die Blockierung der oxidativen Phosphorylierung Weg, die letztlich zum Zelltod ^7. Dopaminergen Neuronen sind anfälliger für Rotenon Toxizität, so dass die Auswirkungen der chemischen hauptsächlich Motors auf ^2,7. Durch die Induktion Symptome des Morbus Parkinson in Fliegen, können wir besser verstehen, die Krankheit und ihre Symptome zu beheben ^6,8-11. Drosophila bietet ein gutes Modell für die Untersuchung dieser Effekt, weil sie genetisch manipulierbaren, leicht zu pflegen sind, und haben einen schnellen Lebenszyklus.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass Rotenon verursacht kurzfristige Schreck-induzierteFortbewegung Mängel in Drosophila -Wenn Fliegen werden auf Rotenon-Lebensmittel ergänzt gehalten, zeigen sie eine langsamere Reaktion nach negativen geotactic Schreck ^2-6. Ihr Versagen, nach oben in einem Fläschchen Gerät so schnell wie Steuer Studien klettern ist bezeichnend für Schreck-induzierten Bewegungsfehler.

Die Wirkung von Rotenon auf langfristige, ist spontane Bewegung nicht gut beschrieben. Drosophila Aktivitätsmonitore (Dämme) erfolgreich verwendet, um Bewegung in Drosophila zirkadianen Rhythmus zu überwachen studiert ^12,13. Fliegen werden in Einzelrohre, die in das DAM geladen angeordnet. Diese Vorrichtung ist mit einem Infrarotsensor, der die Anzahl von Malen eine Fliege bricht den Infrarotstrahl zählt ausgestattet. Diese Zählwerte können als Maß für die ungestörte Fortbewegung und Aktivität ^12,13 verwendet werden. Durch die Platzierung Fliegen in einer DAM, kann die Wirkung von Rotenon auf ihre langfristige Fortbewegung charakterisiert werden. Diese Studie beschreibt die Methoden zum MessenUre kurzfristige Schreck-induzierten Fortbewegung und langfristige spontane Fortbewegung, um die Auswirkungen von Rotenon vermittelten motorischen Defiziten besser zu verstehen. Charakterisierung von Bewegungsmangel imitiert Parkinson-Krankheit sind wichtig, weil sie es erlauben, die Untersuchung von anderen Verbindungen, die diese Bewegungsfehler der Rückwärtsgang kann.

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Protokoll

1. Drosophila Startle-induzierte Locomotion Assay

1. Die medikamentöse Behandlung
   1. Sedieren, um die gewünschte Anzahl immobilisieren (etwa 8-12) von 1-3 Tage alten männlichen Fliegen mit CO ₂ und transportieren sie zu Fläschchen, die die Drogen ergänzt Essen. Hinweis: Eine weitere Betäubung zB Ether oder Eis verwendet, um Fliegen zu sedieren, um das Zählen und die Handhabung zu ermöglichen.
   2. Lassen Sie Fliegen von Sedierung für 20 Minuten (oder bis zur Genesung) mit dem Fläschchen in eine horizontale Position zu erholen (um Fliegen verhindern, dass sich auf die Lebensmittel Stück) und legen Sie dann die Durchstechflasche aufrecht in einem 12 Stunden Dunkelheit, 12 Stunden Licht Brutschrank bei 25 ° C für den Rest des Experiments.
2. Versuchsaufbau
   1. Teilen Sie diese Doppel Fläschchen Setup in drei gleiche Abschnitte von 6,33 cm durch Markierung Kreise um die Fläschchen mit einem Permanent-Marker.
   2. Nach 3 Tagen Arzneimittelexposition, fliegt Übertragung ohne Betäubung in den Boden Fläschchen und schnell platzieren Sie die Top-Fläschchenüber der Öffnung. Kleben Sie die zwei Fläschchen zusammen mit durchsichtigem Klebeband.
   3. Ermöglichen Fliegen an die neue Umgebung für 15 Minuten akklimatisieren.
   4. Ort Fläschchen auf einem weißen Hintergrund und eine Digitalkamera in einem angemessenen Abstand von der Doppel Fläschchen Gerät mit einem Timer in Ansicht festgelegt. Stellen Sie sicher, die gesamte Vorrichtung in einem Bilderrahmen zu sehen ist und dass alle Fliegen sind im Fokus. Um konsistente Rahmen zwischen Studien zu erhalten, markieren Sie die Position der Kamera und Fläschchen.
3. Mobilität Assay
   1. Sichtbar den Versuchsnummer, medikamentöse Behandlung und Timer in der Kamera-Ansicht.
   2. Fest tippen Sie auf den Doppel Fläschchen Gerät gegen die Arbeitsplatte 3 mal und sicherzustellen, dass alle Fliegen fallen auf den Boden des Gefäßes. Gleichzeitig die Stoppuhr starten.
   3. Alle 5 Sekunden für 1 min, ein Bild von dem Gerät. Hinweis: Alternativ könnte ein Video aufgenommen werden und blieb in angemessenen Abständen für Messungen.
   4. Fliegen ermöglichen, für 1 min erholen ungestört.
   5. Wiederholen Sie 2 weitere Male mit 1 min Erholungszeit zwischen jedem Versuch. Hinweis: Jedes Gerät sollte 5 min zu ergreifen, um die Datenerfassung zu vervollständigen. Pflegen Sie ähnliche Kraft der Erschließung zwischen Studien. Mehrere (mindestens 3) Vorrichtung leicht gleichzeitig behandelt werden.
4. Datenanalyse
   1. Überprüfen Sie Bilder und notieren Sie die Anzahl der Fliegen in jedem Abschnitt über die Zeit. Der prozentuale Anteil von Fliegen in jedem Abschnitt über die Zeit. Hinweise: Wiederholen Sie diese ganze Prozedur mit den gleichen Fliegen mit 2 oder 3 Mal Sehenswürdigkeiten, zum Beispiel, Tag 3, 5 und 7. Wenn zu viele Fliegen sterben während des Experiments ist es möglich, Scale-up der ursprünglichen Versuchsnummer zu kompensieren für die Sterblichkeit. Verwenden Sie geeignete statistische Analysen, um die Daten zu vergleichen.

2. Drosophila spontane Locomotion Assay

1. Nahrungszubereitung
   1. Rekonstituieren 3 g Instant Drosophila-Medium mit 15 ml entionisiertem Wasser und der gewünschten Rotenon(Oder ein anderes Medikament von Interesse) Dosierung.
   2. Sobald die Nahrung Mischung fest geworden (ca. 5 min), sorgfältig zu laden das Essen auf etwa 1 cm hoch in Herstellers transparente Rohre (5 mm x 65 mm). Füge das Medikament infundiert Nahrung auf die Rohre durch die Rohre genau platzieren vertikal in der Lebensmittel-und verdrehen, bis sie mit dem Nahrungsmittel im Inneren des Rohres entfernt werden. Hinweis: Es ist hilfreich, einen Finger auf die Öffnung des Rohres Ort, um ein Vakuum zu erzeugen. Lebensmittel sollten keine Luftblasen enthalten oder eine unebene Oberfläche, wie die Fliegen können stecken bleiben.
2. Versuchsaufbau
   1. Eine Plastikkappe an dem Ende des Rohres am nächsten zu der Nahrung. Schieben Sie die Kunststoffkappe auf dem Rohr so ​​wenig wie möglich, da es eine Luftblase in der Ampulle zu erstellen, wenn geschoben, um mit Nachdruck.
   2. Sedate 1 Tag-alten männlichen fliegt mit CO ₂ und sorgfältig legen 1 Männchen fliegen in jedes Rohr mit einem Pinsel. Wiederholen, je nach Anzahl der gewünschten Prüfungen.
   3. Stecken Sie denEnde des Rohres am weitesten von der Nahrung mit einem kleinen Wattebausch, die Hand vom größeren Speicher aufgerollt werden kann, haben Watte.
   4. Ermöglichen Linie mit den Rohren in einer horizontalen Position für 15 Minuten zu erholen und zu gewährleisten, dass alle Fliegen lebendig und aktiv sind. Setzen Sie die Rohre in DAM und stellen Sie sicher, dass alle Rohre sind in der gleichen Position relativ zu Damm. Anmerkung: Es ist möglich, sie mit dem Bereich der Überwachung in der Mitte der Ampulle zu platzieren, oder um alle Röhrchen zur Seite zu schieben, so dass das Ende des Rohrs überwacht wird. Hinweis: Siehe Diskussion für Variationen dieser Methode.
3. Data Collection
   1. Legen Sie das DAM in einem 12 Stunden Dunkelheit, 12 Stunden Licht Inkubator auf 25 ° C eingestellt. Schließen Sie das DAM an die Datensammelsystem. Öffnen Sie die DAM-Software und unter Einstellungen wählen bin Länge bis 10 min. Starten Sie die Datenerfassung und damit das Programm, um Daten für 7 Tage zu sammeln. Hinweis: Bin Länge kann bei Bedarf angepasst werden.
   2. Datenanalyse
      Hinweis: Prozessdie Daten, die Zählimpulse pro min als Maß für die langfristige spontane Lokomotion zu erhalten.
      1. Öffnen DAM Datei-Scan-Programm und Zugang Überwachungsdaten, indem Sie wählen Eingangsdaten.
      2. Wählen Sie den entsprechenden Bereich und wählen Sie Monitor bin Länge bis 10-Minuten-Intervallen.
      3. In Ausgabedateityp wählen Sie Kanal-Dateien. Lassen Sie alle anderen Optionen als Standard.
      4. Klicken Sie auf Scan-Daten und speichern Sie in einem bestimmten Ordner.
      5. Import von Daten in einem zirkadianen Datenanalyse-Software, um Zählungen pro min erhalten. Hinweis: Für die Datenanalyse-Software Clocklab wird häufig verwendet. Andere Optionen sind ebenfalls erhältlich.

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Ergebnisse

Drosophila Startle-induzierte Locomotion Assay

Wildtyp-, Kantons-S, zeigte Fliegen eine robuste negativen geotactic Reaktion mit nur etwa 88% und 5% der Fliegen in den oberen und unteren Abschnitten jeweils der Doppel Fläschchen Gerät nach 30 sec (Abbildung 1). Fliegen bis 125 um und 250 um Rotenon für 3 Tage ausgesetzt waren, zeigten einen leichten Rückgang in der Anzahl der Fliegen im oberen Bereich und eine leichte Erhöhung der Anza...

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Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir zwei Verfahren zur Messung sowohl langfristige Fortbewegung spontane und kurzfristige Schreck-induzierten Fortbewegung in einer Rotenon-induzierten Drosophila Modell der Parkinson-Krankheit. Man kann auch diese Bewegungs Merkmale entfernt, um andere pharmakologische Wirkstoffe bekannt, die Parkinson-Krankheit zB Typ, Paraquat ^14, genetischen Modellen der Parkinson-Krankheit beispielsweise alpha-Synuclein-Mutanten ¹⁵ und andere Flugmodelle ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.