Nicht-invasive Parenchymale, Gefäß- und Stoffwechselhochfrequenz-Ultraschall und Photoakustische Rat Deep Brain Imaging

Zusammenfassung

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Zusammenfassung

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

Einleitung

Strategien zur minutiös beschreiben Merkmale der Hirn Hämodynamik in das Zentralnervensystem von Kleintieren erforderlich sind, um auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ^3.1 voraus. Die vorgestellte Technik zeigt, wie nicht-invasive akustische und photoakustische Bildgebung am Kleintier-Gehirn, um Gefäßbiologie, Anordnung und Funktion prüfen, durchzuführen.

Optische Abbildungstechniken ermöglichen die Lokalisierung von Ereignissen die neuronale Aktivität ^2,4,5 bezogenen und gleichzeitig Signale durch Hämoglobin erzeugt erwerben sowohl in sauerstoffreichem und nicht-sauerstoffhaltigen Zustände ^6. Aufgrund photonischen Absorption und Streuung, leidet reinen optischen Abbildung von schlechten räumlichen Auflösung und begrenzter Gewebe Eindringtiefe ^7-8. Umgekehrt bieten Akustik die Möglichkeit, tiefer Bildgebung mit höheren Raum räumlicher Auflösung durchführen, aber es wird von Speckle und geringfügiger Kontrast ^9-11 behindert. Durch die Kombination von Eigenschaften von Photonik with Ultraschall verbessert photoakustischen Technik sowohl Bildgebung und diagnostischen Möglichkeiten der einzelnen Verfahren ^12-16.

Photoakustische Bildgebung des Gehirns hat das Potenzial, mehrere Fragen in der Neurobiologie zu klären, aber die Schädeldecke, die von Natur schützt das Hirn, drastisch begrenzt sowohl die photonische und Ultraschall Gewebepenetration ^17-19. Außerdem Knochen fördern Streuung Licht und Klang zu einem Verlust an Empfindlichkeit und Bildfehler ^17-18. Als Konsequenz Gehirn Ultraschall- und photoakustische Bildgebung kann leicht auf Neugeborene Tiere vor der Verknöcherung ²⁰ durchgeführt werden, aber die Tiefe der Anatomie und Physiologie des erwachsenen Gehirns erst nach Kraniotomie ^21,22 eindeutig zugänglich sind. Bedauerlicherweise ist die Operation für Schädelentfernung benötigt technisch schwierig und ihre Wirkungen können für einige experimentelle Zwecke wodurch es schwierig neuronalen Fortschreiten der Krankheit in der Monitor schädlich seingleichen Tier über die Zeit. Daher ist eine nicht-invasive Methode zur Bild tiefen Hirnbiologie in Kleintiermodellen sehr wünschenswert. In der Literatur wird die Methode der Photonen-Recycler ¹⁷ ist als ein Weg, um die Telefonverlust zu reduzieren und die Durchlässigkeit durch den intakten Schädel, Verbesserung der photoakustisches Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und der Kontrast der Ziel gemeldet.

Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, ein zuverlässiges Verfahren zur subkortikalen Gehirn akustischen und photoakustische Bildgebung auf Forschungszwecke Nagetieren (insbesondere an Ratten) ohne invasive Chirurgie bereitzustellen. Das Verfahren basiert auf der Verwendung von tragbaren Wandlervorrichtungen für hochfrequente Ultraschall und photoakustische Bildgebung. Im Gegensatz zu den Imaging-Technologie ^23, tragbar und Richtungsgeber ²⁴ ermöglicht die Auswahl spezifischer Schädel Regionen mit natürlich reduzierte Dicke tomographische, genannt Risse oder scissures. Die großen Spalten (Foramen) auf der Wirbel ein Geschenknimal Schädel sind notwendig, um die Nervenbündel, Schiffe oder andere Strukturen Anschluss von internen encephalon Schaltungen in andere Teile des Körpers zu finden. Die großen Spalten sind in verschieden großen Öffnungen, die als Knochen bestimmte Passagen für Ultraschallwellen und Laser ausgenutzt werden können gefunden. Solche gezielten Bildgebung reduziert Wellenreflexion Auswirkungen von Knochenschnittstellen verursacht und erhöht die Empfindlichkeit durch die Verbesserung der bildgebenden Eindringtiefe. In dieser Hinsicht kann der Bildwandler angeordnet sein, die senkrecht zu den Spalten von der zeitlichen und der Hinterkopfseite des Schädels (Figur 1) angeordnet sein, um maximal die Konvergenz des Ultraschall und Photonenstrahlen auf diese Bereiche. Diese Orientierung sowohl verbessert die Signalqualität und zwingt das Signal durch eine dünnere Knochenschicht in Bezug auf andere Hirn Orientierungen fortzufahren. Somit können die übertragenen und reflektierten Wellen durchlaufen eine geringere Streuung, wodurch Sammlung intensive Signale aus tieferen UrsprungGewebeschichten. Im Gegensatz zu früheren Verfahren, diese experimentellen Einstellung erfordert nur Tierkopf rasieren, während keine weitere Operation notwendig ist.

Mit dem vorgeschlagenen Protokoll wird Bildgebung bei relativ hohen räumlichen Auflösung durchgeführt und enthüllt sowohl spezifische Referenz anatomischen Strukturen und Blutgefäße tiefer als aktuellen Stand der Technik bekannten Verfahren, die alle während der Tierhaut und Schädel intakt bleiben. Einzigartige koronaren und axialen Bilder können unter Berücksichtigung verschiedener Ultraschall-Bildaufnahmemodalitäten (B, Power-Doppler, Farbdoppler, Pulsed-Wave-Modus) parallel zur photoakustischen Bildgebung erworben werden. Eine erweiterte Repertoire Parameter können aus diesen Bildern extrahiert werden, wodurch Darstellung der parenchymalen und Gefäßanatomie neben einer ganzen Sammlung von Eigenschaften beeinflussen die Durchblutung Dynamik. Dieses Protokoll kann zu Bildgrund Rindenparenchym Funktionen in Hochfrequenz-Ultraschall-B-Modus-Modalität, die basilaris und A. carotis interna (verwendet werdenBA und ICA beziehungsweise) Zusammensetzen des Kreis von Willis, der Arteria cerebri media (MCA) und andere Details des Kreislaufgerät. Weiterhin Blutung quantifiziert, bedeuten Strömungsgeschwindigkeiten, Richtungsbewegungsbeschreibung und die Sauerstoffsättigung Daten von kortikalen tiefen Hirnregionen gesammelt werden.

Diese neue Strategie birgt ein großes Potenzial für eine Vielzahl von Anwendungen und erfüllt den dringenden Bedarf an zuverlässigen Verfahren zur Hirnfunktionen, die entscheidend in verschiedenen Pathologien sind darzustellen. Darüber hinaus aufgrund seiner minimalen Invasivität, die vorgestellte Protokoll unzähligen möglichen bildgebenden Untersuchungen auf das zentrale Nervensystem, insbesondere solche, die die Langzeitüberwachung oder mit empfindlichen pathologischen Tiermodellen zu ermöglichen.

Protokoll

Notwendige Experimente, um das Protokoll zu entwickeln wurden nach nationalen Vorschriften durchgeführt und wurden von den lokalen ethischen Wissenschaft Kommission genehmigt (Comitato di Bioetica di Ateneo), die innerhalb der Institution der Universität Turin, Turin, Italien.

1. Vorbereitung

1. Anästhesie
   1. Legen Sie das Tier in der entsprechenden Isofluran Kammer, um sie zu betäuben.
   2. Füllen Sie die Kammer mit gemischten O ₂ und Isofluran Gas für Tierarzneimittel in einer Konzentration von 2,5% in einem 2 l Gaskammer und warten Sie ca. 3 min für die Ratte, um einzuschlafen. Prüfen Sie, ob die Wirkung der Narkose durch eine Zehe Prise.
   3. Sobald die Betäubung wirksam wird, entfernen Sie die Ratte und gewogen.
   4. Verteilen Sie eine dünne Schicht von wasserlöslichen Augen Gel auf die Augen des Tieres, um sie zu schützen und die Augen physiologischen Hydratation beizubehalten.
   5. Legen Sie die Ratte sich auf einen Ultraschall und photoakustische Bildgebung Station-Arbeitsplatte. ICH An, um die Anästhesie-Effekt zu erhalten, schnell positionieren die Nase in der entsprechenden Maske eine konstante Durchflussanästhesie (Isofluran 2% -2,5% in Sauerstoff 1 l / min).
2. Rasieren das Tier
   1. Verteilen Sie eine einheitliche Schicht des Haarentfernungscreme auf der Kopfoberfläche, mit Liebe zum Umland Ohren und Hals bedecken. Lassen Sie die Creme für einige Minuten einwirken lassen und vorsichtig herausnehmen mit einem Spachtel. Softly entfernen Sie alle Creme Reste mit einem feuchten Schwamm, um genau zu reinigen die Haut.
      HINWEIS: Das Tierfell einschließt Luft, die sich negativ auf Ultraschall basierte Bildgebung Erwerb, so muss es unbedingt so weit wie möglich entfernt werden.
3. Die Positionierung des Tieres
   1. Ordnen Sie die Tiere in einer gespreizten Position. Überwachen Sie die Vitalfunktionen, durch entsprechende Vitalparameter-Sensoren auf der Arbeitsplatte (falls vorhanden). Lehnen Sie die Pfoten auf die Sensoren nach dem Auftragen einige Tropfen Elektrodencreme für den professionellen Einsatz.
      HINWEIS: Während der Anästhesie, sicherzustellen, dass die Vitalparameter sind Werte wie folgt: Ratte Körpertemperatur ≈ 37,5 ° C, Herzschläge pro Minute (BPM) variiert zwischen 250 und 350 und die Atemfrequenz ist im Bereich von 40 bis 80 Atemzüge pro Minute zusammen .
   2. Die Glieder mit hypoallergenen Kunstseide Patch Schließlich befestigen. Wenn nötig, ausgebreitet wieder eine dünne Schicht von wasserlöslichen Augen Gel Augen Tieres zu schützen.

2. Bildaufnahme von Temporal Point of View

1. Die Positionierung des Tieres
   1. Halten des Tieres in einer Bauchlage, dreht seine Körper leicht auf der Seite, mit einem Neigungswinkel von etwa 45 ° bezüglich der sagittalen Körperachse. Verwenden Sie kleine Baumwollgaze Rollen wie steht, um die zur Verfügung (Abbildung 2a) korrekt anzuordnen.
   2. Heben Sie das Tier den Kopf und drehen Sie ihn leicht auf der einen Seite (Abbildung 2a). Verwenden Sie einen Watterolle als Stand halten die Schnauze gut inserted in die Narkosemaske.
   3. Neigen die Arbeitsplatte in einem Winkel von etwa 30 ° in Bezug auf die horizontale Ebene.
   4. Drehen der Bildwandler in einem Winkel von etwa 30 ° bezüglich der vertikalen Ebene.
2. Ultraschall und photoakustische anatomischen und Gefäßbildaufnahme
   1. Drehen Sie den Imaging-Scan auf, geben Sie den B-Modus Bildaufnahme und ordnungsgemäß alle Bildaufnahmeparameter eingestellt, um mögliche gegebenen Anforderungen des Experiments (Abbildung 3a) zu respektieren.
      HINWEIS: Einstellen der Sendemittenfrequenz so niedrig wie möglich (16 MHz, 3b), um die maximale Eindringtiefe möglich, den Wandler zu haben.
   2. Entsorgen Sie eine einheitliche Schicht (ca. 1 cm dick) von hypoallergenen wasserlöslich Ultraschallübertragung Gel auf den Kopf des Tieres (Abbildung 2b). Bedecken Sie den Schallkopf mit einer dünnen Schicht aus dem gleichen Gel und legen Sie sie in Kontakt mit der Schicht auf der rat. Verwenden Sie warmes Gel, um lokalisierte Kühlung minimieren.
   3. Starten der Bildaufnahme im B-Modus und stellen Sie den Schwinger Positionierung in Echtzeit, durch die Identifizierung anatomischen Referenzen und durch Zentrieren der Region von Interesse an den Monitor Mittelpunkt. Achten Sie auf Luftblasen auf jeder Ebene in die Gel-Schicht eingefangen zu beseitigen, da sie sich negativ auf die Übernahme.
   4. Setzen Sie den Wandler, um ihn nach der virtuellen Achse verbindet das Ohr zum Auge (Abbildung 4a) ausrichten, um eine optimale Strahl Fokussierung zu erhalten. Erwerben Sie verschiedene Ansichten der inneren Hirnvolumen, durch Rechts- oder Linkslauf (4b und c).
   5. Schließlich ziehen Sie die Wandler auf einem mechanischen Stand, um die Position und stimmen Sie die Ausrichtung in einer feinen Weise stabil zu sichern.
   6. Sicherzustellen, dass die zerebralen Region von Interesse lokalisiert ist, auf 10 mm Tiefe in Bezug auf die US-LASER Wandlerquelle, um einen optimalen pH-Wert zu erhaltenotoakustische Antwortsignal (Abbildung 5). Dann legen Sie die Anzeige des US Welle Fokussierung genau in der Mitte der zu analysierenden Bereich.
      HINWEIS: Bei Forschungsarbeiten von Bereichen von Interesse, zu vermeiden, die Aktivierung der Gate-Option Atmung, um die Positionierungsprozedur zu beschleunigen.
   7. Geben Sie Farb-Doppler-Modus, um interne Gehirn Blutgefäße in einem hochempfindlichen Weise sichtbar zu machen.
   8. Sobald die Positionierung in geeigneter Weise, um die Regionen zu visualisieren wollte eingestellt wurde, aktivieren Sie die Atmung Tor Option, um unerwünschte Auswirkungen auf die Bewegung (6a) im Zusammenhang zu vermeiden.
   9. Wählen Sie das gewünschte Erfassungsparametersatz im Farb-Doppler-Modus (6b) und Bilder zu erwerben in dieser Modalität, um den Blutstrom Geschwindigkeiten und Richtungen zu unterscheiden, bis einige Millimeter Eindringtiefe.
   10. Geben Sie Pulsed-Wave-Doppler-Modus und Bilder zu erwerben, um Arterie Blutpulsation zu erkennen und zu unterscheiden zwischen Arterien einnd Adern.
   11. Eingeben Ein Doppler-Modus und Setup Erfassungsparameter (Figur 7), um ein Signal die Quantifizierung auf der Grundlage der Anzahl von Streuereignissen durch das Flussbewegung verursacht hat, und somit beurteilt Unterschiede der Fließgeschwindigkeiten.
   12. Geben Sie Photoakustische Modus und richtig zu verfeinern Erfassungsparameter (8a), um Daten über Blutgesamthämoglobingehalt oder Sauerstoffgrad in einem bestimmten Gebiet zu sammeln. Durch Erzeugen von Laseranregung auf einem gesamten Wellenlängenbereich (von 680 nm bis 970 nm, 8B), kann die Absorption in unterschiedlichen chemischen Zustände innerhalb eines Gewebes vorhandenen Gesamthämoglobin quantifizieren. Durch Durchführen einer Signal Sammlung auf einzelne spezifische Wellenlängen (8c), ist es möglich, die unterschiedlichen Signalbeiträge aufgrund der Absorption von Sauerstoff und De-Oxy reinen Arten zu isolieren.

3. Imaging aus dem Hinterhaupt Point of View

1. Die Positionierung des Tieres
   1. Halten Sie das Tier in Bauchlage, senken Sie den Tierkopf und verwenden kleine Baumwollgaze Rollen als seitliche steht, um die Entsorgung richtig anzuordnen.
   2. Drehen Sie den Bildwandler parallel zur Querebene des Tierkopfes (Abbildung 9).
      HINWEIS: Auf diese Weise wird die Übernahme durch die Hinterhauptsloch an der Basis des Schädels zentriert werden. Durch Variieren des Neigungswinkels der Ausrichtung der Sonde (Figur 9), wird es möglich sein, interne Gefäßbilder in verschiedenen Ansichten in Abhängigkeit von der Einstellung Neigung zu erwerben.
2. Ultraschall und photoakustische anatomischen und Gefäßbildaufnahme
   1. Geben Sie den B-Modus Bildaufnahme, stellen Sie alle Bildaufnahmeparameter, wie zuvor berichtet (Abbildung 3) und verteilt die notwendigen Ultraschall-Gel-Schichten auf der Sonde und dem Tier Nacken.
   2. Ordnen Sie den Schallkopf auf fast horizontal zu bleiben, in order entlang der anatomischen posterior-nach-anterioren Achse des Körpers ausgerichtet sein. Zielen Sie auf die Stirnseite der Schnauze und drehen Sie ihn leicht nach vorne.
   3. Starten der Bildaufnahme im B-Modus und Farb-Doppler-Modus (3 und 6). Präzise Einstellung der Wandlerposition und entfernen Luftblasen aus dem Gelcoat wie zuvor beschrieben. Wenn möglich, befestigen Sie den Schwinger an einen festen Stand, um die Ausrichtung in eine feine Weise zu steuern und wählen Sie den besten Neigungswinkel um Bilder der gewünschten anatomischen Regionen zu erwerben.
   4. Visualisieren internen Hirnblutgefäße im Power-Doppler-Modus, durch geeignetes Einstellen der Erfassungsparameter (Abbildung 7).
   5. Lokalisieren intensiv pulsierte Arterien durch Pulsed-Wave-Doppler-Modus. Unterscheiden sie von Venen, die umgekehrt werden durch geringe Pulsation des Blutflusses aus.
   6. Sammeln Blutströmungsgeschwindigkeiten Daten und Richtungen in der Farb-Doppler-Modus, durch entsprechend anzupassen acquisition Parameter (Abbildung 6).
   7. Komplette Hirn hämodynamischen Charakterisierung Datensatz, durch Zugabe von chemischen Blut Information durch die photoakustische Akquisition erhalten (Abbildung 8). Führen diese durch in dem insbesondere die Menge hematic Parameter wie die O _{2 -Sättigung} Prozentsatz und die Gesamthämoglobingehalt (HBT), die im Allgemeinen durch Einstellen der Laseranregungswellenlänge bei 750 und 850 nm (Abbildung 8c) gemessen werden.

4. Ende der Akquisition und Tier Removal

HINWEIS: richtig betrachten die ganze Zeit zu dem Bildaufnahme-Prozess (von Schritt 1 bis Schritt 3), der Hauptbeschränkungen Narkose Dosis an das Tier angelegt bezogen unterworfen gewidmet.

1. Speichern Sie alle erfassten Daten, schalten die Laser-Pulsen durch Verlassen des Photoakustische Erfassungsmodus und Entfernung des Wandlers.
2. Unter Beibehaltung der animal unter der Anästhesie-Effekt, beginnen, es durch leichtes Entfernen der Schutz Gel aus den Augen mit einem feuchten Baumwolltuch zu reinigen. Verwenden Sie einen Spachtel und einige Papierhandtücher, um den Ultraschall-Gel vollständig zu entfernen aus dem Kopf und die Schnauze, dann reinigen Sie sie mit einem feuchten Schwamm. Achten Sie darauf, das empfindliche rasierte Haut beschädigen.
3. Nehmen Sie die Klebepflaster verwendet werden, um die Glieder zu befestigen und trennen Sie sie von den Sensoren, die die physiologische Parameter zu überwachen. Das Tier Schnelle Übertragung aus dem Erwerb Arbeitsplatte in einen anderen Käfig.
4. Gastgeber des Tieres in einem kleinen Käfig für Erwachen aus der Narkose. Stellen Sie sicher, dass die Tiere nicht den Käfig zu teilen in dieser Phase, um Aggressionen zu verhindern
5. Legen Sie die Recovery-Käfig unter Infrarotlicht, um das Tier warm zu halten. Warten Sie, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. Überprüfen allgemeinen Gesundheitszustand der Tiere, bevor sie in die Tierzucht Raum.

Ergebnisse

Dieses Verfahren erlaubt, um Bild sowohl spezifische anatomische Referenzstrukturen und Blutgefäße bei relativ hoher räumlicher Auflösung, die tiefer als die aktuelle Technik mit der Tierhaut und des Schädels intakt. In unseren experimentellen Bedingungen die Tiefe des PA-Signals beträgt 4,5 mm und die axiale Auflösung von 75 um mit einem FOV 23 x 15,5 cm. Experimente mit Photoakustische Tomografie Modalität ¹⁹ zeigte einen Wert der Auflösung <1 mm. Die Palette der SNR-Werte von 21,6 dB auf 23,8 dB (von 5 verschiedenen Punkten nach dem Zufallsprinzip auf dem Hirngewebe und Hintergrund ausgewählt worden). Nebeneinanderstellen des Wandlers auf dem Schädel temporalen Seite, kann die Gehirnbilder als quer oder sogar Kranzschnitte auf der Grundlage der ausgewählten Anstellwinkel des Wandlers mit einer resultierenden lateralen Abbildungs ​​Sicht (Figur 4) gewonnen werden. Epidermis, Schädelknochen und parenchymale Material sind in Ultraschall-B-Modus dargestellt, da sie stark in Bezug auf die Wechsel unterscheidenoustic impendence (Abbildung 10). Auch wenn ihre Konfiguration hängt von der gewählten Sicht einige anatomische Referenzstandorten auf Parenchym erkennbar sind, wie zum Beispiel Risse trennen Hirninnenteil aus Rinde und die charakteristische förmigen Sehbahn (Abbildung 10). Zusätzlich kann eine große Anzahl von Gefäßen beide im Ultraschall- und photoakustische Bildgebungsmodalitäten sichtbar. Charakteristisch Schnittpunkte der Arteria carotis interna (ICA) mit anderen Haupt große Schiffe entlang der äußeren Seitenfläche des Tierhirns ausgeführt werden, können leicht erkannt werden. Große Gefäßwege, wie die ICA, mit einer beeindruckenden Blutversorgung, um die konsequente neuronalen Bedarf an Energie und Sauerstoff zu befriedigen. Die ICA, stammte aus A. carotis communis (CCA), läuft auf der lateralen Seite des Kopfes zu mehreren Millimetern Tiefe, geht über alle seine Gabelung Websites und schließlich den vorderen Kopfbereich erreicht. Das Hauptblutstrom verbreitet unter Zwiaß große Schiffe, bevor sie in immer kleinere Arteriolen, um endlich zu ernähren Nervenzellen geleitet. Aus dem zeitlichen Gesichtspunkt, ist es möglich, die internen Hirnschlagader-Muster, die in Schiffen vorderen und seitlichen Gehirnseite gerichtet gabelt verfolgen. Koronalen und Querbilder mit unterschiedlicher Neigung des Wandlers in Bezug auf die Richtung der virtuellen Achse Füge das Auge und die Ohrmuschel des Tieres (4), erworben werden. Durch Kippen des Wandlers entsprechend der in Figur 4 beschriebenen Vorsprünge ist es möglich, aufgelöste Bilder der mittleren Hirnarterie (MCA), die von ICA und weiteren teilt sich in zwei oder mehr Zweige ergibt, zu erhalten, die schließlich Surround kortikalen Lappen (11 und 12). Die besten Visualisierungen wurden MCA mit der Sondenneigung wie in 4c und für ICA zeigte, wie in 4b gezeigt, erhalten.

Doppler-basierte akustische Abbildung zeigt, kleine Äste, während Richtungsinformation des Blutstroms ist durch Farb-Doppler-Akquisition (Abbildung 13). MCA Arterie Funktion wird von Pulsed-Wave-Ultraschall-Technik (14 und 15) bestätigt. Photoakustische Signal enthaltenem Hämoglobin in zirkulierenden roten Blutkörperchen detektiert und analysiert werden, um Daten über seine Molekular oxidativen Zustand zu sammeln und die Blutsauerstoffsättigung zu berechnen (16 und 17). Hematic Sauerstoffgehalt kann zu akustischen Daten, um die Diskriminierung von arteriellem Blut aus venösem Blut bestätigen korreliert werden.

Mit dem Hinweis des Wandlers in Richtung der Hinterhauptsloch wird die Vision auf den Kopf axialen Ebene (Abbildung 9) projiziert und diese Bildebene kann auf variable Neigungswinkel beigelegt. In diesem Fall könnte der hintere Sicht Bildgebung des Gehirns durch ein konnotiert werden hohe Eindringtiefe, wegen des größeren okzipitalen Eintrag. Der Kreis von Willis, ein charakteristisches Schiff-Konfiguration in der Tiefe des Gehirns, können lokalisiert und durch Anwendung aller oben genannten Techniken untersucht werden. Basilararterie (BA) an der ventralen Seite des Kleinhirns ausgeführt, führt schließlich zu encephalon und symmetrisch gabelt sich in zwei Zweige. Diese beiden Niederlassungen auf der Bauch Gehirn ausgebreitet und dann wieder miteinander zu verbinden, damit die Schaffung einer Ringstruktur (Kreis von Willis). Diese Grund tief Kreis ist die Gefäß Keller, aus dem alle mittelgroßen Blutgefäße entstehen, wie beispielsweise der hinteren, dem Nahen und Vorderhirnarterien (PCA, MCA und ACA beziehungsweise), die die wichtigsten Effektoren eines massiven Blutversorgung des Gehirns . Im Farbdoppler-Modus, ist die Identifizierung von mittelgroßen Filialen möglich und erlaubt die klare Visualisierung von gekrümmten Gefäßsegmente (wie die PCA) Eintritt in den Kreis von Willis (Abbildung 18).

nt "> Die Groß Parenchymgewebe wurde auch mit PA Modalität im Hinterhauptfortsatz (19) aufgezeichnet werden, um Gefäß Charakterisierung der spektralen Plot (Abbildung 20). Mit diesem Spektrum ist möglich zu unterscheiden die von arteriellen und venösen Gefäßen abgeleiteten Signal.

Abbildung 1: Lage der Schädel Foramina und entsprechende Sicht für die Bilderfassung Die Ratte Kopf im Profil (a) und die Websites, auf denen die Bild-Übertragungsgerät platziert, auf zeitliche Foramen (lila Pfeil) gegenübergestellt werden, und auf der Hinterhauptsloch. (gelber Pfeil) im Profil (b).

Abbildung 2: Tier Verfügung für zeitliche Bild Acquisition. (A) Die Anordnung des Tieres auf der Arbeitsplatte für die Bildaufnahme: nach dem Kopf rasieren, das Tier in Bauchlage mit dem Körper auf der einen Seite leicht geneigt, um die zeitliche Seite des Kopfes ausgesetzt platziert. Die Arbeitsplatte kann gegebenenfalls mit einer Heizvorrichtung zum Körper warm das Tier während der Aufnahme zu halten ausgestattet werden. Einige Watterollen verwendet werden, um diese Position zu erhalten, während Pflaster befestigen Sie die Pfoten auf die Sensoren für die Überwachung der Vitalfunktionen. (B) Eine einheitliche Schicht von Ultraschall-Gel deckt den Bereich des Kopfes, an dem der Wandler wird während der Abbildung positioniert werden.

Abbildung 3: Acquisition Parameter für B-Mode-Bildgebung. (A) Eine beispielhafte Bildschirmfoto zeigt das Panel Berichterstattung wichtig für bildgebende Verfahren in B eingesetzten Erfassungsparameter-Modus. (B) Wichtig ist, dass die Sendefrequenz auf niedrige Werte (16 MHz) eingestellt, um US zu verbessern Gewebepenetration.

Abbildung 4: Querbildaufnahme aus zeitlichen Foramen (a) Der virtuelle Referenzachse Beitritt der Ohrmuschel, um das Auge und die Kippbewegung (roter Pfeil), um den Wandler Neigung und die Bildaufnahme-Ebene variieren, (b) gegen den Uhrzeigersinn Bewegung gegenüber. Referenz Ohr zu Augenachse und variable Neigung der Wandlerposition, c) Rechtsbewegung in Bezug auf Ohr-zu-Auge-Achse und variabler Neigung der Wandlerposition verweisen.

Abbildung 5: Optimale Tiefenschärfe für die US-PA und Bildaufnahme. Bei der Suche nach den interessierenden Bereich weist das Abbildungsfokustiefe (durch ein gelbes Dreieck dargestellt) bei etwa 10 mm Tiefe von der US / Laserquelle eingestellt werden, um eine optimale Bildqualität zu erhalten.

Abbildung 6: Acquisition Parameter für Farb-Doppler-Modus-Bildgebung. (A) Vor Beginn der Bildaufnahme im Farbdoppler-Modus, die Atmung Tor Option kann, eingeschaltet werden, um die durch physiologische Atembewegungen erzeugt Artefakt zu vermeiden. (B) eine beispielhafte Bildschirmfoto zeigt die für bildgebende Verfahren in der Farb-Doppler eingesetzt Aufnahmeparameter Modus.

Abbildung 7: Erwerb Parameter für die Power-Doppler-Modus-Bildgebung. Ein beispielhaftes Bildschirmfoto zeigt die für bildgebende Verfahren in der Power-Doppler-Modus verwendeten Aufnahmeparameter.

Abbildung 8: Acquisition Parameter für Photoakustische Bildgebung Modus. (A) Das Panel Berichterstattung wichtig für bildgebende Verfahren in Photoakustische Modus beschäftigt Aufnahme-Parameter. (B) Erwerb einer photoakustische Spektrum, basierend auf einer Laseranregung von 680 nm bis 970 nm, mit einem Wellenlängenbereich von 5 nm (als Schritt Größe). (für einzelne Welle Photoakustische Modus verwendet bei 750 nm und 850 nm, zur Diskriminierung von de-sauerstoffreiches und oxygeniertes Hämoglobin Signale bzw. c) Erfassungsparameter.

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Abb. 9: Quer Bildaufnahme vom Hinterhauptloch (a) Transducer Positionierung am Hals Tieres (gelber Pfeil) und der resultierende Querabbildungsebene, dass praktisch Abschnitten der Kopf auf der caudo-rostrale Richtung, (b) Rückansicht des Wandlers Positionierung und Bildaufnahme-Ebene.

Abb. 10: B-Mode Erwerb von zeitlichen Foramen für die Individuation der anatomischen Referenzen Epidermis (a), Schädel (b) und Parenchym (c) kann leicht zu unterscheiden, sondern kann auch andere anatomische Referenzen nachgewiesen werden können, wie der Riss ( d) um die ventrale Hirnbereich und die charakteristische Form der Sehbahn (e).

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Abbildung 11: Power-Doppler-Modus Erwerb durch zeitliche Foramen für die Individualisierung von Gefäß Referenzen MCA Anhebung der ICA über die zeitliche Gehirn Seite.. Um diese Ansicht zu erhalten, wurde quer Bild mit dem Hinweis des Wandlers auf die zeitliche Foramen und durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn erworben.

Abbildung 12: Power-Doppler-Modus Erwerb durch zeitliche Foramen für die Individualisierung von Gefäß Referenzen MCA Anhebung der ICA über die zeitliche Gehirn Seite.. Um diese Ansicht zu erhalten, wurde quer Bild mit dem Hinweis des Wandlers auf die zeitliche Foramen und durch Drehen im Uhrzeigersinn erworben.

Abbildung 13: Farb-Doppler-Modus Nahme durch zeitliche Foramen für die Individualisierung von Gefäß Referenzen MCA Anhebung des ICA von der zeitlichen Gehirn Seite.. Richtungsinformation des Blutstroms wird mittels einer Farbskala ausgedrückt, wobei zwischen Flussbewegungen in Richtung der Wandlereinrichtung gelenkt und von dieser weg.

Abbildung 14: Pulsed-Wave-Modus Erwerb durch zeitliche Foramen für die Individualisierung von Gefäß Referenzen Bestätigung der arteriellen Eigenschaften Blutkreislauf im Inneren Gefäße, hypothetisch als Arterien identifiziert wurden:. Pulsed-Wave-Modus liefert Informationen über die Variation der Strömungsgeschwindigkeiten, die in Beziehung gesetzt werden können Herz Pulsationseffekt (mehr intense in Arterien als Venen).

Abbildung 15: Pulsed-Wave-Modus Erwerb durch zeitliche Foramen für die Individualisierung von Gefäß Referenzen Identifizierung durch Pulsed-Wave-Modus der Blutgefäße wie Venen, wo die Herz Pulsation Wirkung auf Strömungsgeschwindigkeiten zu vernachlässigen ist..

Abbildung 16: Photoakustische Modus Nahme durch zeitliche Foramen für die Individualisierung von Gefäß Referenzen. Parenchymale Innengefäße im Gehirn zeitlichen neben B-Modus (links) und Einzelwellenphotoakustische Modus (rechts) visualisiert. Die Maßstabsleiste Farben reflektieren unterschiedliche Intensitätswerte der photoakustischen Signals, durch eine Laseranregung bei einer ausgewählten Wellenlänge durchgeführt induziert. In order, um Venen und Arterien zu individualisieren zu können Anregungswellenlängen von 750 und 850 nm eingestellt werden, die die Werte, um die photoakustische Emissionsspitzen für sauerstoffarmes und oxygeniertem Hämoglobin bzw. zu erhalten.

Abbildung 17: Photoakustische Modus Nahme durch zeitliche Foramen für sauerstoffreiches und de-oxygenierten Hämoglobins Diskriminierung. Interne Gefäße im Gehirn zeitlichen neben B-Modus (links) und Oxy-Hemo Photoakustische Modus (rechts) visualisiert. Die Maßstabsleiste Farben reflektieren unterschiedliche Prozentwerte der Sauerstoffsättigung des Blutes Hämoglobin.

Abbildung 18: Farb-Doppler-Modus Nahme durch Hinterhauptloch für die Individualisierung von Gefäß Referenzen.Gebogene Gefäßsegmente Erstellung der Keller Struktur der Kreis von Willis, im ventralen Hirnseite.

Abbildung 19: Photoakustische und B-Mode Nahme durch Hinterhauptloch für die Individualisierung von Gefäß Referenzen. Nell'immagine in B-Mode-si possono evidenziare le strutture Anatomiche individuabili con la Proiezione occipitale e nella Corrispondente acquisizione con modalità fotoacustica con rilevamento spettrale tra 670 nm eine 980 nm (con Schritt di 5 nm).

Abbildung 20: Photoakustische und B-Mode Nahme durch Hinterhauptloch für die Individualisierung von Gefäß Referenzen. In questa vorstellen viene rappresentato lo spettro corrispondente alle tre ROIs tracciate a livello del parenchima cerebellare; in particolare sono tracciate a livello di tre strutture vascolari, la cui si tipologia differenzia a livello dell'andamento spettrale (ROIs fuxia e celeste corrispondono ein strutture vascolari venose; ROI gialla corrisponde ad una struttura vascolare arteriosa).

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um hochwirksame Hirnabbildungsleistung bei Kleintieren bieten optimiert. Bilder können in verschiedenen Modalitäten von genau nach den Anzeigen über die Aufnahmeparameter und dem Wandler Positionierung auf Schädel Foramina erworben werden. Insbesondere ist die Positionierung auf der temporalen Seite der kritischste, da in den USA und der Laser so genau wie möglich zentriert ist, um das Foramen, die kleiner als die Hinterhaupts eines korrekt eindringen kann. Dennoch dank dieser Versuchseinstellung, hämodynamischen Funktionen, physiologische oder pathologische Wettbewerben bezogen sind verfügbar und können sogar in tiefen Hirnregionen, die in der Regel schwer zu charakterisieren sind ausgewertet werden.

Da erfolgreiche Bilderfassung hängt von der Genauigkeit des Wandlers Positionierung weist diese Abhängigkeit, sorgfältig berücksichtigt werden, denn es kann die Bildqualität beeinträchtigen. Beispielsweise,einige anatomische Strukturen von Interesse konnte nicht vollständig in den Erwerb Abbildungsebene und ihre Identifikation von Bildern, die nur einen Teil ihres Sehvermögens anbieten könnte suboptimal Folge aufgenommen werden. Darüber hinaus würde ein US und PA Tomographie-Erfassung in einem dreidimensionalen Modalität (3D-Modus) durchgeführt mit der zuvor beschriebenen experimentellen Umgebung kompatibel sein, da sie die Wandler entlang einer vordefinierten Bahn bewegen automatisierten erfordert. Schließlich, aufgrund der natürlichen anatomischen Variabilität, die Dimension des Schädels Öffnungen signifikant unter Tieren variieren, damit unvorhersehbaren Auswirkungen auf den Erfassungsprozess aufweist. Diese Tatsache macht sich die Bildqualität in Abhängigkeit von den Eigenschaften jedes einzelnen. Folglich ist die Unmöglichkeit, diese Strategie zu einigen Tieren ist zu berücksichtigen bei der Gestaltung der Versuchsprotokoll werden gelten.

Insbesondere wird ein bemerkenswertes Interesse an Hämodynamik durch seine wesentliche Rolle bei der Bestimmung der adressierte,Bioverteilung von Arzneimitteln oder anderen exogenen Molekülen nach systemischer Applikation ^28-29. Die applikative Auswirkungen auf dem Gebiet der molekularen Bildgebung werden, viele, angefangen von der Validierung von Blutpool-Kontrastmittel-Bildgebung zur Bild überwacht Drug-Delivery-Studien Ultraschall-induzierte BBB Öffnung ³⁰ erforderlich ist. All diese Forschungszwecke wird sicherlich von der minimalen Invasivität des Protokolls, wenn man bedenkt, dass zu profitieren, ohne zusätzliche Operation wird die Gefahr des Todes oder unerwünschte Nebenwirkungen erheblich reduziert und die Langzeitüberwachung auf der gleichen Tiermodellen möglich ist.

Zusammenfassend wird die vorgestellte Protokoll dem Arzt ermöglichen, die anatomischen Topographie und das Gefäßmuster der normalen oder pathologischen Hirngewebe in der Forschung bedienTierModellen effizient Bild und richtig zu interpretieren. Während aktuelle Methoden werden hauptsächlich beschränkt auf kortikaler Bild ^25-27 tomographische, gibt diese Einstellung die Möglichkeit to zeigen verschiedene Prozesse, die tiefe Gehirnphysiologie beeinflussen, durch die Zusammenführung Vorteile sowohl von US-und PA-Bildgebung zur Verfügung gestellt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
High frequency ultrasound and photoacoustic imaging station (VEVO LAZR 2100 system)	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	FUJIFILM VisualSonics Inc.		http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf
Ultrasound Transmission Gel (Aquasonic 100)	Parker Laboratories Inc.	01-08	http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories		Three healthy 6-week old Sprague-Dawley rats were purchased from Charles River Laboratories and kept in standard housing (12 hr light-dark cycles) with a standard rodent chow and water available ad libitum. Provided by: http://www.criver.com/