Вертикальный Визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Яйцо палат

Резюме

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Аннотация

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Введение

Исследование дрозофилы оказывает большое понимание генетического регулирования в широком диапазоне явлений. В частности, было обширное исследование развития яиц, потому что оогенез обеспечивает послушный путь, чтобы исследовать различные процессов развития, в том числе ткани рисунка, изменения клеточной полярности, переключение клеточного цикла и поступательного регулирования ^1,2,3,4. Одним из важных событий во морфогенетического оогенезе это спецификация, приобретение подвижности и миграции из набора клеток, называемых пограничные клетки (обзор в ^5). Поскольку миграции клеток является ключевым признаком животного морфогенеза, и из-за генетического регулирование этого процесса хорошо сохраняется, механизмы, определенные в мух могут быть важными в других контекстах. Таким образом, мы исследуем молекулярную контроль миграции границы ячейки. Для наших исследований мы разработали новый метод, чтобы наблюдать передней полюсов развития яиц,где возникают пограничные клетки, чтобы изучить, как они развиваются в деталях.

В яичнике, яичные камеры на различных стадиях развития существуют вдоль цепочек, называемых овариол, которые заключены в тонкий оболочки (рис 1А). Каждое яйцо камера будет перейти к форме одно яйцо. Во время оогенеза, несколько различных типов элементов должны развиваться в скоординированной манере. D. MELANOGASTER яйцо камера состоит из 16 зародышевой линии клеток, в том числе один ооцит, окруженный однослойной фолликулярного эпителия ^6. Небольшое количество специализированных клеток, называемых полярных клетки, возникают на передней и задней опор эпителия. Пограничные клетки 6-8 происходят в передней эпителия яйцевой камеры, вызванного полярных клеток ^5,7. В середине оогенеза (стадия 9), пограничные клетки отделяются от своих соседей и мигрируют между питающих клеток, чтобы достичь яйцеклетки на заднем яйцевой камеры ^5,7. Это движение должно быть выполненов то время как пограничные клетки остаются в кластере окружающей два неподвижных белых клеток, что делает этот тип коллективной миграции клеток. Успешное миграция границ клеток кластера обеспечивает правильное развитие микропиле яичной скорлупы, которая необходима для оплодотворения.

Передние полярные клетки указания судьбу границы клеток путем активации каскада трансдукции сигнала. Полярные клетки секретируют цитокин, непарных (UPD), который связывается с рецептором трансмембранной, Domeless (купол), на соседней ячейки стручка на стадии развития 8 ооцитов ^8,9. Связывание UPD вызывает Janus тирозин-киназы (ЯК) фосфорилировать сигнал датчика и активатора транскрипции (STAT) ^8,10,11. STAT затем переходит к ядру, чтобы активировать транскрипцию. Медленные Клетки границе (SLBO) является фактором транскрипции, который является прямым транскрипции цель STAT и также необходим для границы миграции клеток ^12. Боковые виды яиц камер указывают тшляпа STAT деятельность регулируется в градиенте через передний эпителий ^8,11,13. Фолликулярных клеток близкие к полярным клеток имеют самые высокие уровни активированного STAT, таким образом, они становятся пограничные клетки и вторгаются в соседнюю зародышевой линии ткани.

Чтобы понять, как пограничные клетки указан внутри и отделить от эпителия, мы должны наблюдать, как ткань организована. Если мы рассматриваем яичные камеры от передне-на перспективу, можно было бы ожидать радиальную симметрию STAT деятельности в фолликулярных клеток, окружающих полярные клетки. Конечный на виду также более точно показать различия мембранных белков и межклеточных интерфейсов до и во время отрыва, чем сравнение клеток в различных фокальных плоскостях. Поскольку яйцо камеры продолговатые и прикреплены друг к другу с помощью стебля клеток, они оседают на предметные стекла в поперечном направлении, что делает его трудно наблюдать переднюю архитектуру. Таким образом, много информации о клетках на полюсах яиц камеры имеетбыли выведены из боковых взглядов. Хотя некоторая информация может быть получена путем алгоритмических 3-D реконструкций оптических секций, комбинационного рассеяния света, Фотообесцвечивания и бедных рамки резолюции в Z-оси сделать эту информацию более подробно и надежны в отсутствии дорогих методов, как супер-разрешением микроскопии ¹⁴ , Другие виды секции на основе изображений (например, электронная микроскопия или микротом секционирования) требуют больших манипуляций тканей, в том числе обезвоживания, увеличивая вероятность для артефактов. Таким образом, мы разработали новый метод к фотографиям D. MELANOGASTER яичные камеры в то время как в вертикальном положении. Этот метод уже доказали свою полезность в объяснении, как подвижные клетки суждено (см репрезентативные результаты и штатное др рассматривается), и, вероятно, будет более широко ценным при исследовании других аспектов оогенеза.

протокол

1. Вскрытие овариол

1. Перевести около пятнадцати 2-4-дневных женского мух и несколько мужчин к новому лету пищевой флакон с добавлением активных сухих дрожжей. Используйте хлопок в качестве плагина для флаконов и добавить несколько капель воды к хлопку, чтобы сохранить высокую влажность.
2. Место флакона в 25 ° C инкубаторе в течение 14-16 ч, чтобы максимизировать количество стадия 8-10 яиц камер.
   Примечание: Время инкубации варьируется в зависимости от температуры и желаемой стадии.
3. Подготовка рассечение СМИ, 0,1 М КПО ₄ и NP40 решения по мере необходимости в течение следующего дня (см Материалы).
4. Обезболить мух с помощью CO _2, и поместите под микроскопом рассечение. Внесите несколько капель рассечение СМИ в каждой полости в стекле депрессии слайда.
5. Держите щипцы в каждой руке на примерно 30 ° углом к ​​поверхности стола и сориентироваться одна женщина летать с опущенными крыльями. С вашей не доминантной рукой, забрать самку с помощью щипцов, схватив ее в аnterior живота, недалеко от грудной клетки, и погрузите ее в рассечение СМИ в депрессию слайд (рис 1А вставке).
6. С другой парой щипцов, держитесь экзоскелет на вентральной задней части брюшной полости и пробить. Возьмите яичников у заднего конца, то вытащить их из брюшной полости и поместить в свежую среду с другой стороны впадины слайда. (1А вставка). Избегайте потянув за исключением кишечник. Откажитесь от туши.
7. Повторите с другими женщинами мух, пока все яичники не расчленены. Откажитесь от мужчин.
8. С одной парой щипцов, удерживая яичника на заднем конце (около крупнейших яичных камер), а также с другой стороны использовать пару щипцов, чтобы зажать один из самых передних яиц камер (гермарии). (1А).
9. Медленно и постепенно, тянуть ovariole цепь из яичника оболочки. Продолжайте рассекать из овариол индивидуально, пока все нужные яичные камеры не гemoved.
10. Повторите шаги 1.7-1.8 для всех расчлененный яичников.
11. После завершения передачи овариол в 0,6 мл трубки с помощью пластиковой пипетки передачи.
12. Пусть овариол оседают на дно трубки, а затем приступить к фиксации и окрашивания шагов.

2. Иммунофлуоресцентного (IF) Окрашивание овариол

1. Осторожно снимите рассечение СМИ от овариол с помощью пипетки. Будьте уверены, что не удалите все овариол яйцо или камеры. Оставьте примерно 50 мкл овариол и рассечение СМИ.
2. Добавить 50 мкл 16% параформальдегидом до 150 мкл 0,1 М КПО ₄ буфера в трубке, и добавить решение яиц камер, чтобы исправить их. Инкубируют в то время качания в течение 10 мин. ВНИМАНИЕ: параформальдегиде является токсичным.
3. Удалить фиксатор и промыть в два раза с 0,5 мл NP40 промывочного буфера.
4. Вымойте два раза в течение 15 минут каждый при комнатной температуре.
5. Обратитесь к стандарту, если протокол ¹⁵ для последующих шагов.
   1. Если коротко, то после фиксации, добавитьПервичные антитела на соответствующих разведений и инкубировать O / N при 4 ° С. Промыть в NP40 несколько раз, а затем добавить вторичные антитела (1: 200) разведений.
   2. Промыть несколько раз в NP40, затем добавить DAPI (1: 1000) в течение 10 мин, а затем повторить стирок. Один раз, если протокол будет завершена, добавить 200 мкл 50% глицерина в PBS, чтобы яйцо камер и оставьте при комнатной температуре в течение 2 часов.
   3. Удалить решение заменить его 70% глицерина в PBS, и накрыть фольгой. Поместите образец на 4 ᵒC до готовности для монтажа. Между тем, продолжите с шага 3.

3. Предварительная подготовка глицерина желе слайдов

1. Измерьте по крайней мере 4 мл глицерина желе с помощью шпателя и заполнить трубу стекло культуре клеток в половине пути знак. Melt глицерина желе на водяной бане при 55 ° С в течение 30 мин.
2. Налейте небольшое падение глицерина, примерно 300 мкл, от маточного раствора на два микроскопа. Использование ткани, распространяется глицерин в тонком LAЙер на каждом из слайдов. Это обеспечивает основу и позволяет легко удаления глицерина желе на этапе 5.6.
3. Отрежьте кончик от фильтрованного пипетки 1000 мкл. Использование пипетки сокращают для передачи 1000-1500 мкл теплой желе глицерина медленно каждому предметное стекло. Позаботьтесь, чтобы предотвратить пузыри.
4. Пусть глицерин желе скользит сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы установить.
5. Поместите каждую глицерин желе слайд в 60 мм × 15 мм чашки Петри и накрыть полиэтиленовой пленкой. Место в 4 ° CO / N. Возможно, магазин глицерина желе слайды до 5 дней при 4 ° С.

4. Монтаж яйцо палаты

1. Использование образцов, начиная с шага 2.5, пипетки несколько 3 мкл капель яичных камер в 70% глицерине через один глицерина желе слайда. Продолжить Пипетирование 3 мкл капли, пока все яйца камеры не на этом слайде. Убедитесь, что каждая капля содержит, по меньшей мере, десять яиц камер. Между тем, нагреть пробирку глицерина желе в C на водяной бане 55 °,
2. Поместите глицерин желе слайд с яйцом камер под микроскопом рассечение. Регулировка увеличения так, что только одна капля яиц камер в поле зрения (Фиг.1В).
3. Использование 30 иглы, ложки, подобрать нужный стадии яйца камеры. При необходимости, отдельные желаемые яичные камеры из в ovariole цепочку с помощью иглы, как ножом.
4. Чтобы избежать мусора, которые могут помешать изображений, передачи яйцо камеры во вторую глицерина желе слайд, с передней обращенной влево (фиг 1E -1). Повторяйте, пока не существует, по крайней мере семь яиц камеры выстроились в колонну (рис 1в).
5. Форма новые столбцы из семи, пока все нужные яичные камеры не передаются на второй глицерин желе слайда.
6. Оторвите небольшой кусочек ткани и твист. Используйте это, чтобы поглощать избыточную PBS глицерин из яиц камер, слегка касаясь каждой из них. Будьте осторожны, чтобы не удалить яичные камеры.
7. Отрежьтекончик пипетки фильтруют 200 мкл. Используйте это, чтобы передать 150 мкл глицерина желе, чтобы покрыть все столбцы яиц камер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: количество глицерина желе, необходимых для покрытия столбцы основан на этапах камеры яйцо и число столбцов. Количество может быть отрегулирована.
8. Пусть установленные яичные камеры сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, пока верхний слой глицерина желе не будет полностью затвердевает (рис 1D).
9. Место слайд конных яиц камер в 60 мм × 15 мм чашки Петри и накрыть полиэтиленовой пленкой. Хранить при температуре 4 ° СО / N, чтобы позволить глицерин желе слои, чтобы укрепить вместе (место в темноте, если есть опасения по поводу фотообесцвечиванию).

5. Подготовка яичных палат для работы с изображениями

1. Поместите слайд смонтированных яиц камер под микроскопом рассечение. Отрегулируйте увеличение, так что только одна колонка яиц камер находится в поле зрения.
2. Использование угол 45 ° миниатюрный скальпель, вырезать straigHT линии с правой стороны от первого столбца яиц камер (близких к задней стороне яйца камер). (Рисунок 1D-Е)
3. Далее, на голову выше первого яйца камеры в верхней и ниже последнего яйца камеры в колонке. В этот момент колонна яиц камер должны быть сокращены с трех сторон.
4. Использование microknife, срез вдоль левой стороны колонки, как можно ближе к передней стороне яйца камер (рис 1E -3).
5. Пипетировать 100 мкл холодной 1X PBT через колонку вырезом.
6. Используйте круглый краями шпателя, чтобы удалить лишнюю желе глицерина вокруг трех сторон разреза колонны яичных камер и отказаться, оставив остальное на слайде.
7. Вставьте шпатель в надреза на передней стороне яйца камер и отделить столбец из основного блока глицерин желе.
8. Подготовка образцов для любой перевернутые (5.8.1) или вертикально (5.8.2) микроскопии.
   1. Для инвертированный микроскоп: трансфер Tон колонна яиц камер для покровное с передней стороны яичных камер вниз. Повторите шаги 5,2-5,8 пока все столбцы глицерина желе не были удалены и установлены. Добавьте пару капель 50% PBS-глицерина на каждом блоке яичных камер, чтобы предотвратить их от высыхания. Изображение яичные камеры непосредственно на покровное.
   2. Для вертикального микроскопа: Трансфер столбец из яиц камер для предметное стекло микроскопа с передней стороной вверх. Повторите шаги 5.2-5.9, пока все столбцы глицерина желе не были удалены и установлены на предметных стеклах. Добавьте пару капель 50% PBS-глицерина на каждом блоке яичных камер и крышки блоков с # 1 ½ покровное.

Результаты

Метод прямой визуализации позволил нам увидеть непосредственно в организацию клеток в передней фолликулярного эпителия на стадии 8. общим маркером для судьбы фолликул клеток, об отсутствии Глаза (ЕЯ) белок, а также маркер ядерной ДНК DAPI, показали даже выражение по этой области клеток, и...

Обсуждение

Здесь мы опишем метод монтажа и изображение небольшой, развивающееся яйцо камеры с точки зрения конечного дальше. Общие методы для работы с изображениями яйца камер оптимизированы для боковым видом и, прежде всего, позволяют точно визуализировать Медио-боковая фолликулярных клеток п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)			Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle	VWR	BD305106	Regular bevel
Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	To fatten female flies
Bovine Serum Albumin	PAA-cell culture company	A15-701	Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10	Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich	D9542	5 mg/ml stock solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16140-071	Added to supplement dissection medium (10%)
Glass culture tube	VWR	47729-576	14 ml
Glass Depression Slides	VWR	470019-020	1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	Mounting media
Glycerol	IBI Scientific	IB15760	70% in PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer
Leica Fluorescent Stereoscope	Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope	Leica Microsystems		40x/0.55NA dry objective
Micro spatula	VWR	82027-518	Stainless steel
Microscope Slide	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer			50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Life Technologies	10378-016	Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile	VWR	82050-548	60 W x 15 H mm
Phosphate Buffer Saline	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786-500G	Used in 0.1 M KPO4 Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P9791-500G	Used in 0.1 M KPO4 Buffer
[header]
Schneider’s Insect Medium	Life Technologies	11720018	With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-25G	Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G	Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCl	IBI Scientific	IB70144	1 M TRIS-HCl, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software	PerkinElmer		For processing confocal Z-stacks