O Double-H labirinto: um teste comportamental robusto para Aprendizado e Memória em roedores

Resumo

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

Resumo

Investigação cognição espacial em roedores tipicamente emprega o uso de tarefas de labirinto, cujos atributos variar de um labirinto para o próximo. Estas tarefas variar de acordo com a sua flexibilidade comportamental e a duração da memória necessária, o número de objectivos e caminhos, e também a complexidade global tarefa. Uma característica confusão em muitas destas tarefas é a falta de controle sobre a estratégia utilizada pelos roedores para alcançar a meta, por exemplo alocêntrica (processuais) estratégias, (declarativas-like) ou egocêntricos base. O labirinto duplo-H é uma tarefa de memória de água-escape romance que aborda esta questão, ao permitir que o experimentador para direcionar o tipo de estratégia aprendidas durante o período de treinamento. O labirinto duplo-H é um dispositivo transparente, que é constituída por um corredor central com três braços salientes em ambos os lados, junto com uma plataforma de fuga submersa na extremidade de um destes braços.

Os ratos podem ser treinados usando uma estratégia alocêntrica alternando a stposição arte no labirinto de forma imprevisível (ver protocolo 1; §4.7), exigindo-lhes, assim, aprender a localização da plataforma com base nas sugestões allothetic disponíveis. Como alternativa, uma estratégia de aprendizagem egocêntrico (protocolo 2; §4.8) pode ser empregado por liberando os ratos de uma mesma posição durante cada tentativa, até que aprendam o padrão processual necessária para alcançar a meta. Esta tarefa tem sido provado para permitir a formação de traços de memória estáveis.

A memória pode ser sondado após o período de formação de um ensaio de sonda enganadora, uma vez que a posição de partida para a suplentes ratos. Na sequência de um paradigma de aprendizagem egocêntrico, os ratos normalmente recorrer a uma estratégia baseada em alocêntrica, mas apenas quando o seu ponto de vista inicial sobre os elementos extra-labirinto difere marcadamente de sua posição original. Esta tarefa é ideal para explorar os efeitos de drogas / perturbações no alocêntrica performance / memória egocêntrico, bem como as interações entre these dois sistemas de memória.

Introdução

Em animais, a aprendizagem é principalmente mediado pelos sistemas de memória hippocampal- e baseada no corpo estriado de ^1,2, que desempenham papéis centrais em matéria de colocação e processual memória, respectivamente. A relação entre estes dois sistemas é complexa, e que são conhecidas por interagir uns com os outros em modos cooperativos ou competitivos ^1,3. Além disso, estudos têm mostrado que a influência de qualquer um destes sistemas de memória sobre o comportamento animal pode aumentar após a ausência de danos ou de outro sistema de ^4-7. Ambos os sistemas estão ligados para o córtex pré-frontal através do tálamo.

Inúmeras doenças neurológicas e doenças neurodegenerativas podem afetar a cognição espacial em seres humanos, que contam com a interação entre sistemas de memória processuais e declarativa. Os exemplos incluem a doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD) ^8-10, a doença de Alzheimer (AD) ^11-14, bem comoA esclerose lateral amiotrófica (ELA) ^15. Os modelos animais, que são relevantes para esses distúrbios podem ser induzidas através de vários tratamentos com drogas que bloqueiam determinados receptores ^16, bem como através de lesões-alvo. Quando estes animais são usados ​​com tarefas de memória espacial, um conhecimento valioso pode ser adquirida sobre os mecanismos subjacentes a estas desordens relacionadas, bem como para várias opções de tratamento.

Existem muitos tipos diferentes de funções de memória espacial em roedores, que colectivamente são concebidos para avaliar os aspectos específicos de aprendizagem e de memória, bem como os efeitos de tratamentos potenciais para várias desordens ^17,18. Estas tarefas podem ser distinguidas pelo número de objectivos e caminhos, o grau de flexibilidade comportamental em resolver a tarefa, a duração da memória ou retardo, bem como a escolha da estratégia utilizada na resolução da tarefa. Um bom desempenho pode ser adquirido com base em sugestões externas ou marcos que são utilizados para orientaro animal em direção à meta (uma estratégia alocêntrica ou local). Alternativamente, um roedor podem desenvolver uma estratégia que se baseia na direcção corporal e sinais com relação à direcção para mover uma estratégia em (egocentric ou processual), por exemplo, um rato se sabe que o objectivo é uma curva para a esquerda seguido de uma curva à direita , então há pouca necessidade de uma estratégia alocêntrica ou lugar. Maze tarefas muitas vezes diferem de acordo com o grau de flexibilidade oferecida para o roedor para resolvê-los. Por exemplo, no labirinto aquático de Morris, uma versão seco do último (por exemplo, ¹⁹⁾ ou o labirinto Barnes (por exemplo, ^20), há potencialmente infinitas rotas do rato pode tomar para atingir o objectivo. No labirinto aquático de Morris, por exemplo, a localização da baliza pode ser aprendido com base em pontos de referência ou pistas (estratégia alocêntrica) externo, ou por simplesmente nadar em círculos em direcção ao centro até que a plataforma se encontra (estratégia egocentric) ^21. Certas tarefas têm múltiplos objetivose um elevado grau de flexibilidade, tal como a tarefa de cone e o campo ²² ou radial do labirinto Olton ^23. No outro extremo da escala são tarefas, que oferecem uma flexibilidade limitada em alcançar o objectivo, por exemplo, o labirinto de pedra, ou a versão alternada do labirinto-T. Essas tarefas fornecem apenas uma forma correta de alcançar a meta e facilitar o aparecimento de rotinas cognitivas que são regidos principalmente pelo sistema de memória procedural baseada em estriado.

O labirinto duplo-H é um novo dispositivo de teste de memória espacial, que foi projetado para permitir que o experimentador para direcionar o tipo de estratégia que é aprendido por roedores em resolver a tarefa ^24. Composta de três braços correm paralelas interceptadas por um beco central, perpendicular, o labirinto duplo-H é uma tarefa água-escape em que os roedores aprendem a chegar a uma plataforma de escape que está imerso em um dos locais de labirinto. Durante o treino, uma estratégia processual pode ser desenvolvido através da manutenção tele mesmo iniciar e locais de gol por toda parte. Alternativamente, uma estratégia alocêntrica pode ser desenvolvido através da alternância da localização inicial em uma ordem aleatória, exigindo, portanto, o rato de aprender a localização da plataforma escondida com base em sinais ambientais, uma vez que tem a ver num labirinto de água. Isto supera um obstáculo presente em muitas tarefas de labirinto diferentes, em que o experimentador outro modo tem pouco controlo sobre o tipo de estratégia de utilizar que os roedores. Isso é importante quando se considera que os efeitos de certas drogas candidatos que melhoram a cognição confiar no sistema de lugar-memory-base do hipocampo, assim, o surgimento de rotinas cognitivas e procedimentos pode confundir a interpretação das observações comportamentais quando os animais, por exemplo mudança de alocêntrica a memória de procedimento durante o curso de formação. De modo semelhante, pode ser desejável para avaliar os efeitos de drogas e tratamentos em memória de procedimento, sem a influência da memória de base local alocêntrica. Finalmente, este dispositivopode ser utilizada para estudar as interacções cooperativas ou competitivas entre estes sistemas de memória, e as condições sob as quais os roedores podem mudar de um sistema para outro.

Protocolo

1. Considerações gerais

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animal do Hospital Universitário de Freiburg (mesmo para Estrasburgo). A acuidade visual é necessário para o desempenho em testes de aprendizagem espacial. Roedores com sistemas deficientes visuais não são adequadas. Além disso, a iluminação deve ser suficiente para que os ratos para ver os diferentes sinais localizados nas paredes circundantes. É útil para utilizar sinais básicos em forma (quadrado, círculo, triângulo), mas bem-contrastadas (por exemplo, pistas pintadas de preto em um fundo branco-pintada). Da mesma forma, os déficits motoras graves são critérios de exclusão, porque a natação é necessário para este teste e afogamento pode ocorrer. Finalmente, roedores hiper-ansioso, pode exibir um comportamento de busca altamente tendenciosa, que tem impacto sobre o desempenho.

2. Aparelho Set Up

1. Construir um labirinto duplo-H que consiste em um beco central de 160 cm, que é cortada em ambas as extremidades e no centropor três paralelas executar braços 160 centímetros (veja a Figura 1). Certifique-se de que o corredor central e os seus braços perpendiculares são 20 cm de largura, e estão rodeados por 35 cm de altura paredes de acrílico transparente. Espessura do acrílico é de 6 mm para todas as partes.
2. Fixe as paredes no local usando cola e parafusos, e à prova d'água do labirinto usando juntas de silicone em todos os ângulos internos. Essas articulações podem ser substituídos facilmente eles devem perder a sua impermeabilidade. Coloque uma saída de drenagem na extremidade de um dos braços de canto (ou no meio do labirinto) para esvaziamento.
3. Coloque o labirinto em um 80 cm de altura mesa, com espaço adequado em torno dele para a) uma caminhada em torno do labirinto, e b) a colocação de pistas bem contrastadas. Designar cada braço no labirinto por sua posição, ou seja, a noroeste (NW), norte (N), Nordeste (NE), sudoeste (SW), sul (S) e sudeste (SE).
4. Coloque uma câmera montada no teto acima do labirinto para análise pós-teste do comportamento animal, usando manual ou aut(vídeo-tracking) métodos omatic (ver §5).

3. Observações Gerais

1. Antes de usar, encher o labirinto com água a uma altura aproximada de 18 cm (200 L). Isto é suficientemente elevado para evitar que os ratos toquem no fundo do labirinto com os pés, mas superficial suficiente para impedir a fuga.
2. Depois de pré-formação, tornar o opaco água misturando 250 g de leite em pó desnatado. Troque a água em uma base diária para evitar que a água do leite de se tornar rançoso. Manter a temperatura da água entre 21-23 ° C para fornecer incentivos para os ratos para buscar a plataforma de fuga.
   NOTA: Apenas os ratos tornam-se familiar com a posição da plataforma durante a pré-formação, a sua posição é movido para um braço diferente durante o treino.
3. Antes da utilização, mergulhe uma plataforma diâmetro 17 centímetros de altura, 10 cm de lado da extremidade de um dos braços de canto (NE, NW, SE ou SW). Assegurar a altura a ser submerso é de 1 cm abaixo da superfície da superfície da água. Treinar os ratos para chegara plataforma alvo usando uma estratégia de aprendizagem ou alocêntrica egocentric, que é dependente do tipo de paradigma utilizado (ver § 4).

4. Protocolos de Formação Básica

NOTA: Os ratos são normalmente fornecidos com um dia inicial de pré-formação, que lhes permite se familiarizar com o labirinto.

1. Para pré-formação libertar o rato a partir da extremidade de um dos braços centrais (por exemplo, S braço) e colocar a plataforma meta na extremidade de um dos braços de canto (por exemplo, NE), em seguida, dar os ratos 4 consecutivo 60 seg ensaios em que para alcançar a plataforma de destino.
2. Ao atingir a plataforma de escape, permitir que o rato de esperar lá durante 15 segundos, de modo que eles podem descansar e observar os seus arredores. Independentemente da posição de partida, sempre bloquear o braço oposto com uma porta de guilhotina transparente, o que impede a entrada.
   NOTA: Durante a pré-treinamento, deixe a água transparente, e ajustar a plataforma eleight de tal modo que a mesma sobressai 1 cm acima da superfície da água, tornando assim mais visíveis para o rato.
3. Realizar sessão de treino diária que consiste em até quatro ensaios consecutivos, separados por um intervalo de 10 s, pelo menos, (formação discreta, isto é, com intervalos de vários minutos entre ensaios, é uma alternativa).
4. Para a formação, reposicione a plataforma a partir da sua posição de pré-formação para o braço escolhido (por exemplo, NW), e pode ser mergulhado na sua extremidade um centímetro abaixo da superfície da água. Agora tornar a água opaca pela adição de leite e poder executar o seguinte formação (secção 4).
5. Para os ratos que não atingem a plataforma de destino dentro de 60 segundos, devolvê-las para a posição inicial, e gentilmente orientá-los para a plataforma pelo experimentador.
6. Meça diversas variáveis ​​durante as sessões de treinamento e de sonda, tais como, nadou a distância, latência para o gol braço / plataforma, o tempo gasto em cada braço, bem como o número de erros iniciais / repetitivos (ver Figura2). Tenha em mente que as latências pode ser influenciada por dificuldades motoras. Se for caso disso, a distância e os erros aparecem como variáveis ​​mais fiáveis ​​sobre o desempenho cognitivo.
7. Alocêntrica Estratégia de Formação:
   1. Dia 1 - Pré-Formação:
      1. Não adicione o leite em pó para esta etapa. Coloque plataforma de escape saliente 1 cm acima da superfície da água num local fixo. Trem ratos em 4 ensaios consecutivos para alcançar a plataforma.
   2. Dias 2-5 - Formação:
      1. Adicionar 250 g de leite em pó desnatado para a água para a tornar opaca. Mover a plataforma de um braço diferente (por exemplo, a partir de NE para NW) e adicionar água de modo que a plataforma é de 1 cm abaixo da superfície da água. Datas de ratos a partir de qualquer braço N ou S em sequências imprevisíveis para cada sessão, de modo que ambos os braços são usados ​​duas vezes como início julgamento em uma única sessão (4 ensaios / dia, por exemplo, SNNS, NSNS; veja a Figura 3).
   3. Dia 6 - Sonda Sessão:
      1. Remover plataforma para o julgamento da sonda. Solte ratos a partir de um braço diferente aos utilizados durante o treinamento (por exemplo, SW), e permitir-lhes nadar durante 60 segundos. Consulte a Figura 4 para faixas de natação representativas. Análise do tempo gasto no braço alvo (antiga localização da plataforma) dá uma indicação sobre se ratos utilizar uma estratégia espacial, um outro tipo de estratégia, uma combinação sequencial de estratégias diferentes (ver abaixo), ou um padrão de pesquisa desorganizado.
8. Egocêntrico Formação Estratégia:
   1. Dia 1 - Pré-Formação:
      1. Este é o mesmo como o primeiro passo na formação estratégia alocêntrica (passo 4.1). Não adicione o leite em pó para esta etapa. Coloque plataforma de escape saliente 1 cm acima da superfície da água num local fixo. Trem ratos em 4 ensaios consecutivos para alcançar a plataforma.
   2. Dias 2-5 - Formação:
      1. Adicione 250 g deleite desnatado em pó para a água para a tornar opaca. Mover a plataforma de um braço diferente e adicionar água de modo que a plataforma é de 1 cm abaixo da superfície da água. Ratos liberação do mesmo braço de início (S ou N; veja a Figura 5) para cada ensaio (4 ensaios / dia).
   3. Dia 6 - Sonda Sessão:
      1. Remover plataforma para o julgamento da sonda. Os ratos são liberados a partir de um braço diferente de onde eles foram liberados durante o treinamento. Permitir que os ratos a nadar, durante 60 seg. Bloquear o braço oposto com uma porta de guilhotina transparente.
         NOTA: Modifique as estratégias de formação acima de acordo com as exigências de cada ensaio, por exemplo, testes de efeitos de drogas etc.
9. Seque o rato fora com toalhas absorventes após cada sessão na água.

5. Análise

1. Realizar medições de latência, erros iniciais e repetitivos, primeiras escolhas e tipo de resposta manually gravando essas variáveis ​​dos vídeos feitos a partir da câmara em cima.
2. Alternativamente, se disponível, utilizar software de rastreamento de vídeo disponíveis comercialmente e configurado para gravar essas variáveis ​​automaticamente.
3. Análise Estatística:
   NOTA: A implementação específica de análise estatística depende do estudo, o que está ocorrendo.
   1. Executar um um, dois ou três vias ANOVAs sobre os erros repetitivos / iniciais, a latência para o gol braço / plataforma, e tempo gasto no braço alvo; com factores que incluem o dia do teste, e grupo (s) de tratamento.
   2. Sempre que necessário, siga estes ANOVAs usando post-hoc de Newman-Keuls testes de comparações múltiplas. Para comparar o desempenho, usar um valor de referência (por exemplo, o tempo gasto no braço alvo durante um ensaio de sonda em relação ao nível do acaso), e executar o teste t.
   3. Se necessário, use as estatísticas não paramétricos, além (por exemplo, χ², veja abaixo) ou no lugar quando as condições para PARAMETric queridos não estão preenchidas.

Resultados

Estratégia de Aprendizagem egocêntrico

Um estudo foi realizado para determinar se a estratégia escolhida memória em ratos mudanças com base em alterações da sua perspectiva de estímulos ambientais externos, seguindo um paradigma egocêntrico-learning ^25. Os ratos foram treinados durante 4 dias (4 ensaios / dia) para chegar a um braço meta localizado na NE, e foram subsequentemente testadas no quinto dia utilizando um ensaio de sonda enganadora, uma vez que o braço de iníci...

Discussão

Comentários sobre Projeto e Análise de Estudo

Desde a sua concepção, o labirinto duplo-H tem sido utilizado em uma série de experimentos comportamentais em ratos, que coletivamente foram concebidos para estudar as respostas egocêntricos e / ou alocêntrica em ratos em condições normais e alterados ^{24,25 26-29} estados cerebrais. Os últimos estudos incluem estriatal estimulação cerebral profunda (DBS) ^26, modelos animais de doenças neurológicas ^27,28,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats or Mice	Charles River
Towels for drying	University Hospital		1 / animal
Water			~200 L / day
Skim milk powder	Grocery store		250 g / 200 L water
Garden Hose	Hardware store
Drying rack for towels	Hardware store
Kinect camera	Kinect
PC computer	any
[header]
Double H Maze, (plexiglass) (Custom-Built)
External lateral walls, 1600 × 350 × 6 mm			2
Internal lateral walls, 706 × 350 × 6 mm			8
Central corridor panels, 500 × 350 × 6 mm			4
Arm extremities, 188 × 350 × 6 mm			6
Guillotine doors, 187 × 350 × 6 mm			3
Extremity covers, 200 × 250 mm			6
Crossbars, 200 × 40 mm			6
[header]
Double-H Maze Platform (to be ballasted) (Custom-Built)
Metal platform, 100 mm diameter × 150 mm			2
Platform cover, 100 mm diameter × 6 mm			2