Die Doppel-H Maze: A Robust Verhaltenstest für Lernen und Gedächtnis in Nagetiere

Zusammenfassung

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

Zusammenfassung

Raumwahrnehmung Forschung bei Nagern verwendet typischerweise die Verwendung von Labyrinth Aufgaben, deren Attribute variieren von einem Labyrinth zum nächsten. Diese Aufgaben sind je nach ihren Verhaltensflexibilität und erforderliche Speicherdauer, die Anzahl der Ziele und Wege, und auch der Gesamtaufgabenkomplexität. Eine verwirrende Funktion in viele dieser Aufgaben ist der Mangel an Kontrolle über die von den Nagetieren eingesetzt werden, um das Ziel, zum Beispiel allozentrischen (deklarative-like) oder egozentrisch (Verfahrens) basierte Strategien zu erreichen Strategie. Die Doppel-H-Labyrinth ist ein neuartiges wasser Flucht Speicher Aufgabe, die dieses Problem behebt, indem es dem Versuchsleiter, die Art der Strategie während der Ausbildung gelernt zu lenken. Das Doppel-H-Labyrinth ist eine transparente Vorrichtung, die aus einem Zentraldurchgang mit drei Armen an beiden Seiten vorstehen, zusammen mit einem Fluchtplattform am Ende eines dieser Arme taucht besteht.

Ratten können mit Hilfe eines allozentrischen Strategie durch Wechseln der st trainiert werdenKunst Position im Labyrinth in unvorhersehbarer Weise (siehe Protokoll 1, § 4.7), wodurch ihnen zu verlangen, um die Position der Plattform auf der Grundlage der verfügbaren allothetic Cues erlernen. Alternativ kann eine egozentrische Lernstrategie (Protokoll 2; §4.8) kann durch Lösen der Ratten von der gleichen Position bei jedem Versuch verwendet werden, bis sie die Verfahrensmuster erforderlich ist, um das Ziel zu erreichen lernen. Diese Aufgabe ist nachgewiesen worden, für die Bildung von stabilen Erinnerungsspuren zu ermöglichen.

Speicher nach der Ausbildungszeit in einer irreführenden Sonde Studie untersucht werden, in dem die Startposition für die Ratten Stellvertreter. Nach einer egozentrischen Lernparadigma, Ratten in der Regel greifen, um eine allozentrischen basiertes Strategiespiel, aber nur, wenn ihre anfängliche Blick auf die außer Labyrinth Cues unterscheidet sich deutlich von ihrer ursprünglichen Position. Diese Aufgabe ist ideal geeignet, um die Auswirkungen von Drogen / Störungen auf allozentrischen / egozentrisch Gedächtnisleistungen sowie die Interaktionen zwischen th erkundenese beiden Speichersystemen.

Einleitung

Bei Tieren wird das Lernen hauptsächlich von den hippocampal- und Striatum-basierte Speichersysteme ^1,2, die eine zentrale Rolle in Bezug auf Platzierung und verfahrens-Speicher spielen bzw. vermittelt. Die Beziehung zwischen diesen beiden Systemen ist komplex, und sie bekannt sind, um miteinander in kooperativer oder Wettbewerbs Manieren ^1,3 interagieren. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass der Einfluss eines dieser Speichersysteme auf das Verhalten der Tiere kann nach dem Fehlen oder die Beschädigung des anderen Systems ^4-7 erhöhen. Beide Systeme sind an den präfrontalen Kortex über den Thalamus verbunden.

Zahlreiche neurologische Störungen und neurodegenerative Erkrankungen können räumliche Kognition bei Menschen, die auf dem Zusammenspiel von prozeduralen und deklarativen Gedächtnisses Systeme stützen sich beeinflussen. Beispiele schließen die Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) ^8-10, Alzheimer-Krankheit (AD) ^11-14 sowieAmyotrophe Lateralsklerose (ALS) ^15. Tiermodelle, die zu diesen Erkrankungen relevant sind, können durch verschiedene Medikamente, die bestimmte Rezeptoren ¹⁶ zu blockieren, sowie durch gezielte Läsionen induziert werden. Wenn diese Tiere mit räumlicher Speicheraufgaben verwendet, kann eine wertvolle Einsicht in die zugrundeliegenden Mechanismen auf diese Störungen, sowie verschiedene Behandlungsoptionen zusammen gewonnen werden.

Es gibt viele verschiedene Typen von räumlichen Gedächtnisaufgaben bei Nagetieren, die gemeinsam sind für bestimmte Aspekte von Lernen und Gedächtnis sowie die Auswirkungen möglicher Behandlungen für verschiedene Erkrankungen ^17,18 beurteilen. Diese Aufgaben können durch die Anzahl der Ziele und Wege, den Grad der Verhaltensflexibilität bei der Lösung der Aufgabe, die Speicherdauer oder Verzögerung, sowie die Wahl der Strategie bei der Lösung der Aufgabe verwendeten unterscheiden. Eine gute Leistung kann auf der Grundlage externer Signale oder Sehenswürdigkeiten, die verwendet werden, um zu orientieren erworben werdendas Tier auf das Ziel (eine allozentrischen oder Platz-Strategie). Alternativ kann ein Nagetier, eine Strategie, die auf körperliche Richtung und Hinweise in Bezug auf die Richtung zu bewegen, in (eine egozentrische oder Verfahrensstrategie), zum Beispiel basiert zu entwickeln, wenn eine Ratte, weiß, dass das Ziel ist, eine Linkskurve, gefolgt von einer Rechtskurve , dann gibt es wenig Bedarf an einem allozentrischen oder Ort Strategie. Maze Aufgaben unterscheiden sich oft von dem Grad der Flexibilität, um das Nagetier in ihrer Lösung angeboten basiert. Zum Beispiel in der Morris Wasser-Labyrinth, eine trockene Version des letzteren (zB ¹⁹⁾ oder der Barnes Labyrinth (zB ^20), gibt es potentiell unendlichen Strecken die Ratte ergreifen können, um das Ziel zu erreichen. In der Morris Wasser-Labyrinth zum Beispiel die Lage des Ziels basierend auf externe Landmarken oder Cues (allozentrischen Strategie) gelernt werden, oder indem Sie einfach schwimmen im Kreis in Richtung Zentrum, bis die Plattform gefunden (egozentrisch Strategie) ^21. Bestimmte Aufgaben haben mehrere Zieleund ein hohes Maß an Flexibilität, wie der kegelVorgangsFeld ²² oder Olton radiale Labyrinth ^23. Am anderen Ende der Skala sind Aufgaben, die in das Ziel zu erreichen, beispielsweise der Stein Labyrinth oder das alternierende Version des T-Labyrinth begrenzte Flexibilität. Diese Aufgaben stellen nur eine richtige Art, das Ziel zu erreichen und die Entstehung von kognitiven Routinen, die hauptsächlich durch das Striatum basierten Verfahrensspeichersystem geregelt sind zu erleichtern.

Das Doppel-H-Labyrinth ist eine neuartige räumliche Speichertesteinrichtung, die entwickelt wurde, um es dem Experimentator, die Art der Strategie, die von Nagetieren in der Lösung dieser Aufgabe ²⁴ gelernt ist direkt. Bestehend aus drei parallelen Armen Lauf durch einen senkrechten zentralen Durchgang geschnitten werden, ist die Doppel-H-Labyrinth ein wasserFlucht Aufgabe, bei Nagetieren lernen, ein Escape-Plattform, die in einer der Positionen Labyrinth eintaucht erreichen. Während des Trainings kann eine Verfahrensstrategie durch die Aufrechterhaltung t entwickelt werdener dieselbe Start- und Ziel Standorten. Alternativ kann ein allozentrischen Strategie durch Wechseln der Startposition in zufälliger Reihenfolge, und erfordern somit die Ratte den Ort des verborgenen Plattform basierend auf Umweltreize zu lernen, wie es in einem Wasserlabyrinth tun hat entwickelt werden. Dies überwindet ein in vielen unterschiedlichen Tasks vorhanden Labyrinth Hindernis in ein Experimentator nur wenig Kontrolle über die Art der Strategie, Nagetieren verwenden anderweitig. Dies ist wichtig, wenn man bedenkt, dass die Wirkungen bestimmter Kognition verstärkende Wirkstoffkandidaten verlassen sich auf die hippokampalen basierten Ortsspeichersystems, wodurch die Entstehung von kognitiven Routinen oder Prozeduren können die Interpretation der Verhaltensbeobachtungen verwechseln, wenn Tiere, zum Beispiel Umschalten von allozentrischen um prozedurale Gedächtnis im Laufe der Ausbildung. In ähnlicher Weise kann es wünschenswert sein, die Auswirkungen von Medikamenten und Behandlungen auf prozedurale Gedächtnis beurteilen zu können, ohne den Einfluss von allozentrischen Ort-basierte Speicher. Schließlich ist diese Vorrichtungkann genutzt werden, um die kooperative oder kompetitive Wechselwirkungen zwischen diesen Speichersystemen, und die Bedingungen für die Nagetiere können von einem System zum anderen wechseln zu studieren.

Protokoll

1. Allgemeines

Dieses Protokoll wird von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universitätsklinik Freiburg (gleiche für Strasbourg) genehmigt. Die Sehschärfe ist für die Leistung in Tests der räumlichen Lernen notwendig. Nagetieren mit eingeschränkter Sichtsysteme sind daher nicht geeignet. Außerdem muss Beleuchtung ausreichend sein, damit die Ratten, die verschiedenen Hinweise auf den umgebenden Wänden sehen. Es ist nützlich, um grundlegende förmigen (Quadrat, Kreis, Dreieck), aber gut kontras Cues (zB schwarz lackierten Cues auf einem weiß-gemalten Hintergrund) zu nutzen. Ebenso schwere motorische Defizite sind Ausschlusskriterien, denn Schwimmen ist für diesen Test und Ertrinken auftreten erforderlich. Schließlich kann hyper ängstlich Nagetieren eine stark vorgespannt, Suchverhalten, die Auswirkungen auf die Leistung anzuzeigen.

2. Vorrichtung einrichten

1. Konstruieren Sie einen Doppel-H-Labyrinth, bestehend aus einem 160 cm zentrale Gasse, die an beiden Enden und in der Mitte geschnitten wirddurch drei 160 cm parallel laufen Arme (siehe Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die zentrale Gasse und ihre senkrechte Arme sind 20 cm breit und werden von 35 cm hohen transparenten Plexiglas Mauern umgeben. Dicke des Plexiglas ist 6 mm für alle Teile.
2. Sichern Sie sich die Wände in Position unter Verwendung von Klebstoff und Schrauben, und wasserdicht durch das Labyrinth mit Silikonfugen an allen Innenwinkel. Diese Verbindungen können leicht ersetzt werden sollten sie ihre Wasserdichtigkeit verlieren. Einen Auffang Auslass am äußersten Ende eines der Eckenschenkel (oder in der Mitte des Labyrinths) zum Entleeren.
3. Legen Sie das Labyrinth auf einem 80 cm hohen Tisch, mit ausreichend Platz um ihn herum für a) zu Fuß durch das Labyrinth, und b) Platzierung von gut kontras Cues. Bestimmen Sie jeden Arm im Labyrinth durch seine Position, das heißt, im Nordwesten (NW), Norden (N), im Nordosten (NE), Südwest (SW), Süden (S) und Südosten (SE).
4. Legen Sie eine Decke montierten Kamera über dem Labyrinth für Post-Test-Analyse des Verhaltens von Tieren, mit manueller oder automatic (Video-Tracking) Methoden (siehe § 5).

3. Allgemeine Bemerkungen

1. Vor der Verwendung, füllen Sie das Labyrinth mit Wasser auf eine ungefähre Höhe von 18 cm (200 L). Dies ist hoch genug, um Ratten vom Berühren der Unterseite des Labyrinths mit den Füßen zu verhindern, aber flach genug, um ein Entweichen zu verhindern.
2. Nach vorbereitende Ausbildung, machen das Wasser undurchsichtig durch Mischen von 250 g Magermilchpulver. Wechseln Sie das Wasser auf einer täglichen Basis, um die Milch-Wasser ranzig zu verhindern. Pflegen Sie die Wassertemperatur zwischen 21 bis 23 ° C, um Anreiz für die Ratten, um das Entweichen-Plattform suchen.
   HINWEIS: Ratten, die mit der Position der Plattform beim Vortraining vertraut geworden ist, wird seine Position zu einer anderen Arm während des Trainings bewegt.
3. Vor der Verwendung eines eintauchen 17 cm hoch, 10 cm Plattformdurchmesser am äußersten Ende eines der Arme Ecke (NE, NW, SE oder SW). Achten Sie darauf, die Höhe zu untergetaucht ist 1 cm unter der Oberfläche der Wasseroberfläche. Trainieren Sie die Ratten zu erreichendie Zielplattform entweder mit einem allozentrischen oder egozentrisch Lernstrategie, die abhängig von der Art des Paradigma (siehe § 4) ist.

4. Basic Training Protokolle

HINWEIS: Die Ratten werden in der Regel mit einer anfänglichen Tag vor dem Training, das sie, sich mit dem Labyrinth vertraut ermöglicht.

1. Für vor dem Training lassen Sie die Ratte von dem Ende von einem der Arme Zentrum (zB S-Arm) und legen Sie die Ziel-Plattform am äußersten Ende eines der Arme Ecke (zB NE), dann geben Sie den Ratten 4 aufeinander folgenden 60 Sekunden Studien, in denen die Zielplattform zu erreichen.
2. Bei Erreichen der Fluchtplattform erlauben die Ratte dort für 15 sec zu warten, damit sie ruhen und deren Umgebung beobachten kann. Unabhängig von der Startposition, immer blockieren die gegenüberliegende Arm mit einem transparenten Falltür, die Einreise verhindert.
   HINWEIS: Während der Pre-Workout, lassen Sie das Wasser transparent, und stellen Sie die Plattform eright, dass er vorsteht 1 cm oberhalb der Oberfläche des Wassers, so dass es sichtbar der Ratte.
3. Verrichtungen des täglichen Training, bestehend aus bis zu 4 aufeinanderfolgenden Durchläufen durch eine 10 sec Spalt mindestens abgetrennt (diskrete Ausbildung, dh in Abständen von mehreren Minuten zwischen den Durchgängen ist eine Alternative).
4. Für die Ausbildung, den Standort der Plattform von seiner Position vor dem Training auf die gewählte Arm (zB NW), und tauchen Sie es an seinem Ende 1 cm unter der Wasseroberfläche. Jetzt machen das Wasser undurchsichtig durch Zugabe von Milchleistung und die folgenden Trainings (Abschnitt 4).
5. Für Ratten, die die Zielplattform nicht erreichen innerhalb von 60 sec, bringt sie in die Ausgangsposition, und sanft führen sie auf die Plattform vom Experimentator.
6. Messen Sie mehrere Variablen während der Trainingssitzungen und Sonde, wie Abstand schwamm, Latenzzeit, um das Tor zu arm / Plattform, Zeit in jedem Arm verbracht, als auch die Anzahl der Anfangs / Wiederholungsfehlern (siehe Abbildung2). Beachten Sie, dass Wartezeiten können durch den Motor schwer beeinflusst werden. Sollte der Fall eintreten, erscheinen Abstand und Fehler als zuverlässiger Variablen in Bezug auf die kognitive Leistung.
7. Allozentrischen Strategy Training:
   1. Tag 1 - Pre-Training:
      1. Sie Milchpulver für diesen Schritt nicht hinzufügen. Zeigen Fluchtplattform vorstehende 1 cm über der Wasseroberfläche in einem festen Standort. Zug Ratten in 4 aufeinander folgenden Studien die Plattform zu erreichen.
   2. Tage 2-5 - Training:
      1. In 250 g Magermilchpulver an das Wasser undurchsichtig zu machen. Bewegen Sie die Plattform auf eine andere Arm (zum Beispiel von NE nach NW) und Wasser hinzufügen, so dass die Plattform 1 cm unter der Wasseroberfläche. Release Ratten entweder von der N- oder S-Arm in unvorhersehbaren Folgen für jede Sitzung, so dass beide Arme sind doppelt so Testbeginn in einer Sitzung verwendet (4 Studien / Tag, zB SNNS, NSNS; siehe Abbildung 3).
   3. Tag 6 - Probe Session:
      1. Entfernen Plattform für die Sonde Studie. Lassen Sie Ratten von einem anderen Arm zu denen während der Ausbildung (zB SW) verwendet wird, und lassen Sie sie für 60 Sekunden zu schwimmen. Siehe Abbildung 4 für repräsentative Schwimmbahnen. Die Analyse der Zeit in der Ziel Arm (ehemaligen Standort der Plattform) verbracht gibt einen Hinweis darüber, ob Ratten mit einem Raumstrategie, eine andere Art von Strategie, eine sequenzielle Kombination verschiedener Strategien (siehe unten), oder eine desorganisierte Suchmuster.
8. Egozentrischen Strategy Training:
   1. Tag 1 - Pre-Training:
      1. Dies ist die gleiche wie in der ersten Stufe allozentrischen Strategie Training (Schritt 4.1). Sie Milchpulver für diesen Schritt nicht hinzufügen. Zeigen Fluchtplattform vorstehende 1 cm über der Wasseroberfläche in einem festen Standort. Zug Ratten in 4 aufeinander folgenden Studien die Plattform zu erreichen.
   2. Tage 2-5 - Training:
      1. 250 g desMagermilchpulver an das Wasser undurchsichtig zu machen. Bewegen Sie die Plattform auf eine andere Arm und Wasser hinzufügen, so dass die Plattform 1 cm unter der Wasseroberfläche. Release Ratten aus der gleichen Start Arm (S oder N; siehe Abbildung 5) für jeden Versuch (4 Studien / Tag).
   3. Tag 6 - Probe Session:
      1. Entfernen Plattform für die Sonde Studie. Ratten werden von einer anderen, von wo sie während des Trainings veröffentlicht wurden Arm freigegeben. Lassen Sie die Ratten, die für 60 Sekunden zu schwimmen. Blockieren Sie die gegenüberliegende Arm mit einem transparenten Falltür.
         HINWEIS: Ändern Sie die oben genannten Ausbildungsstrategien für die nach den Anforderungen des betreffenden Versuchs, zum Beispiel Drug Testing Effekte etc.
9. Trocknen Sie die Ratte mit saugfähige Handtücher nach jeder Sitzung im Wasser.

5. Analyse

1. Führen Sie Messungen der Latenzzeiten, Aus- und sich wiederholenden Fehlern, erste Entscheidungen und Antworttyp manually durch Aufzeichnung diese Variablen aus den Videos aus dem Kopfkamera aufgenommen wurden.
2. Alternativ, falls verfügbar, verwenden im Handel erhältlichen Video-Tracking-Software und so konfiguriert, dass diese Variablen automatisch aufzuzeichnen.
3. Statistische Analyse:
   HINWEIS: Die konkrete Umsetzung der statistischen Analyse ist abhängig von der Studie, die stattfindet.
   1. Führen Sie ein einen, zwei oder Drei-Wege-ANOVA bezüglich der Anfangs / wiederholenden Fehlern, Latenzzeit, um das Tor zu arm / Plattform, und die Zeit in der Ziel Arm verbracht; mit Faktoren, die den Testtag und Behandlungsgruppe (n) enthalten.
   2. Wo nötig, gehen Sie folgendermaßen ANOVAs mit Post-hoc-Newman-Keuls multiplen Vergleiche. Um die Leistung zu vergleichen, verwenden Sie einen Referenzwert (zB die Zeit in der Ziel Arm während einer Sonde Studie vs. die Chance Ebene ausgegeben), und führen Sie t-Test.
   3. Falls erforderlich, verwenden Sie nicht parametrischen Statistik zusätzlich (zB χ², siehe unten) oder statt, wenn die Bedingungen für parametric diejenigen nicht erfüllt sind.

Ergebnisse

Egozentrischen Learning Strategy

Eine Studie wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die gewählte Speicherstrategie bei Ratten Veränderungen basierend auf Veränderungen ihrer Sicht der externen Umweltreize, als er einen egozentrischen-Lernparadigma ^25. Die Ratten wurden über 4 Tage trainiert (4 Studien / Tag), ein Tor zu arm an NE befindet zu erreichen, und wurden anschließend am fünften Tag mit einer irreführenden Sonde Studie, bei der die Start Arm war entweder verschoben ...

Diskussion

Kommentare zu den Studiendesign und Analyse

Seit der Gründung hat sich die Doppel-H-Labyrinth in einer Reihe von Verhaltensexperimente in Ratten, die wurden gemeinsam unter normalen ^24,25 konzipiert, egozentrisch und / oder allozentrischen Reaktionen bei Ratten untersucht und verändert ^26-29 Gehirnzustände verwendet worden. Letztere Studien umfassen Striatum Tiefenhirnstimulation (DBS) ^26. Tiermodellen neurologischer Erkrankungen ^27,28, sowie bilat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats or Mice	Charles River
Towels for drying	University Hospital		1 / animal
Water			~200 L / day
Skim milk powder	Grocery store		250 g / 200 L water
Garden Hose	Hardware store
Drying rack for towels	Hardware store
Kinect camera	Kinect
PC computer	any
[header]
Double H Maze, (plexiglass) (Custom-Built)
External lateral walls, 1600 × 350 × 6 mm			2
Internal lateral walls, 706 × 350 × 6 mm			8
Central corridor panels, 500 × 350 × 6 mm			4
Arm extremities, 188 × 350 × 6 mm			6
Guillotine doors, 187 × 350 × 6 mm			3
Extremity covers, 200 × 250 mm			6
Crossbars, 200 × 40 mm			6
[header]
Double-H Maze Platform (to be ballasted) (Custom-Built)
Metal platform, 100 mm diameter × 150 mm			2
Platform cover, 100 mm diameter × 6 mm			2