Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

Zusammenfassung

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Zusammenfassung

Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (> 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster ^1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine ​​und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation ^3-5 gestatten und vielleicht fah....

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Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.

1. Crypt Isolierung und Kultur

1. Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm:
   1. Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO _2, gefolgt durch zervikale Dislokation.
   2. Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca ^2+....

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Ergebnisse

Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen.

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Diskussion

Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander.

29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am ^29. min, O.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience