Metodi di caratterizzare spontanea e startle indotta Locomozione in un rotenone-indotta malattia di Parkinson Modello di<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che deriva dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici nel sistema nervoso centrale, causando difetti di locomozione. Modelli rotenone malattia di Parkinson in Drosophila. Questo documento delinea due saggi che caratterizzano le carenze locomozione sia spontanee e spaventare-indotte causate da rotenone.

Abstract

La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che deriva dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici nel sistema nervoso centrale, soprattutto nella substantia nigra. La malattia provoca deficit motori, che presentano come rigidità, tremori e demenza negli esseri umani. Rotenone è un insetticida che provoca il danno ossidativo inibendo la funzione della catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri. Viene anche usato per modellare la malattia di Parkinson in Drosophila. Le mosche hanno una intrinseca geotactic risposta negativa, che obbliga loro di salire verso l'alto dopo essere stato sorpreso. È stato stabilito che rotenone causa di mortalità e di locomozione difetti iniziali che inficiano la capacità delle mosche 'a salire dopo che sono stati sfruttati verso il basso. Tuttavia, l'effetto di rotenone sul movimento spontaneo non è ben documentata. Questo studio delinea due test di throughput sensibili, riproducibili, e alti per caratterizzare carenze rotenone-indottalocomozione e locomozione spontanea-lungo termine a breve termine startle-indotta in Drosophila. Questi test possono essere adattati facilmente per caratterizzare altri modelli di Drosophila di difetti di locomozione e l'efficacia degli agenti terapeutici.

Introduzione

Carenze Locomotion sono un sintomo principale della malattia di Parkinson e sono in gran parte causati dal deterioramento dei neuroni dopaminergici della substantia nigra ^1. Rotenone è un insetticida chetonici che è stata ampiamente studiata per modellare deficit motori del Parkinson in Drosophila ^2-6. Rotenone provoca danno ossidativo bloccando la via della fosforilazione ossidativa, che provoca in ultima analisi, la morte cellulare ^7. Neuroni dopaminergici sono più inclini alla tossicità rotenone, rendendo gli effetti della chimica basata principalmente motore ^2,7. Per indurre i sintomi della malattia di Parkinson in mosche, possiamo capire meglio la malattia e porre rimedio suoi sintomi ^6,8-11. Drosophila offre un buon modello per lo studio di questo effetto, perché sono geneticamente trattabili, di facile manutenzione, e hanno un ciclo di vita veloce.

Diversi studi hanno dimostrato che il rotenone provoca a breve termine startle-indottadifetti di locomozione in mosche Drosophila -quando sono mantenuti sul cibo rotenone-integrato, mostrano una risposta più lenta geotactic negativa dopo startle ^2-6. La loro incapacità di salire verso l'alto in un apparato fiala più rapidamente le prove di controllo è indice di difetti di locomozione startle-indotta.

L'effetto di rotenone on-lungo termine, movimento spontaneo non è ben descritto. Monitor di attività Drosophila (dighe) sono stati utilizzati con successo per monitorare il movimento in Drosophila ritmo circadiano studia ^12,13. Le mosche sono posti in tubi singoli, che vengono caricati nel DAM. Questo apparecchio è dotato di un sensore a infrarossi, che conta il numero di volte che una mosca interrompe il raggio infrarosso. Questi conteggi possono essere usati come misura di locomozione e dell'attività ^12,13 indisturbati. Inserendo mosche in una diga, l'effetto di rotenone sul loro locomozione a lungo termine può essere caratterizzato. Questo studio descrive metodi per measlocomozione e locomozione spontanea a lungo termine URE breve termine startle-indotta al fine di comprendere meglio gli effetti del rotenone mediata deficit motori. Caratterizzazione delle carenze di locomozione che mimano la malattia di Parkinson sono importanti perché consentono per lo studio di altri composti che possono invertire questi difetti di locomozione.

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Protocollo

1 Drosophila Startle indotta Assay Locomotion

1. Trattamento di droga
   1. Sedare immobilizzare il numero desiderato (circa 8-12) di 1-3 giorno-vecchio maschio vola con CO ₂ e trasportarli a fiale contenenti il cibo-farmaco integrato. Nota: Un altro anestetico ad esempio, etere o ghiaccio possono essere usati per sedare le mosche per consentire il conteggio e la manipolazione.
   2. Consenti mosche per recuperare da sedazione per 20 minuti (o fino al recupero) con la fiala in posizione orizzontale (per evitare di rimanere bloccati mosche sul cibo) e quindi posizionare il flacone in posizione verticale in un buio 12 ore, 12 ore di luce incubatore a 25 ° C per il resto dell'esperimento.
2. Sperimentale Set Up
   1. Dividere questa doppia configurazione fiala in tre sezioni uguali di 6,33 centimetri contrassegnando cerchi intorno le fiale con un pennarello indelebile.
   2. Dopo 3 giorni di esposizione al farmaco, trasferimento vola senza anestetizzante nel flaconcino inferiore e posizionare rapidamente il flaconcino all'iniziosopra l'apertura. Tape le due fiale con nastro adesivo trasparente.
   3. Consenti mosche per acclimatarsi al nuovo ambiente per 15 min.
   4. Luogo fiale su uno sfondo bianco e impostare una fotocamera digitale ad una distanza appropriata dal doppio apparato flaconcino con un timer in vista. Assicurarsi che l'intero apparato è visibile in una sola cornice e che tutte le mosche sono a fuoco. Per mantenere cornici coerenti tra prove, segnare la posizione della telecamera e il flacone.
3. Mobilità Assay
   1. Chiaramente visualizzare il numero di prova, trattamento farmacologico, e timer in vista della telecamera.
   2. Saldamente toccare il doppio apparato fiala contro il piano di lavoro 3 volte e garantire che tutte le mosche cadono sul fondo della fiala. Contemporaneamente avviare il timer.
   3. Ogni 5 secondi per 1 minuto, scattare una foto dell'apparato. Nota: In alternativa, un video può essere catturato e messo in pausa ad intervalli appropriati per le misurazioni.
   4. Consenti mosche di recuperare indisturbati per 1 min.
   5. Ripetere altre 2 volte con tempo di recupero 1 min tra ogni prova. Nota: Ogni apparecchio dovrebbe prendere 5 minuti per completare la raccolta dei dati. Mantenere forza simile di intercettazioni tra prove. Multipla (almeno 3) apparecchio può essere facilmente gestito contemporaneamente.
4. Analisi dei dati
   1. Rivedere le immagini e registrare il numero di mosche in ogni sezione nel corso del tempo. Calcolare la percentuale di mosche in ogni sezione nel tempo. Note: Ripetere l'intera procedura con le stesse mosche a 2 o 3 punti di tempo di interesse, per esempio, il giorno 3, 5, e 7 se troppe mosche muoiono durante l'esperimento, è possibile scalare il numero di prova iniziale per compensare per la mortalità. Utilizzare l'analisi statistica opportuno confrontare i dati.

2 Drosophila spontanea Locomotion Assay

1. Preparazione del cibo
   1. Ricostituire 3 g di media istantanea Drosophila con 15 ml di acqua deionizzata e rotenone desiderato(O un altro farmaco di interesse) dosaggio.
   2. Una volta che il composto cibo è diventato impresa (circa 5 min), caricare con cura il cibo per essere circa 1 cm in alto produttore forniti tubi trasparenti (5 mm x 65 mm). Aggiungere il farmaco infuso cibo ai tubi ponendo attenzione le provette verticalmente nel cibo e torsione fino a che non possono essere rimossi con il cibo all'interno del tubo. Nota: È utile posizionare un dito sull'apertura del tubo per creare il vuoto. Il cibo non deve contenere bolle d'aria o avere una superficie irregolare come le mosche possono diventare bloccato.
2. Setup sperimentale
   1. Inserire un tappo di plastica all'estremità del tubo più vicina del cibo. Spingere il tappo di plastica sul tubo il meno possibile, come si può creare una bolla d'aria nel flacone se spinto a forza.
   2. Sedare 1 giorno-vecchio maschio vola con CO ₂ e inserire con cautela 1 maschio vola in ogni provetta con un pennello. Ripetere a seconda del numero di prove desiderati.
   3. Inserire ilestremità del tubo più lontano dal cibo con una piccola pallina di cotone, che può essere arrotolato a mano dal deposito ingrandito comprato batuffoli di cotone.
   4. Consenti mosche di recuperare con i tubi in posizione orizzontale per 15 minuti e assicurarsi che tutte le mosche sono vivi e attivi. Inserire i tubi in DAM e assicurarsi che tutti i tubi sono nella stessa posizione relativa alla diga. Nota: E 'possibile posizionarle con la zona di monitoraggio al centro del flacone, o di spingere tutte le fiale di lato, in modo che l'estremità del tubo viene monitorato. Nota: Si veda la discussione di variazioni su questo metodo.
3. Raccolta dati
   1. Inserite il DAM in un buio 12 ore, 12 ore di luce incubatrice impostata a 25 ° C. Collegare il DAM al sistema di raccolta dati. Aprire il software DAM e alle preferenze selezionate lunghezza bin a 10 min. Avviare la raccolta dei dati e consentire al programma di raccolta di dati per 7 giorni. Nota: la lunghezza Bin può essere regolata, se necessario.
   2. Analisi dei dati
      Nota: Processoi dati per ottenere conteggi per minuto come misura di locomozione spontanea a lungo termine.
      1. Programma e monitorare l'accesso ai dati di scansione dei file DAM Aprire facendo clic su Seleziona dati di input.
      2. Selezionare appropriata gamma del monitor e selezionare la lunghezza bin a intervalli di 10 min.
      3. Nel tipo di file di output scegliere i file di canale. Lasciare tutte le altre opzioni come predefinite.
      4. Fare clic su dati di scansione e salvare in una cartella designata.
      5. Importare dati in un circadiano software di analisi dei dati per ottenere conteggi per minuto. Nota: Per il software di analisi dei dati Clocklab è comunemente usato. Altre opzioni sono disponibili anche.

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Risultati

Drosophila Startle indotta Assay Locomotion

Di tipo selvatico, Canton-S, mosche mostrato una robusta risposta geotactic negativa con solo circa il 88% e il 5% di mosche nelle sezioni superiore e inferiore, rispettivamente, dell'apparato doppio flaconcino dopo 30 sec (Figura 1). Le mosche esposte a 125 mM e 250 mM rotenone per 3 giorni hanno mostrato una lieve diminuzione del numero di mosche nella sezione superiore e leggero aumento del...

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Discussione

In questo studio, descriviamo due procedure di misurazione sia locomozione spontanea a lungo termine e di locomozione startle indotta a breve termine in un rotenone indotta Drosophila modello della malattia di Parkinson. Si può anche misurare queste caratteristiche locomozione in mosche esposti ad altri agenti farmacologici noti per modello di malattia di Parkinson, per esempio paraquat ^14, modelli genetici della malattia di Parkinson ad esempio, alfa-sinucleina mutanti ^15,

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.