Prüfung von Rapid Dopamine Dynamics mit Fast Scan Cyclovoltammetrie Während Intraorale Geschmacksträger in Verwaltung Awake Rats

Zusammenfassung

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

Zusammenfassung

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

Einleitung

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

Protokoll

Alle Experimente wurden nach den National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Yale University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen.

1) Präoperative Vorbereitungen

1. Lösung zum Einnehmen Vorbereitung
   1. Schaffen Lösungen von 10% Saccharose und 0,005% L-Menthol in entionisiertem Wasser (pH 7,4). Bewahren Sie diese Lösungen in geschlossenen Behältern bei Raumtemperatur, und Remake alle 2 Wochen, um den Abbau zu verhindern.
2. Elektrode Kalibrierlösungen
   1. Machen Tris-Puffer (pH 7,4) zu jeder Zeit vor der Kalibrierung. Die Lösung besteht aus 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCl ₂ und 2,00 mM Na ₂ SO _4.
   2. Erstellen Sie eine Stammlösung von 10 mM Dopamin (DA; Dopamin-Hydrochlorid) in 0,1 M Perchlorsäure. Die Perchlorsäure verhindert Oxidation von Dopamine. Bewahren Sie diese Stammlösung bei -20 ° C und verwenden Sie für bis zu 6 Monaten. Machen Sie mehrere Teilmengen der DA-Stammlösung für die Lagerung zu jedem Aliquot nur einmal verwenden.
   3. Vom 10 mM DA Lager verdünnte Lösungen in Tris-Puffer zu einer Konzentration von 1 & mgr; M, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM und 31,25 nM.
   4. Zur pH-Kalibrierung, die Lösungen TRIS-Puffer mit dem pH-Wert von 7,2, 7,3, 7,5 und 7,6. Dies liefert Lösungen, die pH-Verschiebungen, die während des in vivo-Experiment auftreten können, zu imitieren.
3. Elektrodenherstellung
   1. Durch Vakuumansaugung absaugen einen T-650 Kohlenstoffaser (7 & mgr; m Durchmesser) in ein Borosilikatglas Kapillare (Länge 10 mm, Außendurchmesser 0,6 mm, Innendurchmesser 0,4 mm).
   2. Zeigen Glaskapillare mit Kohlefaser gefüllt in eine vertikale Elektrode Abzieher. Für Anfangsparameter, stellen Sie die Heizung auf 55,0 und schalten Sie den Magneten. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich sein, wie sowohl Heizung und Magnet Einstellungen variieren from Labor zu Labor.
      Anmerkung: Die Elektrode sollte mindestens 5,5 cm lang sein (einschließlich Verjüngung), so dass es leicht in den Mikromanipulator passen und mindestens 6,9 mm unter Dura im Gehirn der Ratte eingesetzt werden. Wenn die Elektrode zu kurz ist, werden Aufnahmen von ventralen Abschnitt des Nucleus accumbens nicht erreichbar sein. Auf der anderen Seite ist die Gesamtelektrodenlänge sollte nicht 6,5 cm sonst überschreitet, wird es zu lang, um in den Mikromanipulator passen.
   3. Verwendung eines Lichtmikroskops, schneiden die freiliegende Kohlefaser so daß es 75-100 & mgr; m über das Ende des Glases erstreckt. Überprüfen Sie, dass die Elektrode eine sehr enge, kaum erkennbar, Dichtung zwischen der Glaselektrode und Kohlenstofffaser, die minimales Rauschen bei der anschließenden Aufnahme produzieren wird. Entsorgen Sie die Elektrode, ob es irgendwelche merkliche Sprünge im Glas, oder wenn die Dichtung locker ist, was auf eine schlechte Abdichtung ist. Weitere detaillierte Anweisungen siehe [12] und [13].
4. Montage der Elektrode in das Mikrofonromanipulator
   1. Besorgen Sie sich eine 3 in, 30G Draht, der entlang der Hälfte der Länge des Drahtes isoliert ist und eine kleine Bürste, um eine dünne Schicht aus Silber zu malen direkt auf den Draht. Unmittelbar nach dem Auftragen Silberfarbe, stecken Sie den Draht in die Öffnung an der Oberseite der Elektrode, um eine physikalische und elektrische Verbindung mit dem Kohlenstofffaser ist. Unter einem Mikroskop, dass der Silberdraht in Kontakt mit der Kohlenstofffaser.
   2. Sichern Sie den Silberdraht und die Elektrode an den Mikromanipulator mit Schrumpf.
   3. Legen Sie das vorbereitet Kohlefaserelektrode in gereinigtes Isopropylalkohol (IPA) für mindestens 10 Minuten, um die Elektrodenoberfläche zu reinigen und anschließende Empfindlichkeit zu Dopamin zu erhöhen. Nach dem Einweichen in IPA, spülen Sie die Kohlefaser mit Leitungswasser, um die IPA zu entfernen.
5. Referenzelektrodenherstellung
   1. Nehmen Sie eine 13 mm Silberdraht, die ein etwa 6 mm Ag / Ag Cl mesh (7 mm Silberdraht allein, 6 mm mesh, Durchmesser 0,4 mm),schneiden Sie den Silberanteil auf etwa die Hälfte ihrer ursprünglichen Länge und löten die silberne Teil des Drahtes auf eine Gold-Stift.
   2. Bewerben Epoxy über das Lot auf den Stift.
   3. Tauchen die Ag / Ag Cl Netzende in ein Copolymer von 5% Polytetrafluorethylen und Perfluor-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonsäure 5-fach, mit 30 min Lufttrocknung Perioden zwischen jedem Eintauchen.
   4. Lassen Sie den beschichtete Ag / Ag Cl Netz an der Luft trocknen O / N.
   5. Cure in Ofen bei 120 ° C für 1 Stunde.

2) Combined Intraoralchirurgie und intrakranielle Kanülierung Surgery (ca. 75 min)

1. Oral Katheterherstellungs
   1. Machen Sie das orale Katheter, und sterilisieren von Ethylenoxid-Sterilisation, mindestens 10 Tage vor der Operation.
   2. Schneiden PE 100 Schlauch in 6 cm lange Segmente.
   3. Mit einem Lötkolben, Schmelz ein Ende des PE-Schlauch und drücken Sie sofort gegen eine feste Oberfläche, um die PE-Schlauch abkühlen. Das Ergebnis sollte zu erstelleneine kleine, flache Scheibe an einem Ende des PE-Schlauch und sollte nicht angeflanscht werden. Verwenden Sie eine Nadel (18 G) oder Push Pin, um ein Loch in der Mitte dieser Disc zu erstellen.
   4. Am anderen Ende des PE-Schlauch, eng einfügen das stumpfe Ende einer 18 G-Nadel in den Schlauch.
   5. Mit einem Standard-Papierloch Puncher, Punsch mehrere kreisförmige Stücke von einem Polytetrafluorethylen Folie (3,18 mm dick, 6 mm im Durchmesser), um Polytetrafluorethylen Unterlegscheiben erstellen.
   6. Erstellen Sie ein Loch in der Mitte der Scheibe. Nehmen Sie die Nadel auf die PE-Schlauch angebracht und schieben Sie es vollständig durch die Scheibe. Sobald die Nadel durch Schieben der Scheibe an der Unterseite der PE-Rohrleitung, so daß sie bündig gegen die Scheibe ist.
2. Oralchirurgie
   1. Nach Sterilisieren des chirurgischen Werkzeugen, Kanüle (2,5 mm unter der Sockel vor der Sterilisation getrimmt) und der Referenzelektrode, betäuben die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg).
      1. After 5 min, wenden Sie einen schädlichen Reiz Test (Fuß oder Schwanz pinch), um das Niveau der Narkose zu bewerten. Wenn sich das Motiv zeigt jede körperliche Reaktion auf die schädlichen Reiz Test (zusammenzucken Antwort, Erhöhung der Atem- oder Herzfrequenz), verwalten ein Ketamin Schub von 10% bis 15% der ursprünglichen Dosis und wiederholen Sie die obige schädlichen Reiz Protokoll.
   2. Nachdem die Ratten vollständig betäubt und zeigt keine Reaktion auf die schädlichen Reiz Test, verwenden Tierhaarschneidemaschinen, um fur die Ratte von den Augen bis etwa 2 mm hinter den Ohren zu rasieren. Dann legen Sie die Ratte auf einem dünnen Wasserumlauf Heizkissen auf Körpertemperatur während der Operation zu erhalten. Bewerben Auge Schmiermittel. Verwaltung des nicht-steroidale entzündungshemmende (NSAID) Arzneimittels, Carprofen (5 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion der vor den Schnitten und vor dem Einbringen intraoraler Kanülen. Verwenden Sie aseptische Technik zu allen Zeiten.
   3. Bewerben betadine gefolgt von 70% Ethanol, um die Haut zu reinigen. 3 Mal wiederholen.
   4. PlaCE Das Ratte auf den Rücken, und öffnen Sie den Mund mit einem sterilen Wattestäbchen. Hier finden Sie die ersten oberen Molaren.
   5. Führen Sie die Nadel in das Gewebe zwischen der Wange und der ersten oberen Molaren, bis die Nadel austritt direkt hinter und medial in den Ohren.
   6. Pierce die Nadel durch die Haut, bis die PE-Schlauch verlässt die Haut und ist zugänglich.
   7. Ziehen Sie die Kanüle (Ergreifen durch die Kanüle selbst und nicht der Nadel), und sichern Sie das Polytetrafluorethylen Scheibe in die Backenzähne so dass der Katheter an Ort und Stelle bleibt.
      Hinweis: Schnitt der Scheibe in eine Trapezform und sichern sie gegen die Backenzähne mit der flachen Seite der Wangenseite macht diesen Schritt erleichtern.
   8. Nehmen wir ein anderes Polytetrafluorethylen Scheibe und schieben Sie sie über die freiliegende Nadel, auf der Kunststoffschlauch, und liegen an den Einschnitt.
   9. Um das Polytetrafluorethylen Scheibe zu sichern, verwenden sterilisiert Band um eine dreieckige "Flagge" zu schaffen, so dass die Scheibe nicht nach oben schieben. Sichern Sie den Wascher gegen die Haut der Ratte und dem sterilisierten Band.
   10. Schneiden Sie die freiliegenden Katheters zu erlauben 2-4 cm Schlauch an über dem Kopf der Ratte ausgesetzt werden.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 durch 2.2.10 für die andere Seite des Mundes.
3. Intrakranielle Chirurgie für die Voltammetrie
   1. Legen Sie die Ratte in der stereotaktischen Rahmen und reinigen Sie das Tier der Kopfhaut mit einem Zwei-Stufen-Peeling (eine betadine Peeling, gefolgt von einer 70% Ethanol-Peeling, führen Sie mit einem 3-Zyklus Wiederholung).
   2. Verwendung sterilisiert Spitz Pinzette und chirurgische Schere, eine 15 x 15 mm Abschnitt der Kopfhaut Gewebe wegzuschneiden.
   3. Die Oberfläche des Schädels mit sterilisierten Wattestäbchen Applikatoren reinigen sanft. Weitere Reinigung des Schädels, indem 2 bis 3 Tropfen 3% Wasserstoffperoxid.
   4. Verwenden Sie einen stereotaktischen Bohrer bis 3 kleinen (1 mm Durchmesser) Löcher in den Schädel für nachfolgende Einsetzen von Schrauben, 1 Loch für die Führungskanüle, 1 Loch für die Stimulationselektrode und 1 Bohrung für den Referenz Auserwählten machenritt.
   5. Für Aufnahmen im NAc Kern, positionieren Sie den Führungskanüle 1,2 mm vor und 1,4 mm lateral Bregma. Senken Sie die Kanüle Gerät, bis die Kunststoffbasis bündig mit dem Schädel.
   6. Legen Sie die sterilisiert Referenzelektrode in der Hemisphäre kontralateral zur Führungskanüle. Senken Sie die Referenz ca. 2 mm unterhalb der Dura.
   7. Positionieren Sie die Stimulationselektrode mit 5,2 mm posterior und 1,0 mm lateral zum Bregma und 8,0 mm abgesenkt unten dura, die ventralen Tegmentum (VTA) zielen.
   8. Verwenden Sie einen sterilisierten kleinen chirurgischen Schraubendreher Schrauben, um den Schädel zu sichern. Dann legen Sie die Referenzelektrode, Stimulationselektrode und Führungskanüle. Schließlich sichern Sie alle Komponenten mit cranioplastic Zement.
   9. Für die ersten 48 Stunden nach der post-operative Betreuung, zur Verwaltung der nicht-steroidalen Entzündungshemmer (NSAID) Carprofen durch subkutane Injektion (5 mg / kg). Lassen Sie mindestens 1 Woche für vollständige chirurgische Wiederherstellung vor der Durchführung voltamMetrie Aufnahme.
      1. Während der postoperativen Versorgung, Strom oral Katheter täglich mit Wasser. Liefern Nahrung in Wasser für 2 Tage gesättigt, um das Tier in das Kauen und Essen zu helfen. Bieten tägliche Überwachung für potenzielle Anzeichen von Stress Schmerzen (aufgrund der milden Infektion oder Dehydratation) und geeignete Interventionen wie nötig (einschließlich Verabreichung von Flüssigkeiten, die topische Anwendung von Antiseptika und oder NSAID Carprofen Verwaltung auf 5 mg / kg).

3) Voltammetric Recordings in Awake mit frei drehender Rat

1. Das Absenken der Elektrode und den Erwerb einer DA Trainingssatz.
   1. Am Tag des Experiments, überprüfen Sie die Durchgängigkeit der Mundkanüle durch Infusion von 200 ul Wasser und beobachten orofacial Antworten (um sicherzustellen, dass die Ratte Verkostung der Wasser).
   2. Befestigen Sie die FSCV heads an die Ratte durch Einsetzen des Stimulationselektrode (auf der heads) in die bipolare Stimulationselektrode Cannula (in der Ratte). Somit ist die heads (miniaturisierte Strom-zu-Spannungs-Wandler) wird direkt an die bipolare Stimulationselektrode.
   3. Entfernen Sie die Dummy-Kanüle von der Kanülenvorrichtung und gelten zwei Tropfen 50% Heparin-Lösung in die Kanüle. Dann schieben Sie eine Dummy-Kanüle (etwas länger, dass die Dummy-Kanüle, die zuvor entfernt wurde) keine Blutgerinnsel oder Glia-Narben, die aufgetreten sind, die Kohlenstofffaser-Elektroden, die später während des Experiments eingesetzt werden brechen wird, um zu löschen. Verlängern Sie die Kanüle für das Clearing von Blutgerinnseln 3-4 mm unterhalb des Schädels (mindestens 2 mm über der Aufzeichnungs Website) verwendet wird.
   4. Setzen Sie den Mikromanipulator, mit Elektrode, in die Führungskanüle und legen Sie die Omega-Ring in einer Position "verriegelt".
   5. Die Bezugselektrode Draht von der heads an den entsprechenden Stift. Schließen Sie dann das Arbeitselektrodendraht aus dem Mikromanipulator an den entsprechenden Draht auf der heads.
   6. Senken Sie die electrode ca. 4-4,5 mm unterhalb Schädel.
   7. Verwenden Sie einen Potentiostaten, eine dreieckige Wellenform (400 V / s, -0,4 bis +1,3 V) Anwendung. Übernehmen Sie die Wellenform an die Elektrode bei 60 Hz für mindestens 10 min, dann ändern Sie die Wellenform-Anwendung Frequenz auf 10 Hz für die anschließende Versuchsaufnahmen.
      Hinweis: Die 60 Hz-Wellenform-Anwendung Schritt eine stabile Kohlefaser-Oberfläche und beugt elektrischen Drift
   8. Anwenden einer elektrischen Stimulation an den VTA mit verschiedenen Frequenzen (10-60 Hz) Impulsen (10 bis 30 Impulse) und Ströme (50 bis 150 & mgr; A), alle mit einer Impulsbreite von 2 ms / Phase, um verschiedene Konzentrationen von DA Freisetzung und pH hervorrufen Verschiebungen. Erfassen mindestens 5 verschiedenen Konzentrationen von DA Freisetzung und 5 verschiedenen pH-Verschiebungen. Warten (2 - 3 min Minimum) zwischen Stimulationen für vesikuläre Nachladen [14] ermöglichen.
      Hinweis: Es ist wichtig, Stimulationen, die DA-Konzentrationen über den gesamten Bereich, der bei der anschließenden erhoben werden produzieren zu erhaltenExperiment, da sie als Trainingssatz für Hauptkomponentenanalyse (siehe Abschnitt 5.1) verwendet werden.
   9. Senken Sie die Elektrode in den NAc Kern (6,3 mm ventral Dura). Anschließend senken die Elektrode in 100 & mgr; m-Schritten innerhalb des NAc Kern bis transiente DA Freigabeereignisse werden mit Frequenzen von mindestens 1 pro min beobachtet.
   10. Den Schlauch (Innendurchmesser 1/32 "Außendurchmesser 3/32") zu einer 20 ml Spritze mit einer Spritzenpumpe angebracht. Am anderen Ende des Rohres, mit einem abgeschrägten 23 G Nadel, um den Schlauch an der Ratte Kanüle zu verbinden. Sicherzustellen, dass der Schlauch vollständig mit dem gewünschten Geschmacksstoff gefüllt ist und zu überprüfen, dass keine Luftblasen in dem Schlauch vorhanden ist.
       Hinweis: In der Regel verwalten eine kleine Menge an Geschmacksstoff in den Mund der Ratte vor der Aufzeichnung, um sicherzustellen, dass die erste Infusion für die Aufnahme liefert die volle Infusionsmenge und kein Restwasser oder Luft in der Röhre. Darüber hinaus ermöglicht diese das Tier etwas vorherige Erfahrung haben with die Geschmacksträger seit neuartigen Geschmacksstoffe, auch appetitive diejenigen, können aversive zunächst aufgrund seiner Neuheit.
   11. Für die Datensammlung, ziehen 200 ul Geschmacksträger (6,5 sec mit Hilfe einer Pumpe und zuvor beschriebenen Schlauch). Infuse die Geschmacksträger alle 1-3 min. Infuse insgesamt 25-mal pro Geschmacksträger. Jede Infusion liefert 200 ul Lösung.
   12. Wenn mehrere Geschmacksstoffe werden in einem einzigen Experiment geliefert, spülen Sie die orale Katheter mit Wasser nach dem Sammeln von Daten für ein Geschmacksträger und warten Sie mindestens 20 Minuten vor der Infusion der neuen Geschmacksträger.
   13. Nach der DA Aufnahme-Session, die Vorbereitungen für die histologische Überprüfung durch die Schaffung einer kleinen Läsion an der Aufzeichnungsstelle. Um die Kohlenstofffaser-Elektrode für die nachfolgende Kalibrierung zu erhalten, zuerst die Elektrode zurückziehen und entfernen Sie den Mikromanipulator. Dann verwenden Sie eine neue Mikromanipulator mit einem Glas-Mikroelektrode und einem Wolframdraht (Verlängerung 100 um über die Glasspitze) auf die gleiche Tiefe (unten dura) wie das Original C-fiber Mikroelektrode.
   14. Zur histologischen Prüfung, erstellen Sie eine kleine Läsion durch die Anwendung 3 V an der Wolframdraht und die Erhöhung der Spannung bei 1 V-Schritten, alle 10 sec, bis die Einstellung 10 V erreicht ist.
   15. Wenn ein Standardkonzentrationskurve bereits mit mehreren Kohlefaserelektroden angelegt wurde, führen die Läsion obigen Schritt (3.1.14), die durch Anlegen des Potentials direkt die Carbonfaser-Elektrode ist.
       Hinweis: Diese Methode wird die Läsion Kohlefaser beschädigen und verhindern spätere Kalibrierung mit diesem speziellen Elektrode.
   16. Euthanize das Tier mit einer tödlichen Injektion Pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Verdrängen die Kopfhaube mit dem Kanülen mit einer Zange, indem Sie direkt nach oben auf der Kopfhaube. Nicht verdrehen headcap da dies unnötige Schädigung des Gehirns führen und machen es schwierig, die Position der Elektrode während der Histologie zu identifizieren.
       1. Entfernen Sie das Gehirn und in 4% Formalin für 3 Tage, gefolgt von 30% suCrose für 1 Woche. Erstellen Sie 30 um Scheiben mit einem Kryostaten, Mount auf Deckgläser und untersuchen Scheiben unter einem Lichtmikroskop, um die Position der Kohlenstofffaser oder Wolfram Läsion zu identifizieren.
          Hinweis: Die Perfusion ist optional für 3.1.17.

4) Elektrodenkalibrierung

1. Unter Verwendung der Durchflusszelle, um eine Stromkonzentration Umrechnungsfaktor zu erstellen.
   1. Um Elektrodenempfindlichkeit festzustellen, kalibrieren Elektroden nach jedem Versuch mit einem flow "t-cell" Gerät. Senken die Elektrode in die "T-Zelle", während Tris-Puffer, pH Lösungen oder DA-Lösungen werden über die Elektrodenoberfläche (mit einer Geschwindigkeit von 2 ml / min) gewaschen. Verwenden Sie ein Sechs-Position Luftmagnetantrieb zwischen Puffer und pH-Wert oder DA-Lösung hin und her schalten.
   2. Für jede Kalibrierungs sammeln voltammetrische Daten während 5 sec Anwendung Trispuffer (Baseline), gefolgt von 5 sec Anwendung pH oder DA-Lösung, gefolgt von 20 sec einpplication Tris-Puffer (30 sec gesamten Datei). Wiederholen Sie jeden Lauf 3-mal für jede Kalibrierungsstandardkonzentration, ein Gegengewicht zwischen verschiedenen Konzentrationen jeder Standard.
   3. Für jede Probe Sammlung, die Peak DA oder pH-evozierte Strom. Der Mittelwert der Spitzenstrom über jeden Versuch, eine Konzentration gegen die Spitzenstrom-Beziehung zu erhalten. Weitere detaillierte Anweisungen siehe [12] und [13].

5) Datenanalyse

1. Unter Verwendung einer Ausbildung in der Hauptkomponentenanalyse gesetzt (PCA)
   Anmerkung: Während einer Voltammetrie Experiment wird als Ausgangsstrom erzeugt wird, die das Ergebnis der Dopamin Oxidation und Reduktion, pH-Verschiebungen und elektrochemischen Rauschens ist. PCA ermöglicht die Trennung dieser Faktoren, so daß man die gewünschten Komponenten (DA und pH) zu isolieren und zu entfernen, zusätzliche Komponenten, die die gewünschten Signale verfälschen könnte (für eine ausführlichere Beschreibung siehe ^{15, 16).}
   1. Vergeben Sie einen Kalibrierungsfaktor zu the Ausgangsstrom (etwa 5-10 nA / uM) nach PCA zu ermöglichen Konzentrationswerte des Analyten zu bestimmen.
   2. Verwenden Sie den Trainingssatz erhalten während eines Experiments zu "trainieren" das PCA-Modell zu trennen DA, pH-Wert und anderen Faktoren. PCA nimmt der Trainingsmenge Cyclovoltammogramme (in Abschnitt 3.1.8 gesammelt) und legt fest, welche wesentlichen Merkmale des Voltammogramm kann verwendet werden, um jeden Analyten während in vivo-Voltammetrie Aufnahmen gesammelt zu identifizieren.
   3. Um die Anzahl der Hauptkomponenten zu halten zu bestimmen, verwenden Sie ein Malinowski F-Test. In der Regel halten nur 2 oder 3 Hauptkomponenten, die normalerweise in den Daten erklären etwa 95-99% der Varianz. Zur weiteren Diskussion über die Umsetzung der Malinowski F-Test, siehe ^17.
      Hinweis: Wenn die Anzahl der Komponenten bestimmt werden, die PCA-Analyse effektiv wird die Mess Voltammogramme von DA zu projizieren und pH Ausbildung setzt auf die Hauptkomponenten, die gewählt worden wäre.Das Ergebnis ist ein Datensatz, der gefiltert worden ist, so daß nur DA (oder pH) Daten verbleiben und die Restdaten, die nicht gleicht DA oder pH entfernt wird (Siehe Repräsentative Ergebnisse für erwartete Ausgang). Für eine weitere detaillierte Erklärung und Schritt für Schritt Anleitung für die Verwendung von PCA für die voltammetrische Analyse siehe Materialien Blatt und ^{16, 17.}

Ergebnisse

FSCV kombiniert mit intraoralen Katheterimplantation wurde verwendet, um zu prüfen, wie Saccharose, eine appetitive Geschmacksträger moduliert phasic DA Freisetzung im NAc Kern. Vor der Geschmacksträger Infusion, elektrische Stimulation (150 & mgr; A, 60 Hz, 24 Impulse; durch den roten Balken gekennzeichnet) der VTA produziert robuste Anstieg der phasischen DA Freisetzung im NAc (Abbildung 1) Abbildung 1 zeigt eine Farb Grundstück mit Potenzial auf. die y-Achse, die Zeit auf der x-Achse, und Str...

Diskussion

Intraorale Geschmacksträger Lieferung kombiniert mit FSCV ermöglicht die Analyse von "real-time" DA antwortet mündlich Geschmacksstoffe. Es gibt drei kritische Schritte in dem Protokoll, das für eine erfolgreiche DA Messungen erforderlich sind. Erstens ist die richtige Implantation der mündlichen Katheter kritisch für die Lieferung von Geschmacksstoffen. Sicherzustellen, dass der Katheter hinter der ersten molaren gesteckt und eingeklemmt verhindert den Katheter verlieren Durchgängigkeit und verhindert ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	(Stimulating electrode) when ordering, request a 22mm cut below pedastal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass Capillary	A-M systems	624503
Carbon Fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat Shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	(Wire for electrodes) L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop	n/a
Epoxy	ITW Devcon	14250	(Epoxy) "5 minute epoxy"
copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	"i.e. Nafion"
Silver Paint	GC Electronics	22-023
Power Supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	(Tubing for intra-oral catheters) PE 100, I.D.=0.86mm; O.D.=1.52mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	(Tubing for intra-oral infusion) I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air acuatator	VICI	A60	(Air actuator) 6 position digital valve interface
Digital Valve Interface	VICI	DVI	(Digital Valve Interface) 230 VAC
Quad Headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility	n/a
UEI Power Supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility	n/a
UEI Breakout Box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility	n/a
Power Supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant Syringe Pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten Microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver Wire Reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Sodium Chlroide	Sigma	S7653
Perchloric Acid	Sigma	244252
Hydrochloric Acid (4M)	Sigma	54435
Soidum Hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009
Dopamine Hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page