Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

Riepilogo

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

L'elettroretinogramma (ERG) è un metodo non invasivo per determinare elettrofisiologico funzione retinica. Attraverso il posizionamento di un elettrodo sulla superficie della cornea, attività elettrica generata in risposta alla luce può essere misurato e utilizzato per valutare l'attività di cellule retiniche in vivo. Questo manoscritto descrive l'uso della ERG per misurare la funzione visiva in zebrafish. Zebrafish sono stati a lungo utilizzato come modello per lo sviluppo vertebrato a causa della facilità di soppressione genica mediante oligonucleotidi morfolino e manipolazione farmacologica. A 5-10 dpf, solo coni sono funzionali nella retina larvale. Pertanto, il zebrafish, a differenza di altri animali, è un potente sistema modello per lo studio della funzione visiva cono in vivo. Questo protocollo utilizza l'anestesia standard micromanipolazione e protocolli stereomicroscopia che sono comuni nei laboratori che eseguono la ricerca zebrafish. I metodi di cui fanno uso di eq elettrofisiologia normaAZIONE e una telecamera a bassa luce per guidare il posizionamento della microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale. Infine, si dimostra come un disponibile in commercio ERG stimolatore / registratore originariamente progettato per l'uso con i topi possono essere facilmente adattato per l'uso con zebrafish. ERG di zebrafish larvale fornisce un metodo eccellente per saggiare cono funzione visiva in animali che sono stati modificati da morpholino iniezione oligonucleotide nonché nuove tecniche di ingegneria del genoma come zinco Finger nucleasi (ZFNs), Trascrizione Activator-Like Effector nucleasi (Talens), e cluster regolarmente intervallate brevi palindromo Ripete (CRISPR) / Cas9, i quali hanno notevolmente aumentato l'efficienza e l'efficacia del gene targeting in zebrafish. Inoltre, abbiamo approfittato della capacità di agenti farmacologici di penetrare larve zebrafish per valutare le componenti molecolari che contribuiscono alla fotorisposta. Questo protocollo delinea una configurazione che può essere modificato e utilizzato dai ricercatoricon diversi obiettivi sperimentali.

Introduzione

L'elettroretinogramma (ERG) è un metodo elettrofisiologico invasivo che è stato ampiamente utilizzato in clinica per determinare la funzione della retina nell'uomo. L'attività elettrica in risposta ad uno stimolo luce viene misurata ponendo elettrodi di registrazione sulla superficie esterna della cornea. Le caratteristiche del paradigma stimolo e la forma d'onda di risposta definiscono i neuroni retinici contribuiscono alla risposta. Questo metodo è stato adattato per l'uso con un certo numero di modelli animali tra cui topi e zebrafish. La tipica risposta vertebrati ERG ha quattro componenti principali: l'a-onda, che è un potenziale cornea-negative derivanti dall'attività cellule fotorecettori; la b-wave, un potenziale positivo cornea derivato dal ON cellule bipolari; d-onda, un potenziale positivo cornea interpretato come l'attività delle cellule bipolari OFF; e il c-onda, che si verifica alcuni secondi dopo la b-wave e riflette l'attività in Müller glia e il retinale pigmento epitelio ^1-4. Ulteriori riferimenti per la comprensione della storia e dei principi di analisi ERG negli esseri umani e modelli animali sono il libro di testo on line, WebVision, presso la University of Utah e testi, come i Principi e Pratica di Elettrofisiologia clinica di Vision ^{4, 5.}

Danio rerio (zebrafish) è stato a lungo favorita come un modello di sviluppo dei vertebrati, a causa della sua rapida maturazione e trasparenza, che permette l'analisi morfologica non invasiva dei sistemi d'organo, test comportamentali e sia in avanti e retromarcia schermi genetici (per la revisione, vedi Fadool e Dowling ^6). Larve Zebrafish sono altamente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica, che, accoppiato con la loro alta fecondità, loro un ottimo modello animale per le analisi biologiche high-throughput fare. Il più alto rapporto di coni di canne in zebrafish larvale - circa 1: 1 rispetto ai topi (~ 3% a conos) - renderli particolarmente utile per lo studio della funzione cono ^7-9.

Nella retina dei vertebrati, coni sviluppano prima di aste ^10. È interessante notare che, coni zebrafish sono operativi già dal 4 dpf, consentendo selettiva analisi elettrofisiologiche di coni in quella fase ^{6, 11,12.} Al contrario, le risposte ERG a barre compaiono tra 11 e 21 dpf ^13. Pertanto, larve di zebrafish 4-7 dpf servire funzionalmente come retina all-cono. Tuttavia, il nativo fotopico risposta ERG di 4-7 dpf larve è dominato dalla b-wave. Applicazione di agenti farmacologici, quali L - (+) - 2-ammino-4-fosfono-butirrico (L-AP4), un agonista per il glutammato metabotropici (mGluR6) recettore espresso dalla ON cellule bipolari, blocca efficacemente la generazione del B-wave e rivela il potenziale isolato massa cono recettore, (la "a-wave") ^14-17.

Qui si descrive un semplice e reliablMetodo e per l'analisi ERG utilizzando disponibili in commercio apparecchiature ERG progettato per l'utilizzo con i topi che sono stati concepiti per essere utilizzati con le larve di zebrafish. Questo sistema può essere utilizzato su larve zebrafish di varia background genetici, così come quelli trattati con agenti farmacologici, per aiutare i ricercatori nella identificazione di vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e adattamento alla luce ^16. Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo guideranno gli investigatori in uso dell'analisi ERG per rispondere a una serie di domande biologiche relative alla visione, e dimostrare la costruzione di una configurazione flessibile, ERG.

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Protocollo

Mantenimento degli animali e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale della University of North Carolina a Chapel Hill, e soddisfano tutte le esigenze dell'Ufficio NIH di laboratorio Animal Welfare e l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International.
NOTA: Per ottenere le larve di analisi ERG, pubblicato protocolli per la zootecnia zebrafish norma e manutenzione sono stati impiegati ^18. Le larve sono ottenuti attraverso l'allevamento naturale e ospitato sotto una luce 14 ore / 10 ore ciclo scuro. Questo protocollo è stato ottimizzato per le larve in 5-7 giorni dopo la fecondazione (DPF), ma potrebbe essere idealmente eseguite sul pesce più vecchio con piccole modifiche alla procedura. Qui, utilizzare il ceppo TL di wild-type larve di zebrafish a 5 dpf.

1. Micropipetta Produzione

1. Tirare diversi micropipette con 1,5 x 0,86 millimetri (diametro esterno da diametro interno) capillari in vetro borosilicato fuoco lucido confilamento (temperatura di fusione, 821 ° C) e un P-97 Flaming / Brown Micropipetta Estrattore dotato di filamento calore scatola. Utilizzare il programma per modellare micropipette descritti nella tabella 1.
2. Controllare ogni micropipetta al microscopio con un appropriato righello reticolo per garantire che suggerimenti sono di 10-15 micron di diametro ed ha un'apertura punta liscia (cioè, senza bordi frastagliati).
3. Conservare con cura micropipette per evitare danni punta e l'esposizione alla polvere. Le opzioni di memorizzazione includono piastre di Petri con del nastro di laboratorio, scatole di schiuma rivestita, o contenitori micropipetta disponibili in commercio.
   NOTA: Altri estrattori micropipetta di vetro e capillari possono essere usati fino a quando il corretto diametro della micropipetta e una punta di alta qualità è ottenuta.

Pressione	Calore	Tirare	Velocità	Tempo
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

Tabella 1: Programma per la produzione di micropipette con un P-97 Flaming / marrone Micropipetta Estrattore dotato di un filamento di calore casella micropipette sono realizzati con 1,5 x 1,0 mm ² (diametro esterno dal diametro interno) capillari di vetro borosilicato ribruciate con filamento. (temperatura di fusione, 821 ° C).

2. Buffer Preparazione

1. Utilizzare filtrato, tampone ossigenato pesci rossi di Ringer ¹⁹ nella microelettrodo capillare e saturare la spugna alcool polivinilico (PVA) su cui le larve sono collocati per esperimenti. In alternativa, utilizzare E3 supporti embrione o soluzione salina bilanciata di Hank.
2. Preparare la soluzione 10x pesci rossi di Ringer, come descritto nella Tabella 2. Regolare a pH 7,8, e sterilizzare utilizzando un filtro 0,22 micron e conservare lo stock 10x a 4 ° C.
3. Creare una soluzione di lavoro il giorno dell'esperimento diluendo la soluzione di Ringer 10x a 1x con deionizzata, acqua distillata. Filtrare su un filtro di 0,22 micron. Ossigenare insufflando 95% O _2/5% CO ₂ gas per 10 minuti. Cap strettamente seguito per garantire che la soluzione rimane ossigenato.

NaCl	1.25 M
KCl	26 mm
CaCl 2	25 MM
MgCl 2	10 mM
glucosio	100 MM
HEPES	100 MM

jove_content "> Tabella 2: Preparazione della soluzione di 10x pesci rossi di Ringer.

3. Elettroretinogramma Platform

1. Eseguire esperimenti ERG su un tavolo antivibrante all'interno di una gabbia di Faraday per migliorare il rapporto segnale-rumore. Allegare una piattaforma in acciaio personalizzato al tavolo anti-vibrazioni con dadi esagonali. Inserire una piattaforma mobile di plastica con un polimero uretanico ammortizzante inferiore viscoelastico sul tavolo sotto la sorgente luminosa.
2. Posizionare la fotocamera con uno stand magnetizzato, volto giù alla piattaforma mobile di plastica. Posizionare il micromanipolatore (che eserciterà la microelettrodo registrazione) con un secondo supporto magnetizzato alla destra della piattaforma mobile di plastica. Assicurarsi che la fotocamera e micromanipolatore non saranno disturbati dal movimento di altre apparecchiature e che non blocchino illuminazione dalla sorgente luminosa.
3. Collegare la fotocamera a un monitor video e posizionarla per visualizzare l'occhio dellarva per collocare l'elettrodo nella posizione corretta.
4. Assicurarsi che l'impostazione sia collegato a terra con filo di rame. Per controllare il rumore, collocare l'elettrodo di riferimento e punta del microelettrodo registrazione in una piastra di Petri 35 millimetri riempito con soluzione di Ringer. Controllare i livelli di rumore elettrici della configurazione con un oscilloscopio o una funzione incorporata dell'apparato ERG. I livelli di rumore dovrebbero essere non più di ± 10 mV dal basale.

4. Sponge Preparazione

1. Tagliare un piccolo rettangolo di spugna PVA secca che si inserisce perfettamente in una capsula di Petri da 35 mm. Lo spessore della spugna non deve essere maggiore della profondità del piatto. Usare un taglierino con una lama di rasoio pulito per il taglio.
2. Effettuare un taglio aggiuntivo nella spugna per accogliere l'elettrodo di riferimento (un taglio superficiale longitudinale sul fondo della spugna o una farfalla tagliato verticalmente attraverso una delle estremità inferiori).
3. Utilizzare un marcatore resistente agli agenti chimiciper contrassegnare un puntino sulla spugna (dove verrà posizionata la larva) che può essere utilizzato per il posizionamento della telecamera.
4. Immergere la spugna PVA in soluzione di Ringer fino a saturazione. Rimuovere e asciugare rapidamente su un tovagliolo di carta 2-3 volte. Posizionare la spugna in un ambiente pulito 35 millimetri piastra di Petri.
5. Posizionare il piatto Petri contenente la spugna sulla piattaforma di plastica in modo che il marchio può essere visualizzata dalla telecamera.

5. elettrodi Preparazione

NOTA: La configurazione zebrafish è costituito da un elettrodo di riferimento in contatto con la soluzione satura di PVA spugna del Ringer e un elettrodo di registrazione a contatto con la cornea. L'elettrodo di riferimento costituito da un pellet Ag / AgCl. L'elettrodo di registrazione è una micropipetta di vetro tirato riempito con soluzione di Ringer e tenuto da un supporto microelettrodo contenente un filo di Ag.

1. Cloruro gli elettrodi, mettetelo a bagno in 6-9 ipoclorito% di sodio (candeggina) per 5 min (il MICR registrazioneoelectrode fili) o 15 minuti (l'elettrodo di riferimento). Aria secca su un Kimwipe per 5 min.
   1. A seconda dello stile di taglio effettuato nel passo 4.2, posizionare il pellet Ag / AgCl dell'elettrodo di riferimento in (per la farfalla taglio verticale) o sotto (per il taglio superficiale longitudinalmente sul fondo) la spugna. Attaccare il cavo elettrodo di riferimento al sistema di registrazione.
   2. In alternativa, se l'impostazione ERG ha vincoli di spazio o ci sono particolarmente forti artefatti fotovoltaici dall'elettrodo Ag / AgCl, collegare l'elettrodo di riferimento sulla spugna attraverso un ponte salino agar per spostare l'elettrodo dal percorso ottico.
2. Attaccare ~ 40 cm di tubo di dimensioni appropriate per una siringa da 5 ml di blocco non-Luer. Riempire la siringa con soluzione di Ringer. Titolari di microelettrodi possesso prese di pressione vengono spediti con adattatori per ospitare tubi con diametri interni di 1/16 ", 3/32", 1/8 "o 5/32".
3. Riempire un 1 ml non Luer Siringa serratura conSoluzione di Ringer e, utilizzando un Micro-fil, riempire accuratamente il supporto microelettrodo. Evitare la formazione di bolle.
4. Attaccare la siringa da 5 ml di porta di pressione del titolare microelettrodo con tubi e utilizzarla per garantire che il titolare microelettrodo è pieno di soluzione di Ringer. Utilizzando il Micro-fil e la siringa da 1 ml riempita con soluzione di Ringer, riempire il bicchiere micropipetta dalla punta e accertarsi che non siano presenti bolle.
5. Fissare la micropipetta di vetro al titolare microelettrodo, facendo attenzione a mantenere il dritto filo elettrodo. Una volta fissato, utilizzare la siringa 5 ml di forzare accuratamente soluzione di Ringer attraverso il microelettrodo fino ad una piccola quantità di soluzione è visibile sulla punta. Applicazione occasionale della pressione alla siringa (quando non è applicata alla cornea) impedirà la formazione di bolle d'aria, nonché occlusioni dovute alla polvere o accumulo di sali, nella punta micropipetta.
   1. Se la soluzione viene fuori come un flusso, sostituire la gmicropipetta lass, come l'apertura punta è troppo grande o è danneggiato.
6. Posizionare con cura il microelettrodo registrazione nel micromanipolatore e collegare il cavo al sistema di registrazione.

6. Analisi Elettroretinogramma

NOTA: A causa del predominio cono della retina larvale, risultati di ERG di alta qualità possono essere ottenuti quando i preparativi per la registrazione vengono eseguite sotto bassi livelli di luce bianca indiretta (<1 lux) o con brevi periodi (<1 min) di maggiore intensità ( ≤250 lux) Luce di lavoro. È quindi richiesto un breve periodo di adattamento al buio prima della registrazione (vedere il passaggio 6.7). Tuttavia, gli esperimenti possono essere eseguiti in fioca luce rossa o infrarossa utilizzando una telecamera a raggi infrarossi sensibile. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in (0,22 micron) di acqua sistema di filtraggio-sterilizzato dal Fondo UNC Zebrafish acquacoltura, i media alternativi di embrioni possono essere utilizzati.

1. Tagliare asciugamani di carta quadrato di misura di circa 1cm ^2.
2. Se misurazione isolato potenziale recettore massa cono, incubare 3-5 larve in acqua sistema con 500 pM (±) -2-Amino-4-fosfonobutirrico acido (APB) per 5 min.
   NOTA: Mentre APB è una miscela racemica di attivo (L) e inattive (R) forme di AP4, è efficace come L-AP4 ed è meno costoso.
3. Anestetizzare 3-5 larve in acqua sistema con 0,02% (w / v) Tricaine fino risponde, circa 1-2 min.
4. Utilizzare una pompa pipetta e pipetta Pasteur per trasferire con attenzione larve individuale su carta assorbente quadrati sotto uno stereoscopio dissezione con illuminazione minima (≤250 lux per <1 min). Controllare la posizione di ogni larva e scegliere un candidato che è dorsale verso l'alto con un occhio non occluse.
   1. Per le registrazioni estese (> 30 min), mantenere la larva umido dal vetro il corpo fino a, ma non compresa la testa con 3% metilcellulosa con un pennello fine di peli di cammello.
5. Utilizzando pinze, trasferire il tovagliolo di carta piae con la larva alla spugna umida PVA.
   1. Per le registrazioni estese (> 30 min), applicare un flusso continuo di saturo d'acqua 100% O ₂ gas sopra la larva facendo gorgogliare il gas attraverso una pietra porosa in un pallone braccio laterale contenente acqua distillata. Posizionare il tubo uscita dal braccio laterale pallone che convoglia l'ossigeno umidificato vicino alla testa del larva.
      NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo sarà prolungare la vita dei pesci ^16.
6. Sotto illuminazione minima, utilizzare il micromanipolatore e fotocamera per posizionare la punta microelettrodo a metà tra il nasale e le estremità caudale dell'occhio e premere delicatamente sul limite dorsale della cornea.
   NOTA: smarrimento della punta dell'elettrodo alle zone distali lontano della cornea può provocare ERG forme d'onda di polarità invertita.
7. Lasciare larva di dark-adattamento per 5-10 min.
8. Registra le risposte di prova in flash per luce fornita da una sorgente luminosa a LED o stimolatore ottico utilizzando il Available stimolazione e registrazione attrezzature. Regolare i parametri del protocollo come l'intensità del flash, lunghezza flash, il colore del flash, l'intensità e il colore di sfondo e filtro impostazioni per adattarsi l'esperimento.
9. Al termine con l'esperimento, eutanasia larve secondo le linee guida AVMA / IACUC.

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Risultati

Tipicamente, ERG sono registrati da larve di zebrafish a 5 dpf, dal momento che un certo numero di studi hanno pubblicato le registrazioni ERG in questa fase ^{9, 16,20.} Risposte larvali sono stati misurati in condizioni di oscurità adattato senza retroilluminazione utilizzando uno stimolo 20 msec di luce LED bianca. Abbiamo utilizzato un sistema di ERG disponibile in commercio costituito da uno stimolatore luce Ganzfeld e computer di controller / registratore. Lo stimolatore utilizza un sistema di modulazione...

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Discussione

In questo protocollo una procedura semplice per ERG registrazioni di zebrafish larvale è dettagliata. Questa procedura consente una analisi rapida e completa di function.There visiva sono diversi passaggi critici della procedura che dovrebbe essere tenuto in considerazione. Le larve zebrafish deve essere in buona salute prima dell'esperimento per evitare la morte durante i potenziali trattamenti farmacologici e garantire il sostentamento prolungata durante le registrazioni ERG. Inoltre, è importante che le larve u...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard