Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Zusammenfassung

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Einleitung

Studium der Drosophila melanogaster hat große Einblicke in die genetische Regulation einer Vielzahl von Phänomenen ist. Insbesondere gab es umfangreiche Forschung auf Ei-Entwicklung, da Oogenese eine tractable Weg zu vielen verschiedenen Entwicklungsprozessen, einschließlich Gewebe Strukturieren Zellpolaritätswechsel, Zellzyklus-Schalt und translationale Regulation ^1,2,3,4 untersuchen. Ein wichtiger morphogenic Ereignis während der Oogenese ist die Spezifikation, den Erwerb von Motilität und Migration aus einem Satz von Zellen, die sogenannten Randzellen (in ⁵ überprüft). Da Zellmigration ist ein Schlüsselmerkmal von tierischen Morphogenese und weil die genetische Regulation dieses Prozesses ist gut konserviert, sind wahrscheinlich auch in anderen Zusammenhängen wichtig Mechanismen in Fliegen bestimmt. So untersuchen wir die molekularen Kontrolle der Grenzzellmigration. Für unsere Untersuchungen haben wir eine neue Methode, um die vorderen Pole der sich entwickelnden Eier Beobachtung entwickelt,denen Grenz Zellen entstehen, zu untersuchen, wie sie im Detail zu entwickeln.

Innerhalb der Eierstöcke, Eikammern bei verschiedenen Entwicklungsstadien existieren entlang Ketten genannt Ovariolen, die in einer dünnen Hülle (1A) umhüllt sind. Jedes Ei Kammer wird weitergehen, um ein Ei zu bilden. Während der Oogenese, müssen mehrere unterschiedliche Zelltypen in einer koordinierten Art und Weise zu entwickeln. Die D. melanogaster Eikammer aus 16 Keimlinien-Zellen, einschließlich einer Eizelle von einem einlagigen Follikelepithels ⁶ umgeben. Eine kleine Anzahl von spezialisierten Zellen, die so genannte polare Zellen, entstehen an den vorderen und hinteren Pole des Epithels. Die 6-8 enden Zellen stammen im anterioren Epithel der Eierkammer, von den Polarzellen ^5,7 induziert. Mitte der Oogenese (Stufe 9), die Grenzzellen lösen sich von ihren Nachbarn und wandern zwischen den Nährzellen, die Eizelle an der hinteren der Eikammer ^5,7 zu erreichen. Diese Bewegung muss erreicht werden,während die Grenzzellen in einer Cluster-Umgebung zwei unbewegliche Polarzellen, so dass dies eine Art kollektive Zellmigration. Erfolgreiche Migration der Grenzzellverband sorgt für die richtige Entwicklung der Mikropyle der Eierschale, die für die Befruchtung notwendig ist.

Die vorderen polare Zellen anweisen Grenzzellschicksals durch die Aktivierung eines Signalübertragungskaskade. Polar Zellen eine Cytokin, ungepaarte (UPD), die zu einer Transmembranrezeptor, Domeless (DOME) bindet, auf benachbarte Follikelzellen in Stufe 8 von Oozytenentwicklung ^8,9. Die Bindung von UDP verursacht Janus Tyrosin-Kinase (JAK), um das Signal Transducer und Aktivator der Transkription (STAT) ^8,10,11 phosphorylieren. STAT bewegt sich dann in den Kern, um die Transkription zu aktivieren. Langsam Border Cells (SLBO) ist ein Transkriptionsfaktor, der eine direkte transkription Ziel von STAT ist und wird auch für die Grenzzellmigration ¹² erforderlich. Seitenansichten Eikammern zeigen that STAT-Aktivität wird in einem Gradienten über die vordere Epithel ^8,11,13 geregelt. Follikelzellen nächsten zu den polaren Zellen die höchste aktiviert STAT, damit sie sich Randzellen und dringen in den benachbarten Keimbahngewebes.

Um zu verstehen, wie die Grenzzellen innerhalb festgelegter und nehmen Sie aus dem Epithel, müssen wir beobachten, wie sich das Gewebe organisiert. Wenn wir sehen Eikammern von einer anterioren-on Sicht würden wir radiale Symmetrie der STAT-Aktivität in den Follikelzellen rund um die Polarzellen erwarten. Eine End-Ansicht würde auch genauer Unterschiede von Membranproteinen und Zell-Zell-Interfaces zeigen vor und während der Ablösung als Vergleich die Zellen in unterschiedlichen Brennebenen. Da Eikammern sind länglich und miteinander durch Stiel Zellen angebracht, auf Objektträger nieder sie seitlich, so dass es schwierig ist, den vorderen Architektur zu beobachten. So viele Informationen über die Zellen, an den Polen des Eies Kammerwurde von Seitenansichten abgeleitet. Obwohl einige Informationen durch algorithmische 3-D-Rekonstruktionen von optischen Schnitten, Lichtstreuung, Photobleaching und schlechtere Auflösungsgrenzen in der Z-Achse erhalten werden diese Angaben weniger detailliert und zuverlässig in der Abwesenheit von teuren Techniken wie superauflösende Mikroskopie ¹⁴ . Andere Arten von Abschnitt basierten Bildgebung (beispielsweise Elektronenmikroskopie oder Mikrotom Schnitte) erfordert umfangreiche Manipulation von Geweben, einschließlich Entwässerung, was die Wahrscheinlichkeit für Artefakte. So eine neue Methode zur Bild D. entwickelten wir melanogaster Eikammern während aufrecht. Diese Methode hat sich bereits bei der Aufklärung, wie bewegliche Zellen sind vom Schicksal bestimmt (siehe Repräsentative Ergebnisse und Manning et al, im Berichts) bewährt und dürfte im weiteren Sinne wertvoll in Studien anderer Aspekte der Oogenese sein.

Protokoll

1. Präparation Ovariolen

1. Übertragen Sie etwa fünfzehn 2-4 Tage alte weibliche Fliegen und ein paar Männer auf eine frische fliegen Essen Fläschchen mit Mehr Trockenhefe. Verwenden Baumwolle als Plugin für die Fläschchen, und fügen Sie ein paar Tropfen Wasser auf die Baumwolle, die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten.
2. Ort Vial in einem 25 ° C Inkubator für 14-16 h, um die Anzahl der Stufe 8-10 Eikammern maximieren.
   Hinweis: Die Inkubationszeit variiert je nach Temperatur und gewünschte Bühne.
3. Bereiten Dissektion Medien, 0,1 M KPO ₄ und NP40 Lösungen für den nächsten Tag erforderlich (siehe Materialien).
4. Anesthetize die Fliegen mit CO _2, und legen Sie unter einem Dissektionsmikroskop. Pipette einige Tropfen Dissektion Medien in jeden Hohlraum in der Glas Depression Rutsche.
5. Halten Zange in jeder Hand in einem ca. 30 ° Winkel zur Tischplatte und orientieren eine weibliche Fliege mit den Flügeln nach unten. Mit Ihrer nicht-dominanten Hand, nehmen Sie den weiblichen mit einer Pinzette, greifen sie an der einnterior des Bauches, in der Nähe des Brustkorbs, und tauchen sie in die Dissektion Medien in der Vertiefung Schieber (1A Einschub).
6. Mit der anderen Pinzette, fassen Sie das Exoskelett an der ventralen posterioren des Bauches und durch durchbohren. Besorgen Sie sich die Eierstöcke am hinteren Ende, und ziehen Sie sie aus dem Bauch und legen Sie die frische Medien auf der anderen Seite der Mulde Rutsche. (1A kleines Bild). Vermeiden Auseinanderziehen des Darms. Entsorgen Sie die Karkasse.
7. Wiederholen Sie mit den anderen weiblichen Fliegen bis alle Eierstöcke seziert werden. Entsorgen Sie die Männer.
8. Mit einer Pinzette, halten Sie ein Eierstock am hinteren Ende (in der Nähe der größten Ei Kammern), und mit der anderen Hand mit einem Pinzette zu einem der vordersten Ei Kammern (Germarium) einklemmen. (1A).
9. Langsam und stetig, ziehen eine Ovariole Kette aus dem Eierstock Scheide. Weiterhin individuell sezieren Ovariolen bis alle gewünschten Ei Kammern removed.
10. Wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,8 für alle seziert Eierstöcke.
11. Wenn Sie fertig sind, übertragen Ovariolen auf eine 0,6 ml Tube mit einem Kunststofftransferpipette.
12. Lassen Ovariolen setzen sich am Boden der Röhre, dann nach Fixierung und Färbung Schritten fortfahren.

2. Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Ovariolen

1. Dissektion Medium vorsichtig aus Ovariolen mit einer Pipette. Achten Sie darauf, keine Ovariolen oder Eikammern entfernen. Lassen Sie ca. 50 ul Ovariolen und Dissektion Medien.
2. In 50 ul von 16% Paraformaldehyd und 150 ul 0,1 M KPO ₄ Puffer in einem Rohr, und fügen Lösung Eikammern, sie zu beheben. Inkubation unter Schütteln für 10 min. ACHTUNG: Para ist giftig.
3. Entfernen Fixiermittel und spülen Sie zweimal mit 0,5 ml NP40 Waschpuffer.
4. Zweimal für 15 Minuten jeweils bei RT waschen.
5. Siehe Standard-ZF-Protokoll ¹⁵ für den nachfolgenden Schritten.
   1. Kurz nach der Fixierung, fügenPrimärantikörper an den geeigneten Verdünnungen inkubieren O / N bei 4 ° C. In NP40 mehrmals waschen, dann fügen Sekundärantikörper (1: 200 Verdünnungen).
   2. Mehrmals waschen in NP40, dann fügen Sie DAPI (1: 1000) für 10 Minuten, dann wiederholen Wäschen. Sobald IF-Protokoll abgeschlossen ist, fügen Sie 200 ul von 50% Glycerin in PBS zu Eikammern und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 2 Std.
   3. Entfernen Lösung, ersetzen Sie es mit 70% Glycerin in PBS und mit Folie abdecken. Zeigen Probe bei 4 ᵒC bis einbaufertig. Unterdessen mit Schritt 3 fortfahren.

3. Geleistete Vorbereitung von Glycerin Jelly Slides

1. Messen Sie mindestens 4 ml Gelee Glycerin mit einem Spatel und füllen ein Glas Zellkulturröhrchen in die Halbmarathonmarke. Schmelzen Glycerin Gelee in einem Wasserbad bei 55 ° C für 30 min.
2. Gießen Sie einen kleinen Tropfen Glycerin, etwa 300 & mgr; l aus der Stammlösung auf zwei Objektträgern. Mit einem Gewebe, verbreiten Glycerin in einer dünnen layer über jede der Folien. Dies liefert eine Basis und ermöglicht die einfache Entfernung von Glycerin Gelee in Schritt 5.6.
3. Schneiden Sie die Spitze aus einer gefilterten 1.000 ul Pipettenspitze. Verwenden Schnitt Pipettenspitze 1000-1500 ul warmen Glycerin Gelee langsam auf jedem Objektträger übertragen. Achten Sie darauf, um Blasen zu vermeiden.
4. Lassen Glycerin Gelee Folien sitzen für 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt.
5. Platzieren Sie jede Glycerin Gelee Folie in 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Bei 4 ° CO / N. Optional Speicher Glycerin Gelee Folien für bis zu 5 Tage bei 4 ° C.

4. Montage Egg Chambers

1. Mit Proben aus Schritt 2.5, Pipette mehr 3 ul Tropfen Eikammern in 70% Glycerin in einem Glycerin Gelee Rutsche. Weiter Pipettieren 3 ul Tropfen, bis alle Eier Kammern sind auf dieser Folie. Stellen Sie sicher, jeder Tropfen mindestens zehn Eikammern. Inzwischen Hitze ein Kulturröhrchen aus Glycerin Gelee in einem 55 ° C Wasserbad.
2. Stellen Sie das Glycerin Gelee Rutsche mit Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur ein Tropfen Eikammern ist in dem Sichtfeld (1B).
3. Mit einer 30-Gauge-Nadel, wie einem Löffel, nehmen Sie die gewünschte Stufe Eikammer. Wenn nötig, separate gewünschten Ei Kammern von einem Ovariole Kette mit Hilfe der Nadel wie ein Messer.
4. Um Verunreinigungen, die mit einer Abbildungs ​​stören können, zu vermeiden, übertragen das Ei Kammer zur zweiten Glycerin jelly Schieber mit dem vorderen zugewandt links (1E -1). Wiederholen, bis es mindestens sieben Eikammern reihen sich in einer Spalte (Abbildung 1C).
5. Bilden neue Spalten von sieben bis alle gewünschten Eikammern werden dem zweiten Glycerin jelly Träger übertragen.
6. Reißen Sie ein kleines Stück Gewebe und Twist. Verwenden Sie diese Option, um das überschüssige PBS-Glycerin von den Ei Kammern durch leichtes Berühren jeden einzelnen zu absorbieren. Achten Sie darauf, Eikammern nicht entfernen.
7. Schneiden Sie dieSpitze eines gefilterten 200 ul Pipettenspitze. Verwenden Sie diese Funktion, um 150 ul Glycerin Gelee, um alle Spalten der Eikammern decken zu übertragen.
   HINWEIS: Die Menge an Glycerin Gelee benötigt, um die Säulen zu decken auf Eikammer Stufen und die Anzahl der Säulen. Menge eingestellt werden kann.
8. Lassen montiert Eikammern sitzen für 5 min bei RT, bis die obere Schicht aus Glycerin Gelee vollständig verfestigt (1D).
9. Den Objektträger montiert Ei Kammern in einem 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Lagerung bei 4 ° CO / N, damit die Glycerin Gelee Schichten (in der dunklen Ort, wenn es Bedenken über Photobleaching) zusammen zu verfestigen.

5. Herstellung von Egg Chambers for Imaging

1. Zeigen Schieber montiert Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur eine Spalte Eikammern ist in dem Sichtfeld.
2. Mit einem Winkel von 45 ° Miniatur Skalpell, schneiden Sie ein straight Linie entlang der rechten Seite der ersten Spalte Eikammern (nahe der hinteren Seite der Eikammern). (1D-E)
3. Als nächstes wird über der ersten Eierkammer an der Oberseite und unter der letzten Eikammer in der Spalte geschnitten. An diesem Punkt der Spalte Eikammern sollte auf drei Seiten geschnitten werden.
4. Verwendung eines microknife, Scheibe entlang der linken Seite der Säule, so nahe wie möglich an der vorderen Seite der Eikammern (1E -3).
5. Je 100 ul kaltem 1X PBT über die Schnitt Spalte.
6. Verwenden Sie einen abgerundeten Kanten Spachtel, um das überschüssige Glycerin Gelee um drei Seiten des Schnittes Spalte Eikammern und entsorgen zu entfernen, während der Rest auf der Folie.
7. Stecken Sie den Spachtel in den Schnitt an der vorderen Seite des Eier Kammern und trennen Sie die Spalte aus der Primär Glycerin Gelee Block.
8. Bereiten Proben entweder invertiert (5.8.1) oder stehend (5.8.2) Mikroskopie.
   1. Für Inverses Mikroskop: Transfer ter Spalte Eikammern zu einem Deckglas mit vorderen Seite Eikammern nach unten. Die Schritte 5.2-5.8, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und gelagert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Eikammern, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Bild Eikammern direkt auf Deckglas.
   2. Für aufrechten Mikroskop: Übertragen Sie die Spalte von Ei Kammern auf einen Objektträger mit der vorderen Seite nach oben ein. Die Schritte 5,2-5,9, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und auf Objektträgern montiert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Ei Kammern und Deckblöcke mit einem # 1 ½ Deckglas.

Ergebnisse

Die aufrechte bildgebenden Verfahrens konnten wir direkt die Organisation von Zellen in der vorderen Follikelepithels auf Stufe 8 zu sehen Ein allgemeiner Marker für Follikel Zellschicksal, die Augen Absent (EYA) Protein, sowie die Kern-DNA-Marker DAPI, hat auch Ausdruck in diesem Bereich der Zellen, und zeigten, dass alle Zellen könnten mit ähnlichen Färbungsintensitäten (2B ') zu sehen ist. Proteine, die in Reaktion auf das Cytokin UPD reguliert zeigten jedoch erlichen Muster Expressionsnivea...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Methode zu montieren und Bild klein, entwickelt Eikammern von einer End-on-Perspektive. Gemeinsame Methoden zur Bildgebung Ei Kammern für Seitenansichten optimiert und vor allem ermöglichen eine präzise Visualisierung von mediolaterale Follikelzellen, wenn mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt. Die Verwendung von Z-Stapeln oder 3-D-Rekonstruktion Hilfsmittel in Anzeigen mehrerer Brennebenen, aber ist immer noch für subzelluläre Auflösung der Pole des elliptischen Eikammern (2...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)			Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle	VWR	BD305106	Regular bevel
Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	To fatten female flies
Bovine Serum Albumin	PAA-cell culture company	A15-701	Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10	Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich	D9542	5 mg/ml stock solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16140-071	Added to supplement dissection medium (10%)
Glass culture tube	VWR	47729-576	14 ml
Glass Depression Slides	VWR	470019-020	1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	Mounting media
Glycerol	IBI Scientific	IB15760	70% in PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer
Leica Fluorescent Stereoscope	Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope	Leica Microsystems		40x/0.55NA dry objective
Micro spatula	VWR	82027-518	Stainless steel
Microscope Slide	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer			50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Life Technologies	10378-016	Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile	VWR	82050-548	60 W x 15 H mm
Phosphate Buffer Saline	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786-500G	Used in 0.1 M KPO4 Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P9791-500G	Used in 0.1 M KPO4 Buffer
[header]
Schneider’s Insect Medium	Life Technologies	11720018	With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-25G	Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G	Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCl	IBI Scientific	IB70144	1 M TRIS-HCl, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software	PerkinElmer		For processing confocal Z-stacks