Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

Zusammenfassung

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Zusammenfassung

Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologische Verfahren zur Bestimmung der Netzhautfunktion. Durch die Anordnung einer Elektrode auf der Oberfläche der Hornhaut, in Antwort auf Licht erzeugte elektrische Aktivität kann gemessen und verwendet, um die Aktivität von Netzhautzellen in vivo zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Verwendung von der ERG zur Sehfunktion im Zebrafisch zu messen. Zebrafische sind seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren wegen der Leichtigkeit der Gen-Unterdrückung durch Morpholino Oligonukleotiden und pharmakologische Manipulation genutzt. 5-10 dpf sind nur Zapfen Funktions im Larvennetzhaut. Daher ist die Zebrafisch, im Gegensatz zu anderen Tieren, ist ein leistungsfähiges Modellsystem für das Studium der Kegel visuellen Funktion in vivo. Dieses Protokoll verwendet Standard-Anästhesie, Mikromanipulation und Stereomikroskopie-Protokolle, die in Labors, die Zebrafisch-Forschung führen gemeinsam sind. Die beschriebenen Methoden verwenden Standard-Elektrophysiologie equipment und eine Lichtkamera, um die Platzierung der Aufnahme Mikroelektroden auf die Larvenhornhaut führen. Schließlich zeigen wir, wie ein handelsüblicher ERG Stimulator / Recorder ursprünglich für den Einsatz mit Mäusen entwickelt, kann leicht für die Verwendung mit Zebrafisch angepasst werden. ERG der Larven Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Verfahren zur Untersuchung Kegel Sehfunktion bei Tieren, die von Morpholino Oligonukleotid Einspritzung geändert wurden, sowie neuere Genom-Engineering-Techniken wie beispielsweise Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) Transkriptionsaktivator-Like Effektor Nukleasen (Talens) und Regelmäßig gruppierten beabstandeten Kurz Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, alle haben die Effizienz und Wirksamkeit des Gen-Targeting in Zebrabärbling stark erhöht. Darüber hinaus nutzen wir die Fähigkeit von pharmakologischen Mitteln zur Zebrafisch-Larven, die molekularen Komponenten, die dem Photo beitragen bewerten zu durchdringen. Dieses Protokoll beschreibt eine Einrichtung, die geändert und von den Forschern verwendet werden könnenmit verschiedenen experimentellen Ziele.

Einleitung

Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologischen Verfahren, die ausführlich in der Klinik für die Bestimmung der Funktion der Retina in Menschen verwendet wird. Die elektrische Aktivität in Reaktion auf einen Lichtreiz, wird durch Anordnen Aufzeichnungselektroden auf der äußeren Oberfläche der Hornhaut gemessen. Die Eigenschaften des Reizparadigma und der Antwort-Wellenform zu definieren, die retinalen Neuronen, die zur Reaktion. Dieses Verfahren ist für den Einsatz mit einer Reihe von Tiermodellen, einschließlich Mäusen und Zebrafisch angepasst. Die typische Wirbel ERG Antwort hat vier Hauptkomponenten: das a-Welle, die eine Hornhaut-negatives Potential von Photorezeptorzellaktivität abgeleitet ist; die b-Welle, eine Hornhaut-positives Potential von der ON bipolaren Zellen abgeleitet; der d-Welle, eine Hornhaut-positiven Potential wie die Aktivität der OFF bipolaren Zellen interpretiert; und die c-Welle, die nach der b-Welle einige Sekunden auftritt und spiegelt Aktivität in Müller Glia und retinal Pigmentepithel ^1-4. Zusätzliche Hinweise für das Verständnis der Geschichte und Prinzipien der ERG Analyse bei Menschen und Modelltiere sind die Online-Lehrbuch, Webvision, von der University of Utah und Texte wie den Principles and Practice of Clinical Elektrophysiologie des Sehens ^{4, 5.}

Danio rerio (Zebrafisch) ist seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren begünstigt worden, aufgrund seiner schnellen Reifung und Transparenz, die für die nichtinvasive morphologische Analyse von Organsystemen, Verhaltens-Assays und sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens (zur Übersicht siehe Fadool und ermöglicht Dowling ^6). Zebrafisch-Larven sind sehr gut für genetische und pharmakologische Manipulation, die, wenn sie mit ihrer hohen Fruchtbarkeit, machen sie eine ausgezeichnete Tiermodell für die Hochdurchsatz-biologischen Analysen. Das höhere Verhältnis von Kegeln mit Stangen in Larven Zebrabärbling - etwa 1: 1 im Vergleich zu Mäusen (~ 3% Konuse) - machen sie besonders nützlich für die Untersuchung der Kegelfunktion ^7-9.

In der Retina von Wirbeltieren entwickeln Kegel vor Stangen ^10. Interessanterweise sind Zebrafisch Kegel operative bereits 4 dpf, was eine selektive elektrophysiologische Analyse der Kegel in diesem Stadium ^{6, 11,12.} Im Gegensatz dazu ERG-Antworten in Stäbe erscheinen zwischen 11 und 21 dpf ^13. Daher Zebrafisch-Larven bei 4-7 dpf funktionell dienen als All-Kegel Netzhaut. Allerdings ist die Mutterphotopischen ERG Antwort von 4-7 dpf Larven von der b-Welle dominiert. Anwendung von pharmakologischen Mitteln, wie beispielsweise L - (+) - 2-Amino-4-phosphono-buttersäure (L-AP4), ein Agonist des metabotropen Glutamat (mGluR6) Rezeptors durch den, bezogen auf die bipolaren Zellen, blockiert wirksam die Erzeugung der b-Welle und zeigt die isolierte Kegel Masse receptor potential, (die "a-Welle"), ^14-17.

Hier beschreiben wir eine einfache und reliable Verfahren für ERG Analyse mit handelsüblichen ERG Geräte für den Einsatz mit Mäusen, die für die Verwendung mit Zebrafisch-Larven adaptiert wurden konzipiert. Dieses System kann auf Zebrafisch-Larven mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen, sowie diejenigen, mit pharmakologischen Mitteln behandelt, die Forscher bei der Identifizierung von Signalwegen, die visuelle Empfindlichkeit und leichte Anpassung ¹⁶ beitragen unterstützen genutzt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wird Ermittler im Gebrauch von ERG-Analyse, um eine Vielzahl von biologischen Fragen zu beantworten Vision führen und zeigen den Aufbau eines flexiblen ERG-Setup.

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Protokoll

Tier Pflege und experimentelle Protokolle wurden von den Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt, und erfüllen alle Anforderungen der NIH Office of Laboratory Animal Welfare und der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung für Labortier Care International.
HINWEIS: Um die Larven für ERG Analyse zu erhalten, veröffentlicht Protokolle für Standard Zebrafischhaltung und Wartung eingesetzt wurden ^18. Larven werden durch natürliche Zucht erhalten und unter einem 14 Stunden Licht / 10 h Dunkel-Zyklus untergebracht. Dieses Protokoll wurde für die Larven in 5-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) optimiert worden, konnte aber im Idealfall auf ältere Fische mit kleinen Änderungen an der Vorgehensweise durchgeführt werden. Hier verwenden Sie die TL-Stamm von Wildtyp-Zebrafisch-Larven bei 5 dpf.

1. Mikropipette Produktion

1. Ziehen Sie mehrere Mikropipetten mit 1,5 x 0,86 mm (Außendurchmesser von Innendurchmesser) feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren mitFilament (Schmelztemperatur, 821 ° C) und eine P-97 Flaming / Braun Mikropipette Abzieher mit Feld Wärme Filament eingebaut. Verwenden Sie das Programm für die Gestaltung in Tabelle 1 beschriebenen Mikropipetten.
2. Überprüfen Sie jede Mikropipette unter dem Mikroskop mit einem geeigneten Raster Lineal, um sicherzustellen, dass Spitzen sind 10-15 um im Durchmesser und hat eine glatte Bahnöffnung (dh keine scharfen Kanten).
3. Sorgfältig zu verwahren Mikropipetten zur Spitze Schäden und die Belastung durch Staub zu verhindern. Speicheroptionen Petrischalen mit Labor-Band, mit Schaumstoff ausgekleideten Boxen, oder im Handel erhältliche Mikropipette Lagerbehälter.
   Hinweis: andere Mikropipette Abzieher und Glaskapillaren kann, solange die richtigen Durchmesser der Mikropipette und eine hochwertige Spitze erreicht wird.

Druck	Wärme	Ziehen	Geschwindigkeit	Zeit
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

Tabelle 1: Programm für die Herstellung von Mikropipetten mit einem P-97 Flaming / braun Mikropipette Abzieher mit einem Kasten Wärme Filament eingebaut Mikropipetten werden mit 1,5 x 1,0 mm ² (Außendurchmesser von Innendurchmesser) feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren mit Filament. (Schmelztemperatur 821 ° C).

2. Buffer Vorbereitung

1. Gebrauch gefiltert, oxygenierte fish Ringer-Puffer ¹⁹ in der Mikroelektrode Kapillare und den Polyvinylalkohol (PVA) Schwamm, auf welche die Larven werden für Experimente platziert sättigen. Alternativ können Sie E3 Embryo Medien oder Hanks Balanced Salt Solution.
2. Bereiten Lösung 10x Goldfisch Ringer wie in Tabelle 2 beschrieben einstellen auf pH 7,8 und sterilisiert mit einem 0,22 um Filter und lagern Sie die 10-faches bei 4 ° C.
3. Erstellen Sie eine Arbeitslösung auf dem Tag des Experiments durch die 10x Ringerlösung verdünnt mit deionisiertem, destilliertem Wasser 1x. Filter mit einem 0,22 um Filter-System. Oxygenat durch Blasenbildung mit 95% O _2/5% CO _{& sub2; -Gas} für 10 Minuten. Deckel fest danach, um sicherzustellen, dass die Lösung bleibt oxygenierten.

NaCl	1,25 M
KCl	26 mM
CaCl 2	25 mM
MgCl2	10 mM
Glucose	100 mM
HEPES	100 mM

jove_content "> Tabelle 2: Herstellung einer Lösung 10x Goldfisch Ringer.

3. Elektroretinogramm Platform

1. Führen ERG Experimente an einem Anti-Vibrationstisch in einem Faraday-Käfig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Befestigen Sie eine benutzerdefinierte Stahlplattform mit dem Antivibrationstisch mit Sechskantmuttern. Legen Sie eine bewegliche Kunststoffplattform mit einem viskoelastischen Urethanpolymer stoßdämpfenden Boden auf den Tisch unter die Lichtquelle.
2. Positionieren Sie die Kamera mit einem magnetisierten stand, sich an den beweglichen Kunststoff-Plattform ab. Positionieren Sie den Mikromanipulator mit einem zweiten magnetisierten Stand auf der rechten Seite des beweglichen Kunststoff-Plattform (die die Aufzeichnungsmikro halten wird). Sicherzustellen, dass die Kamera und der Mikromanipulator wird nicht durch die Bewegung der anderen Geräte gestört werden und dass sie nicht die Beleuchtung von der Lichtquelle zu blockieren.
3. Schließen Sie die Kamera an einen Videomonitor und positionieren Sie es, um das Auge des sehenLarve für die Platzierung der Elektrode in der richtigen Position.
4. Stellen Sie sicher, dass das Setup richtig mit Kupferdraht geerdet. Um das Rauschen zu überprüfen, legen Sie die Referenzelektrode und die Spitze der Mikroelektrode in einer Aufnahme 35 mm Petrischale mit Ringer-Lösung gefüllt. Überprüfen Sie die elektrische Geräuschpegel des Setup mit einem Oszilloskop oder einem eingebauten Merkmal der ERG Gerät. Der Geräuschpegel sollte nicht mehr als ± 10 & mgr; V von der Grundlinie sein.

4. Sponge Vorbereitung

1. Schneiden Sie ein kleines Rechteck von trockenem PVA Schwamm, der fest in einer 35 mm Petrischale passt. Die Dicke des Schwammes sollte nicht größer als die Tiefe der Schale sein. Mit einem Messer mit einer sauberen Rasierklinge zum Schneiden.
2. Vereinbaren Sie einen zusätzlichen Schnitt in den Schwamm, um die Referenzelektrode unterzubringen (entweder ein flacher Schnitt der Länge nach auf den Boden der Schwamm oder ein Schmetterling vertikal durch eine der kleineren beschnitten).
3. Verwenden Sie einen chemisch beständigen Markierungum einen kleinen Punkt auf dem Schwamm (wo die Larve gelegt werden), die zur Positionierung der Kamera verwendet werden kann, zu markieren.
4. Weichen Sie die PVA Schwamm in Ringer-Lösung bis zur Sättigung. Entfernen und tupfen Sie schnell auf ein Papiertuch 2-3 mal. Setzen Sie den Schwamm in einer sauberen 35-mm-Petrischale.
5. Platzieren Sie die Petrischale mit dem Schwamm auf der Plastikplattform, so daß die Markierung von der Kamera sichtbar gemacht werden.

5. Elektrodenvorbereitung

HINWEIS: Der Zebrafisch Aufbau besteht aus einer Referenzelektrode in Kontakt mit der Ringerlösung gesättigten PVA-Schwamm und einer Aufzeichnungselektrode, die in Kontakt mit der Hornhaut. Die Bezugselektrode besteht aus einer Ag / AgCl-Pellet. Die Aufzeichnungselektrode ist eine gezogene Glasmikropipette mit Ringer-Lösung gefüllt und durch ein Mikroelektrodenhalter, die eine Ag-Draht gehalten.

1. Chlorid die Elektroden durch Einweichen in 6-9% Natriumhypochlorit (Bleiche) für 5 min (die Aufzeichnungs microelectrode Draht) oder 15 Minuten (die Referenzelektrode). Luft trocknen auf einem Kimwipe für 5 min.
   1. In Abhängigkeit von der Art der Schnitt in Schritt 4.2 gemacht, legen Sie die Ag / AgCl-Pellet der Referenzelektrode in die (für die vertikale Schmetterling ausschneiden) oder mit (für die flache Schnitt der Länge nach auf den Boden) dem Schwamm. Befestigen Sie die Referenzelektrode führen zu dem Aufzeichnungssystem.
   2. Alternativ, wenn die ERG Setup hat Platz oder gibt es besonders starke Photovoltaik-Artefakten aus der Ag / AgCl-Elektrode, schließen Sie die Referenzelektrode mit dem Schwamm über ein Agar-Salzbrücke, die Elektrode aus dem Lichtweg zu bewegen.
2. Bringen ~ 40 cm von geeigneter Größe Schlauch an einen 5 ml nicht-Luer-Lock-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit Ringerlösung. Mikroelektrodenhalter besitzen Druckanschlüsse versenden in der Regel mit Adaptern für Schläuche mit Innendurchmessern von 1/16 unterzubringen ", 3/32", 1/8 "oder 5/32".
3. Füllen Sie eine 1 ml nicht-Luer-Lock-Spritze mitRinger-Lösung und mit einem Micro-fil, sorgfältig füllen die Mikroelektrodenhalter. Verhindern die Bildung von Blasen.
4. Befestigen Sie die 5-ml-Spritze mit dem Druckanschluss der Mikroelektrode Halter mit Schlauch und es verwenden, um sicherzustellen, dass die Mikroelektrodenhalter ist voll von Ringer-Lösung. Mit dem Micro-fil und 1-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt, füllen Sie die Mikropipette Glas von der Spitze und sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
5. Befestigen Sie die Glas-Mikropipette auf die Mikroelektrodenhalter, wobei Sie darauf achten, den Elektrodendraht gerade zu halten. Sobald gesichert mit der 5 ml Spritze sorgfältig zwingen Ringerlösung durch die Mikroelektrode, bis eine kleine Menge der Lösung auf die Spitze sichtbar ist. Gelegentliche Anwendung von Druck auf die Spritze (wenn sie nicht an der Hornhaut angewendet wird) wird die Bildung von Luftblasen sowie Einschlüsse aufgrund von Staub oder Salzansammlung zu verhindern, in die Mikropipettenspitze.
   1. Wenn die Lösung herauskommt als ein Strom, ersetzen Sie die glass Mikropipette, die Spitzenöffnung zu groß ist oder beschädigt ist.
6. Legen Sie das Aufnahme-Mikroelektrode im Mikromanipulator und befestigen Sie das Kabel mit dem Aufnahmesystem.

6. Elektroretinogramm Analyse

HINWEIS: Aufgrund der Kegel Dominanz des Larvennetzhaut, können qualitativ hochwertige ERG Ergebnisse erhalten, wenn die Vorbereitungen für die Aufnahme unter niedrigen indirekten weißem Licht durchgeführt werden (<1 Lux) oder für kurze Zeit (<1 min) höherer Intensität ( ≤250 Lux) Arbeitslicht. Eine kurze Zeit der Dunkeladaptation ist weiterhin erforderlich, vor der Aufnahme (siehe Schritt 6.7). Jedoch können Versuche unter schwach rot oder Infrarotlicht unter Verwendung einer infrarotempfindlichen Kamera durchgeführt werden. Alle Experimente wurden in steril filtriert (0,22 um) System Wasser von der UNC Zebrafisch Aquakulturanlage durchgeführt, aber alternative Embryo Mittel können angewendet werden.

1. Schneiden Sie Papiertuch Quadraten mit Abmessungen von ungefähr 1cm ^2.
2. Wenn die Messung isoliert Kegel Masse receptor potential, Inkubation 3-5 Larven im System Wasser mit 500 uM (±) -2-Amino-4-phosphonobutyric Säure (APB) für 5 min.
   HINWEIS: Wenn APB ist eine racemische Mischung des aktiven (L) oder inaktiven (R) Formen AP4, ist es als L-AP4 als wirksame und weniger teuer.
3. Anesthetize 3-5 Larven im System Wasser mit 0,02% (w / v) Tricaine, bis nicht mehr reagiert, ca. 1-2 min.
4. Verwenden einer Pasteurpipette und Pipettenpumpe einzelne Larven vorsichtig Transfer auf Papiertuch Quadrate unter Sezieren Stereoskop mit minimalen Beleuchtungsstärke (Lux ≤250 <1 min). Überprüfen Sie die Position der einzelnen Larve und wählen Sie einen Kandidaten, der Rückenseite mit einer nicht verschlossenen Auge ist.
   1. Für längere Aufnahmen (> 30 min), feucht zu halten die Larve durch Verglasung der Körper bis zu aber nicht einschließlich der Kopf mit 3% Methylcellulose mit einem feinen Kamelhaarbürste.
5. Mit einer Pinzette, übertragen Sie die Papiertuch square mit der Larve in die feuchten PVA Schwamm.
   1. Für längere Aufnahmen (> 30 min), gelten ein kontinuierlicher Strom von wassergesättigter 100% O _{2 -Gas} über die Larve durch Einblasen des Gases durch eine Ausströmer in einem Seitenarm-Kolben, der destilliertes Wasser. Positionieren Sie den Schlauch Verlassen der Kolben Seitenarm, der die befeuchteten Sauerstoff in der Nähe von Kopf der Larve vermittelt.
      HINWEIS: Schritt 6.4.1 und Schritt 6.5.1 wird die Lebensdauer des Fisches ¹⁶ zu verlängern.
6. Unter minimale Beleuchtung, verwenden Sie den Mikromanipulator und Kamera, um die Mikroelektrodenspitze in der Mitte zwischen der Nasen und Schwanzenden der Augenposition und drücken Sie vorsichtig auf die dorsale Grenze der Hornhaut.
   HINWEIS: Fehlanordnung der Elektrodenspitze in die entfernt distalen Bereichen der Hornhaut in ERG-Wellenformen mit umgekehrter Polarität führen.
7. Lassen Larve bis dunkel anpassen 5-10 min.
8. Nehmen Testblitz Reaktionen auf Licht von einer LED-Lichtquelle oder Licht Stimulator zur Verfügung gestellt mit dem avaiLabel Stimulation und Aufnahmegeräte. Passen Protokollparameter wie die Blitzintensität, Blitzweite, Blitzfarbe, Hintergrundintensität und Farb und Filtereinstellungen, um das Experiment zu passen.
9. Wenn das Experiment beendet ist, einschläfern Larven nach AVMA / IACUC Richtlinien.

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Ergebnisse

Typischerweise werden ERGs von Zebrafisch-Larven bei 5 dpf erfasst, da eine Reihe von Studien haben ERG Aufnahmen in dieser Phase ^{9, 16,20} veröffentlicht. Larven Antworten wurden unter dunkeladaptierten Bedingungen ohne Hintergrundbeleuchtung mit einem 20 ms Reiz weißem LED-Licht gemessen. Wir verwendeten einen handelsüblichen ERG-System, bestehend aus einem Ganzfeld Licht Stimulator und Computer-Controller / Recorder. Der Stimulator verwendet ein proprietäres Pulsbreitenmodulation (PWM) System streng kon...

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Diskussion

In diesem Protokoll ein einfaches Verfahren für die ERG-Aufnahmen von Larven Zebrafisch wird beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und umfassende Test der visuellen function.There gibt mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Verfahrens, das im Auge behalten werden sollte. Der Zebrafisch-Larven sollten gesund sein, bevor das Experiment zu Tode während der potenzielle medikamentöse Behandlungen zu vermeiden und eine längere Lebensunterhalt während der ERG-Aufnahmen. Darüber hinaus ist es wichtig, d...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard