Parênquima não-invasivo, Vascular e Metabólica alta freqüência ultra-som e Fotoacústica Rat Cerebral Profunda Imagem

Resumo

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Resumo

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

Introdução

Estratégias para descrever minuciosamente características da hemodinâmica do cérebro no sistema nervoso central de animais pequenos são necessários para fazer avançar o campo de neuroscience ^1-3. A técnica apresentada demonstra como executar acústica não-invasivo e de imagem fotoacústica no cérebro pequeno animal a fim de examinar a biologia vascular, arranjo e função.

Técnicas de imagem Optical permitir a localização de eventos relacionados com a atividade neural ^2,4-5 e adquirir simultaneamente os sinais gerados pela hemoglobina, tanto em estados oxigenada e não oxigenados ^6. No entanto, devido à absorção e espalhamento fotônico, imageamento óptico puro sofre de baixa resolução espacial e tecido limitada profundidade de penetração ^7-8. Por outro lado, a acústica oferecem a oportunidade de realizar imagem mais profunda com maior resolução espacial espaço, mas é impedido por salpico e limitado contraste ^9-11. Através da combinação de características de fotônica with ultra-som, técnica fotoacústica melhora tanto de imagem e potencialidades de diagnósticos de métodos únicos ^12-16.

Imaging Fotoacústica do cérebro tem o potencial para elucidar questões de múltipla em neurobiologia, no entanto, a calota craniana que naturalmente protege o encéfalo, dramaticamente limita tanto a ^17-19 penetração nos tecidos fotônicos e ultra-som. Além disso, os ossos promover dispersão de luz e som, resultando em perda de sensibilidade e de imagem aberrações ^17-18. Como conseqüência, ultra-som e de imagem fotoacústica cérebro pode ser facilmente realizada em animais recém-nascidos antes de ossificação ^20, mas a anatomia profunda e fisiologia do cérebro adulto são claramente acessível apenas após craniotomia ^21,22. Infelizmente, a cirurgia necessária para a remoção do crânio é tecnicamente difícil e os seus efeitos podem ser prejudicial para alguns fins experimentais, tornando assim difícil para monitorar a progressão da doença neural nomesmo animal ao longo do tempo. Portanto, um método não-invasivo para a imagem biologia cerebral profunda em pequenos modelos animais é altamente desejável. Na literatura o método de fotões reciclador ¹⁷ é relatado como uma forma de reduzir a perda de telefone e aumentar a transmissão através do crânio intactos, melhorando o sinal fotoacústico para ruído (SNR) e o contraste do alvo.

O protocolo apresentado tem como objetivo fornecer um método confiável para acústica cérebro subcortical e imagem fotoacústica em roedores de uso investigação (especificamente em ratos), sem qualquer cirurgia invasiva. O procedimento baseia-se no uso de dispositivos portáteis de transdução de ultra-som de alta frequência e de imagem fotoacústica. Em contraste com a tecnologia de imagens tomográficas ^23, portátil e transdutores direcionais ²⁴ permitem a seleção de regiões específicas do crânio com espessura naturalmente reduzido, denominado fissuras ou scissures. As fendas principais (forames) presentes no vertebrado umnimal crânio são necessárias para localizar os feixes de nervos, vasos ou outras estruturas que ligam os circuitos internos do encéfalo para outras partes do corpo. As fendas principais são encontrados em aberturas osso de diferentes tamanhos que podem ser explorados como passagens específicas para as ondas de ultra-som e de laser. Tal imagem alvo reduz efeitos de reflexão de ondas causados ​​pelas interfaces de osso e aumenta a sensibilidade, aumentando a profundidade de penetração de imagem. Nesta perspectiva, o transdutor de imagem podem ser dispostos de modo a ser perpendicular às fissuras localizadas no temporal e occipital do lado do crânio (Figura 1), de modo a convergir maximamente o ultra-som e vigas fotónicas sobre estas áreas. Esta orientação aumenta tanto a qualidade do sinal e força o sinal para prosseguir através de uma camada de osso mais fino em relação a outras orientações cranianos. Assim, as ondas transmitidas e reflectidas sofrer um menor grau de espalhamento, permitindo recolha de sinais intensos provenientes de mais profundocamadas de tecido. Ao contrário dos procedimentos anteriores, esta configuração experimental requer que raspa a cabeça apenas animal, enquanto nenhuma outra cirurgia é necessária.

Com o protocolo proposto, a imagem latente é realizada a relativamente alta resolução espacial, revelando tanto, estruturas anatômicas de referência específicos e vasos sanguíneos mais profundos do que estado atual de métodos de arte, tudo ao mesmo tempo a pele do animal e do crânio permanecem intactos. Imagens coronais e axiais exclusivos podem ser adquiridos através da exploração de diversas modalidades de aquisição de imagens de ultra-som (B, Doppler, Doppler colorido, modo de onda pulsada) em paralelo à imagem fotoacústica. Um repertório extenso de parâmetros podem ser extraídos a partir dessas imagens, permitindo representação da anatomia vascular do parênquima e ao lado de um conjunto de características que afectam toda a dinâmica de circulação sanguínea. Este protocolo pode ser usado para imagem características básicas parênquima cortical em High Frequency modalidade Ultrasonic B Mode, as artérias carótidas basilar e internos (BA e ICA respectivamente) compondo o Círculo de Willis, a artéria cerebral média (MCA) e outros detalhes do aparelho circulatório. Além disso, o sangue quantificação do fluxo, a média de velocidades de transmissão, descrição direcional movimento e dados de saturação de oxigênio podem ser coletadas de cortical para regiões profundas do cérebro.

Esta nova estratégia tem um grande potencial para uma variedade de aplicações e satisfaz a necessidade urgente de procedimentos seguros para descrever características profundas do cérebro que são cruciais em várias patologias. Além disso, devido à sua capacidade de invasão mínima, o protocolo apresentado pode permitir estudos de imagem possíveis inúmeras sobre o sistema nervoso central, particularmente aqueles que necessitam de um acompanhamento a longo prazo ou envolvendo modelos animais patológicas delicados.

Protocolo

Experimentos necessários para desenvolver o protocolo foram realizadas de acordo com as normas nacionais e foram aprovados pelo comitê de ciência ética local (Comitato di Bioetica di Ateneo), operando dentro da instituição, da Universidade de Turim, Turim, Itália.

1. Preparação

1. Anestesia
   1. Colocar o animal dentro da câmara de isoflurano apropriado para anestesiar-lo.
   2. Encha a câmara com misto O ₂ e gás isoflurano para uso veterinário a uma concentração de 2,5% em uma câmara de gás 2 L e esperar por cerca de 3 minutos para o rato para adormecer. Verifique se o efeito da anestesia por uma pitada dedo do pé.
   3. Uma vez que a anestesia tem efeito, retire o rato e pesar.
   4. Espalhar uma camada fina de água gel oftálmico solúvel em olhos do animal para as proteger e para manter a hidratação fisiológica ocular.
   5. Coloque o rato para baixo sobre uma bancada de ultra-som e da estação de imagem fotoacústica. EUordem n para manter o efeito de anestesia, rapidamente posicionar o nariz dentro da máscara apropriada proporcionando um fluxo constante de anestesia (isoflurano a 2% -2,5% em oxigénio de 1 L / min).
2. Raspar o animal
   1. Espalhe uma camada consistente de creme de depilação na superfície da cabeça, com atenção para cobrir áreas orelhas e pescoço circundantes. Deixe o creme agir por alguns minutos e retire com cuidado para fora com uma espátula. Softly remover todos os restos de creme com uma esponja úmida para limpar a pele com precisão.
      NOTA: A pele animal aprisiona ar que afeta negativamente a aquisição de imagens de ultra-som baseado, assim que tem que ser necessariamente removido, tanto quanto possível.
3. Posicionando o animal
   1. Organizar o animal em uma posição spread-águia. Monitorar os sinais vitais, por meio de sensores de parâmetros vitais apropriadas no tampo (se estiverem presentes). Incline-se as patas sobre os sensores após a aplicação de algumas gotas de eletrodo de creme para uso profissional.
      NOTA: Durante a anestesia, assegurar que os parâmetros vitais tem valores como se segue: a temperatura corporal do rato ≈ 37,5 ° C, batidas cardíacas por minuto (BPM) varia entre 250 e 350 e a taxa respiratória está compreendida na gama de 40-80 respirações por minuto .
   2. Finalmente prender os membros com hipoalergênico remendo de seda artificial. Se necessário, a espalhar-se uma fina camada de água gel oftálmico solúvel para proteger os olhos do animal.

2. Aquisição de Imagem de Temporal Point of View

1. Posicionando o animal
   1. Manter o animal numa posição de bruços, rodar o corpo ligeiramente na lateral, com um ângulo de inclinação de aproximadamente 45 ° com respeito ao eixo do corpo sagital. Use pequenos rolos de gaze de algodão como está a organizar corretamente o descarte (Figura 2a).
   2. Levante a cabeça de animal e gire-o levemente de um lado (Figura 2a). Use um rolo de algodão como stand manter o focinho bem inserted para a máscara de anestesia.
   3. Inclinar o tampo de trabalho a um ângulo de cerca de 30 ° em relação ao plano horizontal.
   4. Ligue o transdutor de imagem a um ângulo de cerca de 30 ° em relação ao plano vertical.
2. Ultrasonic e aquisição de imagem fotoacústica anatômica e vascular
   1. Gire a imagem digitalizar, introduzir a aquisição de imagem Modo B e devidamente definir todos os parâmetros de aquisição de imagem de respeitar possíveis requisitos dados do experimento (Figura 3A).
      NOTA: Ajuste da frequência de transmissão central tão baixa quanto possível (16 MHz, a Figura 3b), de modo a ter a profundidade de penetração máxima possível para o transdutor.
   2. Eliminar uma camada consistente (cerca de 1 cm de espessura) de água hipoalergênico ultrassom solúvel gel de transmissão na cabeça do animal (Figura 2b). Cobrir a cabeça do transdutor com uma camada fina do mesmo gel e colocá-lo em contacto com a camada sobre o rat. Use gel quente para minimizar hipotermia localizada.
   3. Iniciar a aquisição de imagem em modo B e ajustar o posicionamento do transdutor em tempo real, através da identificação de referências anatómicas e centrando a região de interesse para o ponto médio do monitor. Certifique-se de eliminar as bolhas de ar em qualquer nível retido na camada de gel, porque afetam negativamente a aquisição.
   4. Posicionar o transdutor a alinhá-lo com o eixo virtual que liga o ouvido para o olho (Figura 4a), para se obter um feixe de focalização óptima. Adquirir diferentes pontos de vista do volume do cérebro interno, no sentido horário ou anti-horário de rotação (Figura 4-B e C).
   5. Eventualmente prender o transdutor em um suporte mecânico para garantir de forma estável a posição e ajustar a orientação de uma maneira bem.
   6. Assegure-se que a região de interesse cerebral localiza a 10 mm de profundidade em relação à fonte de transdutor de ultra-LASER, a fim de receber um ph óptimootoacústicas sinal de resposta (Figura 5). Em seguida, coloque o indicador de US onda focalização exatamente no centro da área analisada.
      Nota: Durante a pesquisa de áreas de interesse, evitar a activação do portão opção respiração, a fim de acelerar o processo de posicionamento.
   7. Entrar no Modo Doppler a cores para visualizar os vasos sanguíneos do cérebro internos de forma sensível alta.
   8. Uma vez que o posicionamento foi definido de forma adequada para visualizar as regiões queriam, ative a opção portão respiração para evitar efeitos indesejáveis ​​relacionados com o movimento (Figura 6a).
   9. Escolha o desejado conjunto de parâmetros de aquisição no modo Doppler a cores (Figura 6b) e adquirir imagens nesta modalidade de distinguir velocidades corrente sanguínea e as direções, até vários milímetros de profundidade de penetração.
   10. Digite o modo pulsado onda Doppler e aquisição de imagens para detectar pulsação do sangue arterial e para diferenciar entre uma artériasveias nd.
   11. Enter Modo Power Doppler e os parâmetros de aquisição definidos (Figura 7) para efectuar a quantificação do sinal na base do número de eventos de espalhamento causadas pelo movimento de fluxo, e, portanto, a diferenças nas taxas de fluxo avaliadas.
   12. Entrar no modo de fotoacústica e devidamente refinar os parâmetros de aquisição (Figura 8a) para coletar dados sobre o conteúdo total de hemoglobina no sangue ou grau de oxigenação em uma determinada área. Ao produzir excitação laser em toda uma gama de comprimento de onda (a partir de 680 nm a 970 nm, A Figura 8b), a absorção da hemoglobina total presente em diferentes estados químicas dentro de um tecido pode ser quantificado. Através da realização de compilação de sinal em determinados comprimentos de onda individuais (Figura 8c), que é possível isolar a contribuição de sinal distintos, devido à absorção de oxi e espécies puras de-oxi.

3. Criação de Imagens do Point of View occipital

1. Posicionando o animal
   1. Manter o animal em uma posição prona, abaixe a cabeça de animal e usar pequenos rolos de gaze de algodão como lateral, está a organizar corretamente o descarte.
   2. Ligue o transdutor de imagem paralela ao plano transversal da cabeça do animal (Figura 9).
      NOTA: Neste modo, a aquisição irá ser centrado através do forame occipital na base do crânio. Ao variar o ângulo de inclinação da orientação da sonda (Figura 9), será possível a aquisição de imagens de vasos internos em vistas diferentes, dependendo da configuração de inclinação.
2. Ultrasonic e aquisição de imagem fotoacústica anatômica e vascular
   1. Digite a aquisição de imagem Modo B, definir todos os parâmetros de aquisição de imagem conforme relatado anteriormente (Figura 3) e espalhar as camadas de gel de ultra-som necessárias na sonda e na nuca animal.
   2. Organizar o transdutor de ficar quase horizontal, em order a ser dirigida ao longo das anatómicas eixo posterior-a-anterior do corpo. Aponte-o para o lado frontal do focinho e incline-o levemente para a frente.
   3. Iniciar a aquisição de imagens no modo B e modo de cor Doppler (Figuras 3 e 6). Ajustar com precisão a posição do transdutor e remover as bolhas de ar a partir do revestimento de gel, como descrito anteriormente. Se possível, fixar o transdutor em uma posição firme para controlar a orientação de uma forma muito bem e escolher o melhor ângulo de inclinação para adquirir imagens das regiões anatômicas desejados.
   4. Visualizar os vasos sanguíneos do cérebro internas no Modo Power Doppler, configurando adequadamente os parâmetros de aquisição (Figura 7).
   5. Localize artérias intensamente pulsava pelo modo Doppler pulsátil. Distingui-las das veias, o que, inversamente, são caracterizadas por baixos níveis de pulsação do fluxo sanguíneo.
   6. Recolha de sangue de dados velocidades de fluxo e direções no modo Doppler a cores, adaptando adequadamente ACQparâmetros uisition (Figura 6).
   7. Hemodinâmica cerebral profunda conjunto completo de dados de caracterização, adicionando informações sangue química obtida através da aquisição fotoacústica (Figura 8). Executar esta avaliando em particular a quantidade de parâmetros hemáticas, tais como a percentagem de saturação de _O2 e o teor de hemoglobina total (HBT), que são geralmente medido, definindo o comprimento de onda do laser de excitação a 750 e 850 nm (Figura 8c).

4. Fim da Aquisição e remoção de animais

NOTA: Adequadamente considerar todo o tempo dedicado ao processo de aquisição de imagem (a partir do passo 1 para o passo 3), o qual é sujeito a restrições principais relacionados com a dose do anestésico aplicado ao animal.

1. Guarde todos os dados adquiridos, vire o laser pulsante off saindo do modo de aquisição Fotoacústica e distanciar o transdutor.
2. Enquanto se mantinha a animal sob o efeito de anestesia, começar a limpá-lo, removendo cuidadosamente o gel de proteção dos olhos com um cotonete molhado. Use uma espátula e várias toalhas de papel para remover completamente o gel de ultra-som da cabeça e do focinho, em seguida, limpe-os com uma esponja molhada. Tenha cuidado para não danificar a pele raspada delicado.
3. Retire o adesivo usado para prender os membros e desconectá-los dos sensores que monitoram os parâmetros fisiológicos. Transferir rapidamente o animal da bancada aquisição de uma gaiola diferente.
4. Hospedar o animal em uma gaiola pequena para a recuperação da anestesia. Certifique-se de que os animais não devem partilhar a gaiola durante esta fase, a fim de evitar agressões
5. Coloque a gaiola de recuperação sob uma luz infravermelha para manter o animal aquecido. Espere até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Verifique as condições dos animais saúde gerais, antes de movê-lo para a sala de animais de criação.

Resultados

Este método permite à imagem tanto estruturas de referência anatômicos e vasos sanguíneos específico a relativamente alta resolução espacial, mais profundo do que a técnica atual com a pele do animal e do crânio intacto. Nas nossas condições experimentais, a profundidade do sinal PA é de 4,5 mm e a resolução axial é de 75 um, com um FOV 23 x 15.5 cm. Experiências com Fotoacústica Tomografia modalidade ¹⁹ mostrou um valor de resolução <1 mm. A gama de valores de SNR é de 21,6 dB para 23,8 dB (obtidos por 5 pontos diferentes, seleccionados aleatoriamente no tecido cerebral e fundo). Justapor o transdutor no crânio lado temporal, as imagens do cérebro pode ser adquirida como secções transversais ou mesmo coronais com base no ângulo de posicionamento seleccionado do transdutor com um ponto de imagem resultante de vista de lateral (Figura 4). Epidermis, ossos do crânio e material de parênquima estão bem representados na ultra-som B-Mode, uma vez que muito diferentes em termos de acimpendence oustic (Figura 10). Mesmo se sua configuração depende do ponto de vista escolhido, alguns sites de referência anatômicos sobre o parênquima são reconhecíveis, tais como fissuras que separam cérebro porção interna do córtex e do trato óptico característico em forma (Figura 10). Além disso, um grande número de navios são visíveis tanto nas modalidades de imagens de ultra-som e fotoacústica. Interseções característicos da carótida interna Artery (ICA) com outros principais navios de grande porte que funcionam ao longo da superfície lateral externa do cérebro do animal pode ser facilmente reconhecido. Rotas vasculares grandes, como o ICA, fornecer um suprimento de sangue maciça para satisfazer a necessidade neuronal consistente de energia e oxigênio. O ICA, originado na artéria carótida comum (CCA), é executado no lado lateral da cabeça em vários milímetros de profundidade, vai além de todos os seus locais de bifurcação e, finalmente, chega a parte frontal da cabeça. Este fluxo de sangue principal espalha entre intermedicomi porte navios, antes de ser canalizada em arteríolas sempre menores para finalmente nutrem os neurônios. Do ponto de vista temporal, é possível traçar o padrão da Artéria Cerebral Interno, que bifurca-se em embarcações voltadas para frente e lateral do cérebro lateral. Imagens coronais e transversais pode ser adquirido com inclinação diferente do transdutor em relação à direcção do eixo virtual juntando o olho e a orelha do animal (Figura 4). Ao inclinar o transdutor de acordo com as projecções descritas na Figura 4, é possível obter imagens resolvidos da Artéria Cerebral Média (MCA), que surge a partir de ACI e ainda se divide em dois ou mais ramos, que finalmente envolvente lobos corticais (figuras 11 e 12). Os melhores efeitos visuais foram obtidos para MCA com a inclinação da sonda como mostrado na Figura 4c e para ICA como mostrado na Figura 4-B.

Imaging acústico à base de Doppler revela pequenos ramos, enquanto a informação de direção da corrente sanguínea é disponíveis graças à aquisição Color Doppler (Figura 13). Recurso artéria MCA é confirmado por ultra-som pulsado Onda técnica (Figuras 14 e 15). Sinal fotoacústico de hemoglobina contida nos glóbulos vermelhos circulantes podem ser detectados e analisados ​​para coletar dados sobre o seu estado oxidativo molecular e para calcular a saturação de oxigênio no sangue (Figuras 16 e 17). Teor de oxigénio hemáticas pode ser correlacionada com dados sonoros, a fim de confirmar a discriminação de sangue arterial do sangue venoso.

Ao apontar o transdutor em direção ao forame occipital, a visão é projetada na cabeça plano axial (Figura 9) e este plano de imagem pode ser liquidada em ângulos de inclinação variável. Neste caso, o ponto de vista posterior da imagiologia cerebral pode ser conotado por um de alta profundidade, por causa da entrada occipital maior. O círculo de Willis, uma configuração de recipiente característico no cérebro profundo, pode ser localizada e examinados através da aplicação de todas as técnicas acima mencionadas. Artéria basilar (BA), em execução no lado ventral do cerebelo, eventualmente, leva à encéfalo e simetricamente bifurca-se em dois ramos. Esses dois ramos no cérebro ventral espalhar-se e, em seguida, juntar-se de novo, portanto, a criação de uma estrutura em anel (Círculo de Willis). Este círculo profunda basal é o porão vascular a partir do qual surgem todos os vasos sanguíneos de médio porte, como as artérias posteriores, médio e anterior cerebral (PCA, MCA e ACA, respectivamente), que são os principais efetores de um suprimento de sangue maciço para o cérebro . No Modo Doppler a cores, a identificação dos ramos de tamanho médio é viável e permite a visualização clara dos segmentos vasculares curvas (como o PCA) que entra no Círculo de Willis (Figura 18).

nt "> O tecido do parênquima cerebral foi também registado com modalidade PA em projecção occipital (Figura 19) mostram a caracterização vascular na trama espectral (Figura 20). Com este espectro é possível distinguir o sinal obtido a partir de vasos arteriais e venosos.

Figura 1: Localização do forame crânio e respectivo ponto de vista para aquisição de imagem A cabeça de rato no perfil (a) e os locais onde o dispositivo transdutor de imagem podem ser colocados para ser justapostas em forame temporais (seta roxa) e sobre o forame occipital. (seta amarela) no perfil (b).

Figura 2: eliminação Animal para temporais acquisitio imagemn. (A) A disposição do animal sobre a bancada de aquisição de imagens: após a cabeça de barbear, o animal é colocado numa posição de bruços, com o corpo ligeiramente inclinada de um lado de forma a expor o lado temporal da cabeça. A bancada pode ser, possivelmente, dotado de um dispositivo de aquecimento para manter o corpo quente do animal durante a aquisição. Alguns rolos de algodão podem ser utilizados para obter esta posição, enquanto que os emplastros adesivos prender patas sobre os sensores para a monitorização de sinais vitais. (B) Uma camada de gel de ultra-som consistente cobre a área da cabeça em que o transdutor será posicionado durante o exame.

Figura 3: parâmetros de aquisição de imagem B-Mode. (A) Uma imagem ilustrativa que mostra o painel informando os parâmetros de aquisição importantes utilizados com imagens do cérebro em B-mode. (B) É importante ressaltar que a freqüência de transmissão foi definido em valores baixos (16 MHz) para melhorar a US penetração nos tecidos.

Figura 4: aquisição de imagem transversal do forame temporal (a) O eixo de referência virtual juntando a aurícula do olho e do movimento de inclinação (seta vermelha) para variar a inclinação transdutor e do plano de aquisição de imagem; (b) movimento anti-horário com relação a. eixo de referência orelha-a-olho e inclinação variável da posição do transdutor; c) o movimento no sentido horário em relação ao eixo de referência orelha-a-olho e inclinação variável da posição do transdutor.

Figura 5: profundidade do foco ideal para USe aquisição de imagem PA. Ao olhar para a área de interesse, a profundidade do foco de imagem (representada por um triângulo amarelo) deve ser fixado em cerca de 10 mm de profundidade a partir da fonte de laser / EUA, a fim de obter um desempenho ideal de imagem.

Figura 6: parâmetros de aquisição de imagem Modo Doppler a cores. (A) Antes de iniciar a aquisição de imagens no modo Doppler a cores, a opção portão respiração pode ser ligado, a fim de evitar o artefato gerado por movimentos respiratórios fisiológicas. (B) Uma tela exemplificando mostrando os parâmetros de aquisição importantes utilizados com imagens do cérebro em Doppler colorido Mode.

Figura 7: Aquisição parâmetros para a imagem latente modo Doppler de potência. Uma imagem ilustrativa mostrando os parâmetros de aquisição importantes utilizados com imagens do cérebro em modo Doppler de potência.

Figura 8: parâmetros de aquisição de imagem Modo Fotoacústica. (A) O painel relatando os parâmetros de aquisição importantes utilizados para imagiologia cerebral no Modo Fotoacústica. (B) A aquisição de um espectro fotoacústica, com base num laser de excitação varia de 680 nm a 970 nm, com um intervalo de comprimento de onda de 5 nm (referida como etapa tamanho). (parâmetros c) Aquisição de empregados para a onda único modo Fotoacústica em 750 nm e 850 nm, para a discriminação de sinais de-oxigenados e hemoglobina oxigenada respectivamente.

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Figura 9:. Aquisição de imagem transversal do forame occipital (a) posicionamento do transdutor no pescoço do animal (seta amarela) e o plano de imagem resultante transversal que praticamente seções da cabeça na direção caudo-rostral; (b) vista posterior do posicionamento do transdutor e imagem plano de aquisição.

Figura 10:. Aquisição B-Mode de forame temporais para a individuação de referências anatômicas da epiderme (a), crânio (b) e parênquima (c) podem ser facilmente distinguidas, mas também outras referências anatômicas podem ser detectados, como a fissura ( d) que envolve a porção ventral cerebral profunda e a forma característica do trato óptico (e).

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Figura 11: aquisição Mode Power Doppler através do forame temporais para a individuação de referências vasculares MCA levantando do ICA no lado temporal do cérebro.. Para obter esse ponto de vista, imagem transversal foi adquirida pela apontando o transdutor sobre o forame temporais e girando-a no sentido anti-horário.

Figura 12: aquisição Mode Power Doppler através do forame temporais para a individuação de referências vasculares MCA levantando do ICA no lado temporal do cérebro.. Para obter esse ponto de vista, imagem transversal foi adquirida pela apontando o transdutor sobre o forame temporais e girando-a no sentido horário.

Figura 13: aquisição Modo de cor Doppler através do forame temporais para a individuação de referências vasculares MCA levantando do ICA no lado temporal do cérebro.. Informação direcional de corrente sanguínea é expressa por meio de uma barra de escala de cores, a distinção entre os movimentos de fluxo voltadas para o dispositivo transdutor e longe dele.

Figura 14: Modo de aquisição onda pulsada através do forame temporais para a individuação de referências vasculares confirmação das propriedades arteriais de sangue que circula no interior dos vasos que foram hipoteticamente identificados como: artérias. Modo de onda pulsada fornece informações sobre a variação das velocidades de transmissão, que pode ser correlacionado para efeito da pulsação cardíaca (mais inteNSE em artérias do que nas veias).

Figura 15: aquisição modo pulsado Onda através do forame temporais para a individuação de referências vasculares Identificação por modo de onda pulsada dos vasos sanguíneos como veias, onde o efeito de pulsação cardíaca em velocidades de transmissão é insignificante..

Figura 16: Modo de aquisição Fotoacústica através do forame temporais para a individuação de referências vasculares. Vasos internos do parênquima no lado temporal do cérebro visualizado por B-Mode (esquerda) e de ondas Single Mode Fotoacústica (à direita). As cores da barra de escala refletem diferentes valores de intensidade de sinal fotoacústico, induzidas por uma excitação laser realizado em um comprimento de onda selecionado. Em order para individualizar as veias e artérias, comprimentos de onda de excitação pode ser fixado em 750 e 850 nm, representando os valores para se obter os picos de emissão fotoacústico de hemoglobina desoxigenada e oxigenado, respectivamente.

Figura 17: Modo de aquisição Fotoacústica através do forame temporais para oxigenado e oxigenado-de discriminação hemoglobina. Vasos internos no lado temporal do cérebro visualizado por B-Mode (à esquerda) e Modo Fotoacústica Oxy-Hemo (à direita). As cores da barra de escala refletem diferentes valores percentuais de saturação de oxigênio da hemoglobina no sangue.

Figura 18: aquisição Modo Doppler a cores através do forame occipital para a individuação de referências vasculares.Segmentos vasculares curvas criando a estrutura porão do Círculo de Willis, localizado no lado ventral do cérebro.

Figura 19: Fotoacústica e B-Mode aquisição através do forame occipital para a individuação de referências vasculares. Nell'immagine em modo-B si possono evidenziare le strutture Anatomiche individuabili con la proiezione occipitale e nella corrispondente acquisizione con modalità fotoacustica con rilevamento spettrale tra 670 nm a 980 nm (con passo di 5 nm).

Figura 20: Fotoacústica e B-Mode aquisição através do forame occipital para a individuação de referências vasculares. Em questa imaginar viene rappresentato lo Spettro corrispondente alle tre ROIs tracciate um livello del parenchima cerebellare; em particolare sono tracciate um livello di tre strutture vascolari, la cui tipologia si differenzia um livello dell'andamento spettrale (ROIs fuxia e celeste corrispondono um strutture vascolari venose; ROI Gialla corrisponde ad una struttura vascolare arteriosa).

Discussão

O protocolo foi optimizado apresentados a fim de proporcionar um desempenho altamente eficaz de imagens do cérebro em animais de pequeno porte. As imagens podem ser adquiridas em diferentes modalidades, seguindo exatamente as indicações sobre os parâmetros de aquisição e o posicionamento do transdutor na foramina crânio. Em particular, o posicionamento no lado temporal é a mais crítica, uma vez que os EUA e o laser tem de ser centrados com tanta precisão quanto possível penetrar correctamente o forame, que é menor do que o occipital. No entanto, graças a essa configuração experimental, características hemodinâmicas relacionadas com concursos fisiológicos ou mesmo patológicos são acessíveis e podem ser avaliadas, mesmo em regiões profundas do cérebro, que geralmente são de difícil caracterização.

Desde a aquisição da imagem de sucesso depende da precisão do posicionamento do transdutor, esta dependência tem de ser cuidadosamente levado em conta, pois pode afetar o desempenho de imagem. Por exemplo,algumas estruturas anatômicas de interesse não pode ser completamente incluído no plano de imagem aquisição e sua identificação a partir de imagens que oferecem apenas uma visão parcial pode resultar abaixo do ideal. Além disso, uma aquisição de imagem e US AF realizada em uma modalidade tridimensional (3D Modo) não seria compatível com o ambiente experimental descrito anteriormente, uma vez que requer que o transdutor se mover ao longo de um caminho pré-definido de forma automatizada. Finalmente, devido à variabilidade natural da anatomia, a dimensão de aberturas crânio pode variar significativamente entre animais, tendo, portanto, consequências imprevisíveis sobre o processo de aquisição. Este facto faz com que a qualidade de imagem dependente das características de cada indivíduo. Consequentemente, a impossibilidade de aplicar esta estratégia para alguns animais tem que ser considerado na concepção do protocolo experimental.

Especificamente, um notável interesse é dirigido a hemodinâmica, devido ao seu papel fundamental na determinação dabiodistribuição de drogas ou outras moléculas exógenas após administração sistémica ^28-29. As implicações aplicativas no campo da Imagem Molecular são muitos, que vão desde a validação de agentes de contraste de imagem piscina de sangue para estudos de distribuição de drogas monitoradas-imagem que requerem induzida por ultra-som BBB abertura ^30. Todos esses fins de pesquisa certamente vai se beneficiar da capacidade de invasão mínima do protocolo, considerando-se que, sem qualquer tipo de cirurgia adicional, o risco de morte ou efeitos colaterais indesejados é substancialmente reduzido e monitoramento de longo prazo sobre os mesmos modelos animais é viável.

Em resumo, o protocolo apresentado permitirá ao praticante eficientemente imagem e para interpretar correctamente a topografia anatómica e do padrão vascular de tecidos normais ou patológicos cerebrais em-uso investigação modelos animais. Enquanto os métodos atuais são principalmente limitado a imagem tomográfica cortical ^25-27, esta definição dá a oportunidade to ilustram vários processos que influenciam a fisiologia cerebral profunda, através da fusão de vantagens concedidas tanto de imagem dos EUA e PA.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
High frequency ultrasound and photoacoustic imaging station (VEVO LAZR 2100 system)	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	FUJIFILM VisualSonics Inc.		http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf
Ultrasound Transmission Gel (Aquasonic 100)	Parker Laboratories Inc.	01-08	http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories		Three healthy 6-week old Sprague-Dawley rats were purchased from Charles River Laboratories and kept in standard housing (12 hr light-dark cycles) with a standard rodent chow and water available ad libitum. Provided by: http://www.criver.com/