Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Zusammenfassung

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Zusammenfassung

Die Gentherapie, verwendet werden, um die funktionelle Erholung von Innenohrschwerhörigkeit zu erreichen, verspricht besseres Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und genetischen Mechanismen, die zu Gehörverlust zur Folge gewähren. Einführung von Vektoren in das Innenohr sind in einer Weise, die weit verteilt das Agens durch die Cochlea und minimiert eine Schädigung der bestehenden Strukturen erfolgen. Diese Handschrift beschreibt eine postOhr chirurgischen Ansatz, der für Maus Cochlea-Therapie mit molekular, pharmakologischen und virale Lieferung an Mäusen postnatalen Tag 10 Jahren über die Rundfenstermembran (RWM) verwendet werden kann. Diese chirurgischen Ansatz ermöglicht die schnelle und direkte Lieferung in die Scala tympani und minimiert den Blutverlust und die Vermeidung von Tiersterblichkeit. Diese Technik beinhaltet vernachlässigbare oder keine Schäden an wesentlichen Strukturen des inneren und des Mittelohres und Nackenmuskulatur, während hundert Erhaltung Anhörung. Um die Wirksamkeit dieser chirurgischen Technik wird der vesikulären glutam demonstrierenaß transporter 3 Knockout (VGLUT3 KO) Mäusen wird als ein Beispiel von einem Mausmodell für angeborene Taubheit, die Erholungsfähigkeit nach Abgabe VGLUT3 zum inneren Ohres unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV-1) verwendet werden.

Einleitung

Die Gentherapie ist seit langem als mögliche Behandlung für genetische Schwerhörigkeit vorgeschlagen worden, aber der Erfolg in diesem Bereich schwer zu ¹ blieb. Bisher wurden viral vermittelten Methoden aufgrund der theoretischen Möglichkeit, bestimmte Zelltypen innerhalb des relativ unzugänglich Cochlea gezielt überwogen. Beide Adenovirus (AV) und Adeno-assoziierten Virus (AAV) wurden für Cochlea-Genübertragung verwendet. AAVs sind vorteilhaft in der Cochlea für eine Reihe von Gründen. Sie sind replikationsdefizienten Viren und effizient transgenen Moleküle zu übertragen, um verschiedene Zelltypen, einschließlich Neuronen, ein wichtiges Ziel für eine Reihe von Ursachen für Hörverlust. AAV Eintritt in die Zelle durch spezifische Rezeptoren vermittelt ^2; Somit muss die Wahl eines bestimmten Serotyps kompatibel sein mit den Zelltypen zu transduzieren. AAVs effektiv transfizieren Haarzellen ³ und enthalten in das Wirtsgenom, was zu einer stabilen, langfristige Expression des transgenic Protein und phänotypische Veränderungen in der Zelle ^4. Obwohl nicht unbedingt für kurzfristige Anwendungen wie Haarzellenregeneration vorteilhaft, eine langfristige Expression für stabile Rettung von genetischen Defekten sehr wichtig. Da AAVs sind nicht mit einem menschlichen Krankheit oder Infektion assoziiert und zeigen keine Ototoxizität ^5,6,7, sind sie ein idealer Kandidat für den Einsatz in der Gentherapie für vererbte Formen von Hörverlust ^8.

Transfer von exogenem genetischen Material in den Säugetierinnenohr mittels viraler Vektoren ist im letzten Jahrzehnt untersucht und ist als vielversprechende Methode zur Behandlung von sowohl genetische und erworbene Formen von Hörverlust ⁹ entstehen. Die Cochlea ist potentiell ein ideales Ziel für die Gentherapie aus mehreren Gründen: 1) seines kleinen Volumens eine begrenzte Menge des Virus notwendig erfordert; 2) ihre relative Isolierung von anderen Organsystemen Grenzen Nebenwirkungen; und 3) ihre fluidgefüllten Kammern erleichtern viralenLieferung in ganz Labyrinth ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Mausmodelle für angeborene Taubheit ermöglichen den Einsatz von vielen Methoden der Untersuchung der Entwicklung des Innenohrs in einem systematischen, replizierbar Weise überwachen. Während die geringe Größe der Maus cochleae nicht präsentieren einige chirurgische Schwierigkeit dient die Maus als ein äußerst wichtiges Modell in der Studie der genetischen Hörverlust, mit mehreren experimentellen Vorteile gegenüber anderen Arten ^16. Mausmodelle ermöglichen Einschätzung einer Reihe von Eigenschaften durch genetische Kopplungsanalyse, Sammlung von detaillierten morphologischen Beobachtungen und Simulation pathogenen Szenarien; als solche sind sie gute Kandidaten für die viral vermittelten Gentherapie. Umfangreiche genetische Studien an Mäusen in Kombination mit technologischen Fortschritte haben es möglich gemacht, gentechnisch veränderten Mäusen reproduzierbar über Labors ^{17,18, 19, 20,21} erzeugt. Furthermore, gibt es zahlreiche Modelle für sowohl erworbene und vererbte Schwerhörigkeit Phänotypen bei Mäusen, so dass strenge Tests in diesem Tiermodell ^{22, 23,24.} So korrigieren Anhörung mit viral vermittelten Gentherapie in einem Mausmodell ist eine geeignete erste Schritt bei der Suche nach einem Heilmittel für Erkrankungen des Menschen.

Wir haben bereits gezeigt, dass transgene Mäuse, denen vesikulären Glutamattransporter 3 (VGLUT3) werden taub geboren wegen des Mangels an Glutamatfreisetzung an der IHC Bandsynapse ^25. Da diese Mutation nicht auf eine Primär Degeneration der Haarsinneszellen führen, sind diese mutierten Mäusen möglicherweise ein ausgezeichnetes Modell, in der Cochlea Gentherapie für angeborene Hörverlust testen.

Bisher wurde eine Reihe von viralen Abgabetechniken für Cochlea Gentherapie beschrieben wurden, einschließlich runden Fenstermembran Diffusion runde Fenstermembran Injektion und Abgabe über einen Cochleostomie. Es gibt starkeial Vor- und Nachteile von jedem dieser Ansätze ^9.

Hier berichten wir über eine chirurgische Methode für viral vermittelte Genübertragung auf die VGLUT3 KO Maus Innenohr durch die Rundfenstermembran (RWM). Die Post-Ohr RWM-Einspritzverfahren ist minimal-invasiv mit ausgezeichneten Anhörung Erhaltung und ist relativ schnell. Wie wir bereits veröffentlicht, in dem Bemühen, wiederhergestellt in diesem Mausmodell Gehör ein AAV1 Vektor, der das Gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) in die Cochlea dieser taub Mäusen am postnatalen Tag 12 eingeführt (P! @), Was die Wiederherstellung des Gehör ^26. Anhörung im VGLUT3 KO-Mäusen wurde von akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) überprüft, während transgene Protein-Expression wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) überprüft. Diese Methodik somit zeigt, dass viral-vermittelte Gentherapie kann einen genetischen Defekt, die ansonsten Ergebnisse würden in Taubheit zu korrigieren.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren und Behandlung der Tiere mit NIH Ethikrichtlinien und genehmigte Protokoll Anforderungen der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of California, San Francisco eingehalten werden.

1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie

1. Führen Sie chirurgische Eingriffe an einem sauberen, gewidmet Raum. Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten, sterilisieren mit einer Glasperlen Sterilisator vor der Operation.
   HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden postnatalen Tag 10 bis 12 (P10-12) FVB Mäusen. Unterschiedlichen Alters und Mäusestämme können verwendet werden, um die Bedürfnisse einer bestimmten Projekt zu erfüllen. Mäuse älter als P40 kann eine Herausforderung sein, weil die Bulla Knochen wird härter.
2. Anesthetize die Mäuse intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin-Hydrochlorid (100 mg / kg), Xylazinhydrochlorid (10 mg / kg) und Acepromazin (2 mg / kg). Beginnen chirurgische Vorbereitung erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. Wo notwendigy, zu verwalten eine Auffrischimpfung (ein Fünftel der ursprünglichen Dosis) des Anästhetikums Cocktail, um das ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, bei diesem Schritt, weil die meisten der in diesem Alter beobachtet Sterblichkeit durch Narkoseüberdosierung verursacht.
3. Bedeckung Augen des Tieres mit einer Schutzaugensalbe, die Augen während der Anästhesie feucht zu halten, unterdrückt Lidschlusseflexes des Tieres.
4. Bewegen Sie die Maus mit Hals auf einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens verlängert, bis die Maus ganz wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern.
5. Rasieren Sie die links nach Ohrregion mit einer Schneidemaschine und Desinfektion mit 70% Ethanol und PVP-Jod vor der chirurgischen Manipulation.

2. Chirurgisches Verfahren und Vector Injection

1. Verwenden Sie einen Post-Ohrenansatz, um die Bulla tympanica aussetzen. Inzision das subkutane Gewebe mit einer kleinen Schere, um die Post-Ohrmuskel aussetzen. Nach dem Zurückziehen des Fettgewebes zu the posterioren Seite des Einschnitts, trennen die Muskeln, um die rechte und linke Seite senkrecht zum Einschnitt, um die zeitliche Knochen freizulegen. Stellen Sie sicher, dass dieser Schnitt ist lang genug, um bequem mit ausreichender Visualisierung zu arbeiten.
2. Perforieren die Bulla tympanica mit einer 25 G-Nadel und erweitern Sie das Loch bei Bedarf mit einer Zange durch Abziehen der Knochen zurück, um Zugang zum basalen Windung der Cochlea zu ermöglichen, und dann erweitern ausreichend, um das Steigbügel Arterie und die Rundfenstermembran zu visualisieren (RWM) .
3. Punktion der RWM sanft in der Mitte mit einem Borosilikat Kapillarpipette. Beachten Flüssigkeit Ausfluss durch die RWM an dieser Stelle; das ist normal. Warten Sie, bis die Auslauf stabilisiert hat (die effluxed Flüssigkeit aus der Cochlea ist mit einem sterilen Filterpapier getrocknet).
   HINWEIS: Achten Sie beim Halten und Vorschieben der Glasnadel, so dass der RWM Perforation ist so klein wie möglich. Abhängig von dem Mikroskop verwendet wird, halten die Pipetten mit Hilfe eines Mikromanipulators oder von Hand mit einer PipetteHalter.
4. Bereiten Sie die Pipetten für die Injektion mit einer Pipette Abzieher die gleiche Weise Patch-Clamp-Pipetten werden vorbereitet. Sicherzustellen, dass der Kopfkreisdurchmesser groß ist (etwa 15 & mgr; m im Durchmesser), so dass Pipettieren des Virus in die und aus leicht gemacht.
5. Erstellen Sie 1-2 ul AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP oder AAV2-GFP in eine Injektionspipette. Nachdem der Ausfluß stabilisiert (5 bis 10 min), microinject diese feste Volumen in die Scala tympani durch das gleiche Loch zuvor in RWM hergestellt.
6. Verschließen Sie den RW Nische schnell nach dem Herausziehen der Pipette mit einem kleinen Stecker des Muskel- und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber auf den Muskel platziert, um ein Auslaufen aus dem runden Fenster zu vermeiden.
   HINWEIS: Verschließen Sie das Loch sehr gut, nachdem die Nadel mit einem kleinen Stecker des Muskel entfernt, um jede Leckage aus Perilymphe der Cochlea-diesem Schritt verhindern, ist entscheidend für die Anhörung zu bewahren. Nicht versiegeln komplett die RWM in Hörverlust im Laufe der Zeit führen.
7. Nach der Injektion decken dieLoch im Gehör Bulla mit Fettgewebe, geben die Post-Ohrmuskulatur und Fettgewebe in ihre normale Position und Naht der Wunde in Schichten mit einer 6-0 oder kleiner Chrom resorbierbaren Nahtmaterial.
8. Desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod.

3. Postoperative Behandlung

1. Zeigen Mäuse in einem warmen Käfig und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig erholt, dann verschieben Sie sie zurück mit der Mutter. Es wird empfohlen, die männliche aus dem Käfig, bevor die Welpen wieder mit der Mutter entfernen.
2. Verwalten subkutane Carprofen (2 mg / kg) zur Analgesie postoperativ und jeder 24 Stunden danach für 3 Tage, um Entzündung und Schmerz zu verwalten. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Not, abnorme Gewichtsverlust, Schmerzen oder Infektionen. Allgemein mit der ^3. Tag nach der Operation alle Mäuse normalerweise handeln. Falls irgendwelche Anzeichen von Leiden oder Krankheiten werden in einer Maus nach dem ^3. Tag, sollten euthanizing ter Maus nach den Richtlinien des Instituts.

4. Bewertung der Cochlear Funktion Folgende Viral Lieferung Mit Hirnstammaudiometrie (ABR) Aufnahmen

HINWEIS: Die akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) ist ein akustisch evozierte Potenzial aus der laufenden elektrischen Aktivität im Gehirn extrahiert und über Elektroden unter der Kopfhaut platziert aufgezeichnet. Das Tier wird mit Ton stimuliert. Die resultierende Aufzeichnung besteht aus fünf Wellen, die die elektrische Aktivität des aufeinanderfolgenden Punkten in der Hörbahn in den ersten 10 ms nach Beginn eines auditorischen Reizes zu reflektieren.

1. Anesthetize Mäusen durch intraperitoneale Injektion eines Gemisches von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin.
2. Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen in der gesamten Hörtest bis die Maus ist völlig wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern.
   HINWEIS:die folgenden Klangreize in diesem Experiment: klicken (5 ms Dauer; 31 Hz Präsentation Rate).
3. Zeigen subdermale Nadelelektroden an der Spitze, unter der Ohrmuschel des linken Ohrs (Referenz), und unter dem Gegenohr (Masse) und starten Sie die Aufnahme ABRs wie zuvor in einer schalldichten Kammer ^27,28 beschrieben. Nehmen ABR-Wellenformen in 5 Intervallen unten von maximalen Amplitude dB Schalldruckpegel.
4. Bestimmen ABR Schwellen postoperativ bereits 4 Tage nach der viralen Lieferung
   HINWEIS: Threshold wird als die niedrigste Reizniveau, bei dem die Antwortpeaks für Wellen definiert I-V waren eindeutig und wiederholt auf Sichtkontrolle vor.
5. Messen Welle I, um die Aktivität des Cochlea-Nervs analysieren. Die niedrigste Anregungspegel, der ein nachweisbares ABR-Wellenform liefert als Schwellwert definiert.

5. Cochlear Transgene Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz

1. Anesthetize Mäuse durch eine Überdosis intraperitoneal Injektion einer Mischung von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin.
2. Enthaupten den Kopf erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise.
3. Präparieren Sie die cochleae heraus und Verfahren für ganze-mount Immunfluoreszenz wie beschrieben ^26. Ein detailliertes Protokoll Cochlea ganze Montage Immunfluoreszenz unter Verwendung von Anti-VGLUT3 und Anti-Myosin Antikörper 7a in Akil et al., 2013 ²⁹ beschrieben.
4. Für GFP-Markierungen, brüten die Cochlea Ganz Halterungen über Nacht bei 4 ° C mit einem Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper bei 1: 250-Verdünnung.
5. Zweimal Spülen der Cochlea für 10 min mit PBS gewaschen und dann für 2 Stunden inkubieren in Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert Cy2, verdünnt 1: 4.000 in PBS.
6. Zweimal spülen cochleae mit PBS für 10 Minuten inkubieren sie mit DAPI für 15 min.
7. Montieren Sie den cochleae auf Glasobjektträgern und beobachten under ein Mikroskop mit konfokaler Immunfluoreszenz.

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Ergebnisse

Um die technischen Merkmale und die Nützlichkeit der Post-Ohrenansatz für Cochlea molekularen Therapie zu verifizieren, wurden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP und AAV2-GFP in P10-12 Mäuse Innenohr über die RWM geliefert. Dieser Ansatz zeigt erfolgreiche Expression des Transgens im inneren Haarzellen (IHC) (VGLUT3 Abbildung 1 und Abbildung 2 GFP und GFP 3A), äußeren Haarzellen (OHC) (GFP Abbildung 2) und Stützzellen (GFP Abbildung 2 und

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Diskussion

In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Technik, die für Cochlea-Gentherapie eingesetzt werden können, mit dem Ziel der Wiederherstellung oder der Rettung normaler Gehörfunktion, die durch einen genetischen Defekt beeinträchtigt ist. Da es in der Regel atraumatisch ist, ist dieser Ansatz sicher für Cochlea-Gentransfer oder andere potenzielle molekulare Therapien ^30. Andere Ansätze für Cochlea-Therapie beschrieben worden, einschließlich eines Bauchansatz ^24, Cochleostomie ^31,32<...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies