Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas ratón intestinal Cripta organoides

Resumen

Pequeñas organoides las criptas intestinales cultivadas ex vivo proporcionan un sistema de cultivo de tejidos que recapitula el crecimiento de las criptas dependientes de células madre y su nicho. Hemos establecido un método para analizar el perfil metabólico en tiempo real en organoides cripta ratón primaria. Encontramos organoides mantienen propiedades fisiológicas definidas por su origen.

Resumen

La mucosa del intestino delgado exhibe una arquitectura repetitivo organizada en dos estructuras fundamentales: vellosidades, que sobresalen en el lumen intestinal y compuestas de los enterocitos maduros, células caliciformes y células enteroendocrinas; y criptas, que residen proximal a la submucosa y la capa muscular, la acogida madre adultas y células progenitoras y células de Paneth madura, así como del estroma y las células inmunes del microambiente cripta. Hasta los últimos años, los estudios in vitro de intestino delgado se limitó a las líneas celulares derivadas de tumores benignos o malignos, y no representaban la fisiología del epitelio intestinal normal y la influencia del microambiente en el que residen. Aquí, se demuestra un método adaptado de Sato et al. (2009) para el cultivo de organoides de las criptas intestinales del ratón primarios derivados de ratones C57BL / 6. Además, se presenta el uso de cultivos de organoides cripta para analizar el perfil metabólico cripta en tiempo real por medidación del consumo basal de oxígeno, tasa glucolítica, la producción de ATP y la capacidad respiratoria. Organoides mantienen propiedades definidas por su origen y conservan aspectos de su adaptación metabólica se refleja en el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular. Estudios metabólicos en tiempo real en esta cripta organoid sistema de cultivo son una poderosa herramienta para estudiar el metabolismo energético organoid cripta, y la forma en que pueden ser modulados por factores nutricionales y farmacológicos.

Introducción

El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Cáncer de colon esporádico - es decir, que surge más tarde en la vida (> 50 años de edad) y sin factores genéticos predisponentes claras - las cuentas de ~ 80% de todos los casos, con una incidencia muy influida por los patrones de la dieta a largo plazo ^1,2. Estos tumores exhiben un cambio metabólico hacia la dependencia de la glucólisis oxidativo, conocido como el efecto Warburg, lo que puede hacer, en parte, concentraciones más altas de bloques de construcción celular y la energía disponibles (a través de glutaminolysis) para p....

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Protocolo

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Einstein College de Medicina Albert.

1. Cripta Aislamiento y Cultura

1. El aislamiento de las criptas del intestino delgado:
   1. Aislar criptas intestinales de cualquier modelo de ratones de interés. La eutanasia a los ratones con CO ₂ seguido por dislocación cervical.
   2. Abrir el abdomen longitudinalmente y llenar el intestino delgado (SI) con solución salina tamponada con....

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Resultados

Organoides cripta se establecieron a partir de 8 meses de C57BL / 6 ratones alimentados con la dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrición 76A (AIN76A). Organoides criptas intestinales pueden ser cultivadas en cultivo durante períodos extendidos de un solo cripta (Figura 1A, sola flecha roja). Organoides surgen estructuras de cripta en 18-20 días en cultivo (Figura 1B, flechas rojas). Las criptas se pasaron cada 3 semanas y organoides recuperaron de manera eficiente desp.......

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Discusión

Hemos probado la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el índice de acidificación extracelular (ECAR) de criptas aisladas a partir de 8 meses de edad los ratones y se hicieron crecer en organoides ex vivo. Después de la medición de la tasa basal, el metabolismo cripta se evaluó mediante la adición de oligomicina, cianuro de carbonilo -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y rotenona, secuencialmente.

Basal OCR y ECAR basal se registraron 0-29 min (Figura 2A y.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience