Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all'orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Riepilogo

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

La terapia genica, utilizzato per realizzare il recupero funzionale di sordità neurosensoriale, promette di concedere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e genetici alla base che contribuiscono alla perdita dell'udito. Introduzione di vettori nell'orecchio interno deve essere fatto in modo che l'agente ampiamente distribuisce tutta la coclea minimizzando lesioni alle strutture esistenti. Questo manoscritto descrive un approccio chirurgico post-auricolare che può essere utilizzato per il mouse terapia cocleare usando molecolari, farmacologico, e consegna virale per topi giorno postnatale 10 e anziani attraverso la membrana finestra rotonda (RWM). Questo approccio chirurgico consente la consegna rapida e diretta nella scala timpanica, riducendo al minimo la perdita di sangue ed evitare la mortalità degli animali. Questa tecnica comporta trascurabile o nessun danno alle strutture essenziali dell'orecchio interno e medio nonché muscoli del collo mentre tutto conservando udito. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica chirurgica, la glutam vescicolaremangiato transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) topi verrà utilizzato come esempio di un modello murino di sordità congenita che recupera l'udito dopo la consegna del VGLUT3 all'orecchio interno tramite un virus adeno-associato (AAV-1).

Introduzione

La terapia genica è stato a lungo suggerito come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito genetica, ma il successo in questo settore è rimasta inafferrabile ^1. Ad oggi, le metodologie viralmente mediati hanno prevalso grazie alla capacità teorica di indirizzare specifici tipi cellulari all'interno della coclea relativamente inaccessibile. Entrambi adenovirus (AV) e il virus adeno-associato (AAV) sono stati utilizzati per la consegna del gene cocleare. AAV sono vantaggiosi nella coclea per una serie di motivi. Sono virus replica-carenti e possono efficacemente trasferire molecole transgenici a diversi tipi di cellule, tra cui i neuroni, un obiettivo importante per una serie di cause di perdita dell'udito. AAV ingresso nella cellula è mediata da recettori specifici ^2; pertanto, la scelta di un particolare sierotipo deve essere compatibile con i tipi cellulari da trasdotte. AAV può efficacemente trasfettare cellule ciliate ³ e incorporare nel genoma dell'ospite, conseguente, espressione stabile a lungo termine del TRAproteine ​​nsgenic e il cambiamento fenotipico nella cella ^4. Anche se non necessariamente vantaggioso per applicazioni a breve termine, come la rigenerazione delle cellule ciliate, espressione a lungo termine è molto importante per il salvataggio stabile di difetti genetici. Perché AAV non sono associati a qualsiasi malattia umana o infezione e non mostrano ototossicità ^5,6,7, sono un candidato ideale per l'uso in terapia genica per forme ereditarie di perdita dell'udito ^8.

Trasferimento di materiale genetico esogeno nell'orecchio interno dei mammiferi utilizzando vettori virali è stata studiata negli ultimi dieci anni e sta emergendo come una tecnica promettente per il trattamento di forme sia genetiche e acquisite di perdita dell'udito ^9. La coclea è potenzialmente un bersaglio ideale per la terapia genica per diverse ragioni: 1) la sua piccolo volume richiede una quantità limitata del virus necessaria; 2) il suo relativo isolamento da altri effetti limiti organi laterali; e 3) le sue camere piene di liquido facilitano viraleconsegna in tutto il labirinto ^{10, 11,12,13,14, 15.}

I modelli murini di sordità congenita consentono uso di molti metodi di studio per monitorare lo sviluppo dell'orecchio interno in un modo replicabile sistematica. Mentre le dimensioni ridotte del topo coclee non presenta difficoltà chirurgica, il mouse serve come modello estremamente importante nello studio della sordità genetica, con diversi vantaggi sperimentali su altre specie ^16. Modelli murini consentono la valutazione di una serie di caratteristiche, attraverso analisi di linkage genetico, raccolta di osservazioni dettagliate morfologiche, e la simulazione di scenari patogeni; come tali, sono buoni candidati per la terapia genica mediata viralmente. Ampi studi genetici nei topi combinate con i progressi tecnologici hanno permesso di generare topi geneticamente modificati in modo riproducibile attraverso laboratori ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermore, esistono numerosi modelli sia per acquisite ed ereditarie udito fenotipi di perdita nei topi, consentendo test rigorosi in questo modello animale ^{22, 23,24.} Così, correggendo l'udito con la terapia genica virale mediato in un modello di topo è un primo passo opportuno nella ricerca di una cura per le malattie umane.

Abbiamo precedentemente dimostrato che i topi transgenici privi di glutammato vescicolare Transporter 3 (VGLUT3) nascono sordi a causa della mancanza di rilascio di glutammato a nastro sinapsi IHC ^25. Poiché questa mutazione non porta ad una degenerazione primaria delle cellule ciliate sensorie, questi topi mutanti sono potenzialmente un ottimo modello in cui sperimentare la terapia genica per cocleare sordità congenita.

Fino ad oggi, una serie di tecniche di consegna virali per la terapia genica cocleare sono stati descritti, tra andata diffusione membrana finestra, rotondo iniezione membrana finestra e distribuirla su cocleostomia. Ci sono potentivantaggi ial e svantaggi di ciascuno di questi approcci ^9.

Qui riportiamo un metodo chirurgico per la consegna del gene virale mediata all'orecchio interno VGLUT3 KO mouse attraverso la membrana della finestra rotonda (RWM). Il metodo di iniezione RWM post-auricolare è minimamente invasiva con ottima conservazione dell'udito, ed è relativamente veloce. Come precedentemente pubblicato, nel tentativo di ripristinare dell'udito in questo modello di topo, un vettore che porta il gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) è stato introdotto nella coclea di questi topi sordi al giorno postnatale 12 (P! @), Con conseguente il restauro di sentire ^26. Audizione in topi VGLUT3 KO è stato verificato dai uditivo risposta tronco encefalico (ABR), mentre l'espressione della proteina transgene è stata verificata mediante immunofluorescenza (IF). Questa metodologia dimostra quindi che la terapia genica mediata viralmente può correggere un difetto genetico che altrimenti provoca sordità.

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Protocollo

NOTA: tutte le procedure e la gestione degli animali rispettate le linee guida etiche NIH e requisiti del protocollo approvati Care and Use Committee della University of California Animal Istituzionale, San Francisco.

1. Preparare la Animal di Chirurgia

1. Eseguire interventi chirurgici in un ambiente pulito, spazio dedicato. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, sterilizzare con una sterilizzatrice vetro tallone prima dell'intervento.
   NOTA: In questo protocollo, utilizzare giorno postnatale 10-12 (P10-12) topi FVB. Età diverse e ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico progetto. I topi di età superiore a P40 può essere impegnativo, perché l'osso bulla diventa più difficile.
2. Anestetizzare topi con iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg), xilazina cloridrato (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Inizia la preparazione chirurgica solo dopo che l'animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come pinch punta. Se necessary, somministrare una dose di richiamo (un quinto della dose originale) del cocktail anestetico per ripristinare il piano anestetico originale.
   NOTA: Fare attenzione a questo passaggio perché la maggior parte della mortalità osservata a questa età è causata da overdose di anestetico.
3. Coprire gli occhi dell'animale con una pomata oftalmica protettiva per mantenere gli occhi umidi durante l'anestesia, sopprimendo riflesso corneale dell'animale.
4. Posizionare il mouse con il collo esteso su una piastra elettrica per tutta la procedura fino a quando il mouse è completamente sveglio, per evitare post-anestesia ipotermia.
5. Radere la regione post-auricolare sinistro con un clipper e disinfettare con il 70% di etanolo e iodopovidone prima manipolazione chirurgica.

2. La procedura chirurgica e Vector Injection

1. Utilizzare un approccio post-auricolare per esporre la bolla timpanica. Incidere il tessuto sottocutaneo con piccole forbici per esporre il muscolo post-auricolare. Dopo ritrarre il tessuto adiposo in Oce lato posteriore dell'incisione, separare i muscoli a destra ea sinistra perpendicolare alla incisione per esporre l'osso temporale. Assicurarsi che questa incisione è abbastanza a lungo per lavorare comodamente con visualizzazione adeguata.
2. Perforare bolla timpanica con un ago 25 G ed espandere il foro come necessario con pinze staccando la spina dorsale per consentire l'accesso al giro basale della coclea, e quindi allargare sufficientemente visualizzare l'arteria stapediale e la membrana della finestra rotonda (RWM) .
3. Forare la RWM delicatamente al centro con una pipetta borosilicato capillare. Osservare efflusso fluido attraverso il RWM a questo punto; questo è normale. Attendere che l'efflusso è stabilizzata (il fluido effluxed dalla coclea viene asciugata con carta da filtro sterile).
   NOTA: Fare attenzione quando si tiene e avanza l'ago di vetro in modo che la perforazione RWM è il più piccolo possibile. A seconda del microscopio utilizzato, detengono le pipette con un micromanipolatore oa mano con una pipettatitolare.
4. Preparare le pipette per l'iniezione con una pipetta estrattore lo stesso senso pipette patch clamp sono preparati. Assicurarsi che il diametro della punta è di grandi dimensioni (circa 15 micron di diametro) in modo che il virus pipettando dentro e fuori è fatto facilmente.
5. Elaborare 1 a 2 ml di AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP in una pipetta di iniezione. Dopo l'efflusso è stabilizzato (da 5 a 10 min), microinject questo volume fisso nella scala timpanica attraverso lo stesso foro precedentemente realizzato in RWM.
6. Sigillare la nicchia RW subito dopo aver estratto la pipetta con un piccolo tampone di muscoli e fissarlo con una piccola goccia di tessuto adesivo posto sul muscolo per evitare perdite dalla finestra rotonda.
   NOTA: Seal questo buco molto bene dopo l'ago viene rimosso con un piccolo tappo di muscoli per evitare qualsiasi perdita perilymph dalla coclea-questo passaggio è fondamentale per preservare l'udito. La mancata sigillare completamente il RWM comporterà la perdita dell'udito nel corso del tempo.
7. Dopo l'iniezione, coprire ilbuco nella bolla uditiva con tessuto adiposo, restituire i muscoli post-auricolari e tessuto adiposo alla loro posizione normale e suturare la ferita a strati con un assorbibile sutura cromico 6-0 o più piccolo.
8. Disinfettare la ferita con povidone-iodio.

3. postoperatoria Cura

1. Mettere i topi in una gabbia calda e non lasciarli incustoditi fino a quando non sono completamente recuperati poi spostarli nuovamente con la madre. Si consiglia di rimuovere il maschio dalla gabbia prima di mettere i cuccioli di nuovo con la madre.
2. Somministrare per via sottocutanea Carprofen (2 mg / kg) per l'analgesia dopo l'intervento e ogni 24 ore in seguito per 3 giorni, per gestire l'infiammazione e il dolore. Monitorare gli animali ogni giorno per i segni di disagio, perdita di peso anormale, dolore, o infezione. Generalmente dal 3 ^° giorno dopo l'intervento chirurgico tutti i topi vanno agiscono normalmente. Se i sintomi di disagio o di malattia appaiono in un mouse dopo il 3 ^° giorno, in considerazione eutanasia tegli mouse come da linee guida istituzionali.

4. Valutazione della funzione cocleare dopo la consegna Viral Utilizzando uditiva del tronco encefalico (ABR) Risposta Recordings

NOTA: La risposta del tronco encefalico uditivo (ABR) è un Potenziali evocati uditivi estratto da attività elettrica in corso nel cervello e registrato attraverso elettrodi posti sotto il cuoio capelluto. L'animale viene stimolato con il suono. La registrazione risultante consiste di cinque onde che riflettono l'attività elettrica dei punti successivi nel percorso uditivo nei primi 10 msec dopo l'insorgenza di uno stimolo uditivo.

1. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato come descritto nella sezione 1.2 del presente protocollo, salvo non acepromazina.
2. Posizionare il mouse su una piastra elettrica per tutto il test dell'udito fino a quando il mouse è completamente sveglio, per evitare post-anestesia ipotermia.
   NOTA: Usai seguenti stimoli sonori in questo esperimento: clicca (5 msec durata; 31 Hz tasso presentazione).
3. Inserire elettrodi sottocutanei aghi al vertice, sotto la pinna dell'orecchio sinistro (riferimento), e sotto l'orecchio controlaterale (massa) e iniziare ABRs registrazione come precedentemente descritto in una camera insonorizzata ^27,28. Record ABR forme d'onda a intervalli di 5 dB del livello di pressione sonora giù dal massimo di ampiezza.
4. Determinare le soglie ABR dopo l'intervento già a quattro giorni dopo la consegna virale
   NOTA: soglia è definita come il livello di stimolo minimo al quale risposta picchi di onde I-V erano chiaramente e ripetutamente presente un controllo visivo.
5. Misura onda Io per analizzare l'attività del nervo cocleare. Il livello di stimolo più basso che produce una forma d'onda rilevabile ABR è definito come soglia.

5. Cochlear Transgene Protein Expression Usando immunofluorescenza

1. Anestetizzare topi da un overdose di intrapiniezione eritoneal di una miscela di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato come descritto nella sezione 1.2 del presente protocollo, salvo non acepromazina.
2. Decapitare il capo solo dopo che l'animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come il pinch punta.
3. Sezionare il coclee fuori e di processo per tutto il montaggio immunofluorescenza come descritto ^26. Un protocollo dettagliato di cocleare tutto-mount immunofluorescenza utilizzando anti-VGLUT3 e anticorpi anti-miosina 7a è descritto in Akil et al., 2013 ^29.
4. Per l'etichettatura GFP, incubare le cocleari tutto-monti notte a 4 ° C con un coniglio anti-GFP anticorpi a 1: 250 di diluizione.
5. Risciacquare la coclee due volte per 10 min con PBS e poi incubare per 2 ore a IgG anti-coniglio di capra coniugata Cy2 diluito 1: 4000 in PBS.
6. Sciacquare la coclee con PBS due volte per 10 minuti e incubare con DAPI per 15 min.
7. Montare la coclee su vetrini e osservare under un microscopio con immunofluorescenza confocale.

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Risultati

Per verificare le caratteristiche tecniche e l'utilità di un approccio post-auricolare per la terapia molecolare cocleare, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP sono state consegnate in topi P10-12 all'orecchio interno tramite l'RWM. Questo approccio dimostra espressione del transgene successo all'interno delle cellule ciliate interne (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 e GFP GFP figura 3A), le cellule ciliate esterne (OHC) (GFP Figura 2) e ce...

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Discussione

In questo lavoro, si descrive in dettaglio una tecnica che può essere utilizzato per la terapia genica cocleare, con l'obiettivo di ripristino o salvataggio normale funzione uditiva che viene compromessa da un difetto genetico. Come è tipicamente atraumatica, questo approccio è sicuro per il trasferimento di geni cocleare o altri potenziali terapie molecolari ^30. Altri approcci per la terapia cocleare sono stati descritti, tra cui un approccio ventrale ^24, cocleostomia ^31,32 e sac...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies