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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist die Detektion der DNA-Oxidation Marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo) durch HPLC-ED, in DNA aus kultivierten Zellen oder tierische Gewebe.

Zusammenfassung

Oxidativer Stress ist mit vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie auch Fremdstoffmetabolismus assoziiert, was zur Oxidation von Biomakromolekülen, einschließlich DNA. Daher ist eine effiziente Detektion von DNA-Oxidation wichtig für eine Vielzahl von Forschungsbereichen, einschließlich der Medizin und Toxikologie. Eine gemeinsame Biomarker oxidativ geschädigten DNA 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo; oft fälschlicherweise bezeichnet als 8-Hydroxy-2'-Deoxyguanosin (8-OH-dGuo oder 8 oxo-dG)). Mehrere Protokolle für 8-oxo-dGuo Messung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ED) sind beschrieben worden. Diese wurden jedoch in erster Linie um gereinigte DNA mit Prooxidantien behandelt angewendet. Darüber hinaus aufgrund methodischer Unterschiede zwischen Labors, vor allem aufgrund der Unterschiede in Analysegeräten, die Annahme von veröffentlichten Verfahren zum Nachweis von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED erfordert eine sorgfältige Optimierung von jedem Labor. EINumfassendes Protokoll, wie einen Optimierungsprozess beschreiben, fehlt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Erfassung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED aus kultivierten Zellen oder tierische Gewebe beschrieben, in DNA. Sie veranschaulicht, wie die DNA-Aufreinigung kann leicht und schnell optimiert, um unerwünschte DNA-Oxidation, die während der Probenvorbereitung erfolgen kann minimiert werden. Dieses Protokoll zeigt, wie zu erkennen 8-oxo-dGuo in kultivierten menschlichen alveolaren Adenokarzinomzellen (dh, A549-Zellen) mit dem Oxidationsmittel KBrO 3 behandelt und aus der Milz von Mäusen, die polycyclische aromatische Kohlenwasserstoff Dibenzo (DEF, p) ausgesetzt Chrysen (DBC, früher bekannt als Dibenzo (a, l) pyren bekannt, DALP). Insgesamt zeigt diese Arbeit, wie ein HPLC-ED-Methodik kann leicht für die Erfassung von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben zu optimieren.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), dessen stationäre Ebenen können während viele pathologische Zustände und xenotoxic Stoffwechsel zu erhöhen, tragen zu einer erhöhten Häufigkeit der oxidative DNA-Schäden. Unter mehreren möglichen Nukleobasen Oxidationsprodukte können oxidative DNA-Schädigung leicht unter Verwendung der stabilen Marker gemessen werden 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo), die eine der oxidierten Formen 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ist das am häufigsten vorkommende DNA-Läsion 2, und deshalb wurde auf größerem Detail als DNA Oxidations Biomarker trotz der Existenz von mehreren DNA-Oxidationsprodukte 3 untersucht. Beim Menschen kann dieser Schaden über Basenexzisionsreparatur von 8-Oxoguanin Glycosylase 1 (hOGG1) 4 repariert werden. Wenn unbe unrepaired können 8-oxo-dGuo zur Bildung von Basenpaar-Substitutionsmutationen (dh G-Trans V) beitragen 4. Wichtig ist, dass 8-oxo-dGuo ein etablierter Marker for DNA-Schaden in Bezug auf die Initiierung und Förderung der Karzinogenese 2. Daher genaue Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist eine nützliche und wünschenswerte Biomarker für oxidativen DNA-Schädigung 5.

Es gibt weit verbreitete Verwirrung in der Literatur über den richtigen Namen für oxidativ beschädigte Formen der 2-Desoxyguanosin und darüber hinaus der richtige Name der Verbindung (en) routinemäßig als Biomarker für oxidative DNA-Schäden 6 gemessen. Die 6,8-Diketo-und 6-Enol, 8-keto tautomeren Formen der 8-oxo-dGuo (in 1 gezeigt), sind die beiden wichtigsten Tautomere in der Literatur diskutiert 5,7. Der 6,8-Diketo-Form ist das Hauptproblem bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4 und ist das bekannteste DNA Oxidationsprodukt 7. Deshalb 8-oxo-dGuo ist nicht 8-Hydroxy-dGuo die am besten geeignete Namen für diese Oxidationsprodukt 6. Es ist auch wichtig zu beachten, dass 2-Desoxyguanosin (dGuo) anstatt nucleobase Guanin (Gua) oder Ribonukleosid Guanosin (Guo) verbunden sind, wird von den meisten Verfahren 6 erfaßt.

Genaue Detektion und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist schwierig aufgrund: i) Schwankungen bei der Verdauung der DNA-Probe, ii) Eine zufällige Oxidation dGuo bis 8-oxo-dGuo, die während der Probenvorbereitung erfolgen kann, und iii) die Notwendigkeit für eine effektive Überprüfung der analytischen HPLC-ED Methode 8. In diesem Protokoll zur Erreichung i) durch das Bereitstellen von Bedingungen, günstig für vollständige DNA-Verdauung und ii) durch die Aufnahme Metallchelatbildner und Chelator-behandelten Lösungen und einer speziellen DNA-Isolierung Reagenz, während iii) nur teilweise durch die Aufnahme von adressierten gerichtet wir positive Kontrollen und somit vorausgesetzt, daß die Methode zum Aufspüren von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben ist. Weitere Bestätigung über den Rahmen dieses Dokuments. Wir sind jedoch zuversichtlich, dass dieses Protokoll wird den Interessenten helfenBenutzer bestimmen, in welchem ​​Ausmaß die sie benötigen, um das Protokoll formal validieren, abhängig von ihren Zwecken. Eine Liste der Schritte für die formale Validierung des Verfahrens erforderlich ist ferner vorgesehen. Während der Entwicklung und Bereitstellung eines Verfahrens zur 8-oxo-dGuo Erkennung, veröffentlicht wurden Methoden überprüft und konsolidiert. Somit beseitigt dieses Verfahren die Notwendigkeit, Informationen aus verschiedenen veröffentlichten Quellen, die oft fehlen wichtige experimentelle Details während sie auch eine schnelle und einfache Methode zur Messung, wenn das Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von 8-oxo-dGuo wurde erfolgreich angenommen sammeln. Diese angepasste Verfahren wurde eingesetzt, um DNA-Proben erfolgreich analysieren aus kultivierten Zellen und murinen Gewebe. Dieses Video Artikel werden andere Gruppen die Schaffung eines wirksamen Verfahrens zur sicheren Erkennung und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED unterstützen.

Protokoll

Stellen Sie sicher, dass alle Tierhaltung, Unterbringung, Handhabung und Experimentieren, um lokale Regeln und Vorschriften einhalten und dass Experimente Protokolle werden vor Antritt der Studie zugelassen. Bei den beschriebenen Versuchen wurden die Tierpflege, Handhabung und Behandlung von der Health Canada Animal Care Committee genehmigt. Siehe "Reagenzien Tabelle" zur Information der Lieferanten.

1. Sammeln von biologischen Proben

  1. Zellen oder Tiergewebe
    1. Wachsen menschlichen alveolaren Adenokarzinom A549 Zellen in F12-K-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
    2. Samenzellen bei etwa 1 Millionen Zellen pro 10 cm-Platte. Für jeden Versuch, mit einem Satz von 12 Platten in total (drei Platten pro biologische Replikation x vier Dosen), um genügend DNA (80 ug) sorgen für enzymatischen Abbau und HPLC-Analyse.
    3. Wenn die Zelldichte größer als ca. wirdimately 70% der Plattenfläche, wird das Medium entfernt und wäscht die Zellen zweimal mit 4 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7,4.
    4. Für kultivierte Tierzellen verwenden KBrO 3 als positive Kontrolle.
      Hinweis: eine positive lineare Beziehung zwischen Konzentration und KBrO 3 8-oxo-dGuo Frequenz wurde in der Literatur 9 gemeldet.
    5. Löse KBrO 3 in PBS. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration in der Zellkulturmediums größer als 1 mm bis zu einem statistisch signifikanten Anstieg der 8-oxo-dGuo relativ zu unbelichteten Zellen zu erhalten. Füge das gleiche Konzentration an KBrO3 zu jeder Platte in der Reihe (beispielsweise 12 10 cm-Platten).
    6. Die Platten für 3 Stunden bei 37 ° C. Entfernen Sie die Medien und einmal mit PBS waschen.
    7. 1 ml Trypsin-Lösung (Stammkonzentration von 2,5 g / ml) und Inkubation für 3 min bei 37 ° C.
    8. Mit 4 ml PBS waschen, sammeln Sie die Zellen, die aus jeweils in einem einzigen 50 ml konischen polystyr eingestelltene-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
    9. Entfernen PBS und speichert das Zellpellet bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse. Künstliche DNA-Oxidation kann durch nukleare Isolation minimiert werden, wie an anderer Stelle 10 beschrieben.
  2. Tierischen Geweben
    1. Dosis Tiere nach Bedarf. Aus diesem Protokoll Erwachsenen (9 Wochen alt) zu behandeln männliche Muta Maus durch orale Gabe täglich für drei aufeinanderfolgende Tage mit 20 mg DBC / kg Körpergewicht pro Tag in Olivenöl aufgelöst.
      HINWEIS: Diese transgene Tier Häfen entwickelt λ-Bakteriophagen und Mutation Reportergens lacZ aus E. coli 11 wird für transgene Nager Mutationsassays 12 verwendet.
    2. Zuführen Tier Nekropsie zB die Mäuse anästhesiert kann mit Isofluran und dann über zervikale Dislokation gefolgt von Brusthöhle Öffnung euthanasiert. Unmittelbar Blitzeis Gewebe in flüssigem Stickstoff. Speicher Geweben bei -80 ° C bis zur Analyse.
      Anmerkung: Der Zeitpunkt der Euthanasie nach der Behandlung kann eine weitere wichtige Variable sein (zum Beispiel war DNA Oxidation maximal bei 72 h nach der Lärmbelastung im Gehirn der Ratte und der Leber 13).

2. DNA-Extraktion, Fällung und Waschen (für Gewebe gehen Sie direkt zu 2.2)

  1. Homogenisieren der gesammelten Zellen in einem 50 ml konischen Polystyrolzentrifugenröhrchen mit 1 ml DNS-Isolierungsmittel, wie DNAzol. Verwenden Sie einen 1.000 ul Pipettenspitze, um die Zellpellet verteilen, bis die Lösung homogen ist. Übertragen Homogenat in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren auf Eis für 10-20 min. Fahren Sie mit 2.3.
  2. Homogenisieren 15-20 mg Gewebe in einem 1 ml Hand Teflon Glashomogenisator, enthaltend 500 & mgr; l DNA-Trennmittel enthält. Gently heben und senken Homogenisator für ca. 1 min; weicher Gewebe weniger Zeit erforderlich. Schonende Behandlung sorgt für weniger Scherung der DNA. Lagern Sie das Homogenisat auf Eis für etwa 10-20 min.
  3. Kügelchendas Homogenat durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 × g und 4 ° C in einem 1,5 ml konischen Zentrifugenröhrchen.
  4. Der resultierende Überstand vorsichtig in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Aufmerksamkeit zahlen, um zu vermeiden, Kontakt mit dem Pellet zu übertragen.
  5. Auszufällen DNA aus dem Homogenat durch Hinzufügen von 0,5 ml 100% EtOH pro 1 ml Homogenat. Kehren Rohre 10 Mal zu isolieren Reagenz zu gewährleisten und EtOH sind ausreichend gemischt.
  6. An diesem Punkt ist die DNA Präzipitat viskose, Spule es auf eine Kunststoffpipettenspitze (beispielsweise mit einem maximalen Fassungsvermögen von 200 & mgr; l) und dann in ein neues 1,5 ml konischen Zentrifugenröhrchen überführt.
    HINWEIS: Kurze Zentrifugation verwendet werden, um jegliches verbleibende Lysat aus der isolierten DNA zu entfernen.
    (DNA Wash und Solubilisierung)
  7. 1 ml 75% EtOH zu der isolierten DNA. Hängen Sie die DNA-Pellet gründlich durch Umdrehen der Röhrchen 10 Mal.
  8. Dekantieren Sie vorsichtig das Ethanol aus der Tube. Stellen Sie sicher, dass the DNA pelle klebt an der Seite des Rohres. Die Rohre vertikal zu speichern für 1-2 min und mit einer Pipette, um überschüssiges EtOH vom Boden des Rohrs zu entfernen.
  9. Wiederholen Sie die DNA waschen einmal, und entweder speichern Sie die Probe in EtOH bei -20 ° C (mehrere Monate stabil) oder unmittelbar um die Verdauung zu gehen.
  10. Aufzulösen DNA in Verdauungspuffer (nachstehend beschrieben) und dann unter Verwendung von Standard quantifizieren spektroskopische Methoden (dh die Absorption bei 260 nm unter Verwendung von ND-Spektralphotometer).

3. enzymatische Verdauung

  1. Vorbereiten "Verdauungspuffer" durch Kombination und geeignete Mengen (je nach der Anzahl der Abtastwerte zur Verdauung) von 50 mM monobasisches Natriumphosphat (enthaltend 2,0 mM KCl, 1,0 mM Desferal (DFO) und 200 mM MgCl 2) mit 50 mM dibasisches Natriumphosphat (auch enthaltend 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO und 200 mM MgCl 2). Jede Probe erfordert 4.0 ul ein- und 17,0 ul dibasische Phosphatlösung.
  2. Entfernen Sie alle verbleibenden EtOH aus dem Boden der Röhre und der Luft trocknen Proben für ca. 5 min. Stellen Sie sicher, dass die DNA nicht vollständig austrocknen.
  3. Man löst 80 ug extrahierten DNA in 21,0 ul des Verdauungspuffer, fügen Sie 1 Einheit DNase I in 2,0 ul der Verdauung Puffer gelöst.
  4. Wirbel leicht um ein gründliches Mischen zu erreichen und Inkubation für 1,5 h bei 37 ° C.
  5. Am Ende der Inkubationszeit hinzuzufügen 216,4 ul 50 mM dibasisches Natriumphosphat-Lösung, enthaltend 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO und 200 mM MgCl 2.
  6. Bereiten Sie "Verdauungspuffer-2" durch die Kombination von einem Volumen Verdauungspuffer mit neun Bänden von dibasischen, 50 mM Na-Phosphat (mit 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO und 200 mM MgCl 2).
  7. Hinzuzufügen 0,025 Einheiten der Phosphodiesterase (PDE) I-Enzym in 16,3 ul Verdauungspuffer-2. Pipette nach oben und unten für einige Sekunden, dann Wirbel leicht, um eine gute Durchmischung zu erreichen und Inkubation für 1,5 Stunden bei 37 ° C.
  8. Hinzufügen 00,4 Einheiten alkalischer Phosphatase (AP) in 8,0 & mgr; l Verdauungspuffer-2. Pipette nach oben und unten für einige Sekunden, dann Wirbel leicht, um eine gute Durchmischung zu erreichen und Inkubation für 1,5 Stunden bei 37 ° C. In 33,0 ul HPLC MeOH.
  9. Laufen verdauten DNA-Proben mittels HPLC, wie unten beschrieben oder bei -80 ° C beschrieben ist, direkt bis zum Gebrauch, um die Oxidation zu minimieren. HINWEIS: Die 1,5-Stunden-Schritten Verdauung hier vorgeschlagen werden auf solchen Abständen anhand anderer Stelle vorgeschlagen, 9 und auf den Erkenntnissen, dass ähnliche Protokolle zu erreichen vollständige DNA-Verdauung 9. Daher wurde angenommen, dass der einzige begrenzende Faktor zu erreichen vollständige Verdauung war Zeit und Enzymhemmung und Probeninhomogenität vernachlässigbar waren.

4. HPLC Run: Herstellung der mobilen Phase, Besetzung Installations- und Wartungs

  1. Verwenden Reinstwasser, um alle Pufferlösungen vorzubereiten und mit hoher Klebkraft Harz (zB Chelex 100 behandelt: Styrol divinylbenzene Copolymer mit Iminodiacetat Ionen, die Chelat-Übergangsmetalle mit hoher Affinität) an Metallkontamination und DNA-Oxidation während der Probenvorbereitung zu minimieren.
  2. Vorzubereiten 250 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,2. Verwenden ein Verhältnis von 1: 3,6957 zweibasisches Natriumphosphat (FW = 177,99 g / mol) Natriumphosphat (FW = 119,98 g / mol) monobasischen.
    Beispiel: Daher ist für einen 3 l-Stammlösung kombinieren 70,81 g ein- und 28,43 g von zweibasigen Pulver, Wasser hinzufügen bis zu beispielsweise 2,8 L und überprüfen, dass der pH-Wert der Lösung beträgt 6,2. Der pH-Wert mit 250 mM Mono oder Natriummonohydrogenphosphat-Lösungen, durch konzentrierte Säuren oder Basen getrennt und nicht vorbereitet. Hinzuzufügen 2,24 g KCl in einer Konzentration von 10 mM KCl erhalten.
  3. Vorbereitung der mobilen Phase in drei Flaschen, mindestens 1 L jeweils enthalten: Lösungsmittel B - HPLC-grade Methanol, Lösungsmittel - B hochreinem Wasser und Lösungsmittel C - Phosphatpuffer von Schritt 4.2. Legen HPLC mobilen Phase Zufuhrschlauch in die Flaschen; remaining Röhren müssen auch in einer der Flaschen (zB Lösung C) getaucht und grundiert, selbst wenn sie nicht für das Mischen erforderlich.
  4. Während des Laufs, mischen Sie die mobile Phase-Lösungen als 6% Lösemittel A, 74% Lösungsmittel B und 20% Lösungsmittel C bis zur endgültigen Lösung von 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 6,2) mit 2,0 mM KCl, und 6% MeOH zu erreichen.
  5. Nehmen Sie die Elektrode aus der elektrochemischen Detektor, zerlegen und reinigen Referenz und Arbeitselektroden mit den Elektrodenreinigungslösungen und Polierscheiben vom Hersteller empfohlen. Spülen Sie die gereinigten Oberflächen mit hochreinem Wasser, wischen Sie das Wasser sanft ab und sorgen für die Detektor trocken, das System ist.
  6. Montieren Sie den Detektor und eine Verbindung der mobilen Phase Einlass zu der Elektrode. Schalten Sie die Strömung und damit der mobilen Phase zu füllen die Elektrode vor dem Anbringen der Steckdose mobilen Phase Rohr. Installieren Sie eine neue Spalte vor dem Start-Optimierung. Stellen Sie sicher, dass der Einbau in die richtige Richtung und follows Empfehlungen ist alles Herstellers.
  7. Schalten Sie die HLPC Instrumentierung weit vor (beispielsweise 1 Stunde) der Probenanalyse, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen und Grundrauschen zu reduzieren. Siehe Tabelle 1 für vorgeschlagenen Einstellungen; der Gegendruck Grenzwert sollte bis 3000 psi eingestellt werden, um Beschädigungen zu vermeiden Spalte. Schalten Sie den Entgaser. Fahren Sie mit der Grundierung der Pumpen und die Einrichtung Lösungsmittelgradienten.
  8. Chemische Primzahl die Pumpen nach den Anweisungen des Herstellers. Dies tun, um die Linien zu benetzen, wenn eine mobile Phase ersetzt wurde, oder der Schlauch Einlaß der Luft ausgesetzt ist.
  9. Suchen Sie die Priming-Disc und legen Sie eine 10-15 ml Kunststoffspritze gibt. Stellen Sie sicher, die Spritze vollständig vor dem Öffnen der Zeile eingefügt. So öffnen Sie die Zeilen schalten Sie einfach die Scheibe gegen den Uhrzeigersinn für eine Umdrehung.
  10. Starten Sie den prime mit dem entsprechenden HPLC Schnittstellenauswahl. Ziehen Sie die Spritze, um Flüssigkeit in die Linien zu zeichnen. Sobald Flüssigkeit fließt, ist die wichtigste vollständig; Lassen Sie das Programmschliessen Sie die Sicht. Wiederholung für alle Linien (in der Regel vier, abhängig von dem Gerät).
  11. Alternativ nassen prime, wenn die Linien sind bereits aus einer früheren Trocken prime benetzt (siehe unten).
    HINWEIS: Wenn eine große Menge an Zeit zwischen den Anwendungen (zB 2 Wochen) abgelaufen ist, wird ein trockener prime empfohlen.
  12. Ändern der Zusammensetzung der Lösungsmittel mit mobiler Phase Komponenten miteinander unter Verwendung des HPLC-Benutzeroberfläche 25%. Von der Schnittstelle, wählen Sie die Option "Direct Function", und wählen Sie "Wet Prime" option. Dies wird prime alle Linien gleichzeitig.
  13. Stellen Sie sicher, alle die Luft aus dem System durch die Beobachtung der nassen Hauptleitung, da sie die Abfallbehälter gelangt. Nach einem guten prime, sicherzustellen, dass keine Blasen in der Linie nach links. Wenn Blasen bestehen, wiederholen Grundierung.
  14. Sobald die Pumpe gefüllt ist, beginnen Bewegen der HPLC mobilen Phase. Verwenden die HPLC-Schnittstelle, um die Zusammensetzung der mobilen Phase bis 6% Methanol (Lösungsmittel A) und 94% manuell ändernWasser (Lösungsmittel B), und wählen Sie eine Durchflussrate von 0,9 ml / min. Sie 5 min, um jede Methanol aus dem Säulenreinigungsschritt zu löschen.
  15. Nach 5 min verändern die Zusammensetzung bis 6% Methanol (Lösungsmittel A), 74% Wasser (Lösungsmittel B), 20% Puffer (Lösungsmittel C), erhöhen die Durchflussrate auf 1,0 ml / min. Stellen Sie andere Parameter, wie in Tabelle 1 zusammengefasst, und setzen Sie die Rückdruckgrenze auf 3000 psi bis Spalte Schäden zu vermeiden.
    HINWEIS: Mögliche Probleme mit HPLC-Setup sind Grundlinie treiben, Split peak und verminderte Signalintensität. Diese können in der Regel durch die Reinigung der Spalte nach jedem Gebrauch, häufige Reinigung der Elektrode, und sicherzustellen, dass die Pufferlösungen frei von Verunreinigungen sind überwunden werden (beispielsweise Partikel oder mikrobielle Wachstum).
  16. Führen Sie die mobile Phase für etwa 1-1,5 h, um eine stabile Grundliniensignal zu erzielen.
  17. Mit Hilfe des Instruments Software-Schnittstelle, wählen Sie Parameter wie in Tabelle 1 angegeben und auf 15 Minuten Laufzeit. Spritzen Sie das sample. Verwenden Sie erhöhte Laufzeiten für komplexe Stichproben (bestimmen diese empirisch durch Beobachtung der Gegenwart oder Abwesenheit von Gipfeln jenseits der 15-Minuten-Intervall).
    HINWEIS: Instrument-Software ermöglicht die Programmierung der Probenlaufbedingungen und Setup für Autosampler.
  18. Nachdem die Durchläufe abgeschlossen sind, schalten Sie die Detektorzelle mit Hilfe der Schnittstelle des Detektors. Es ist wichtig, den Empfehlungen des Herstellers in Bezug auf Ausschalten des Detektors, wie unsachgemäße Behandlung folgen und Abfahren kann das Gerät beschädigen. Schalten Sie nicht die Zelle durch Umschalten der Rückseite des Detektors, da dies das Gerät beschädigen.
  19. Die Zusammensetzung der mobilen Phase bis 6% Methanol und 94% Wasser manuell ändern. Führen Sie für 5 min.
  20. Die Durchflussrate manuell zu reduzieren, um 0,7 ml / min, sofort zu ändern, die Zusammensetzung zu 50% MeOH und 50% Wasser. Laufen über mindestens 20 min. Wenn Sie diesen Schritt für die empfohlene Zeit kann zu Schäden an der Säule und den Detektor führen laufen. Schalten Sie den Fluss, eind schalten Sie dann den Entgaser.

5. Herstellung von Standards

  1. Vorbereitung der mobilen Phase Puffer wie in den Schritten 4,1-4,3 oben beschrieben. Es ist wichtig, die HPLC mobilen Phase zur Herstellung von Standards zu verwenden, um Peaks aus Mischen unterschiedlicher Lösungen nach der Probeninjektion zu vermeiden.
  2. Verdünnte diese Lösung ein in fünf mit hochreinem Wasser vor der Verwendung, und die endgültige Lösung darf 6% MeOH enthält.
  3. dGuo Norm
    Hinweis: Hochoxidationspotential für dGuo Erkennung erforderlich ist, kann das Risiko der Messung störenden elektroaktiven Verbindungen erhöhen. Dies kann durch die überprüft werden, beispielsweise eine Standardkurve von UV Detektion dGuo bei 260 nm und Vergleich mit der Standardkurve mit EC Detektion erstellt. Wenn beide gut auszurichten (zB Ergänzungs Abbildung 1) und die Probenmatrix Effekte berücksichtigt, kann man mit dGuo Detektion durch UV bei 260 nm gehen, anstatt EC Detektion.
    1. Messen 1,0 mg dGuo in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1,0 ml HPLC MeOH.
    2. Vortex mit hoher Geschwindigkeit, bis dGuo vollständig auflöst. Dies ist die primäre Lager; bei -20 ° C für mehrere Wochen.
    3. Um die Sekundär dGuo Lager (0,5 mm) zu erstellen, zu verdünnen 143 ul primären dGuo Lager in 857 & mgr; l HPLC mobilen Phase. Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch und bereiten täglich frisch.
    4. Stellen Sie weitere Verdünnungen, um eine Standardkurve zu erstellen (zB Tabelle 2). Shop-Lösungen auf Eis und bereiten täglich frisch. Führen Standards in Reihe mit experimentellen Proben.
    5. Vor ausführen, variieren die Detektorspannung mit der höchsten Konzentration der Stamm, um eine optimale Spannung zu finden.
  4. 8-oxo-Norm dGuo
    1. Messen 1,0 mg 8-oxo-dGuo in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 0,1 ml HPLC MeOH. Vortex auf hoher Geschwindigkeit, bis 8-oxo-dGuo vollständig auflöst. Dies ist die primäre Lager von 8-oxo-dGuo. Lagerung bei -20 ° C für sevrere Wochen.
    2. In einem separaten Röhrchen, kombinieren 2,9 ul primären Lager und 997,1 ul HPLC mobilen Phase Puffer, Wirbel. Dies ist die sekundäre Lager (10.000 Nm).
    3. Um eine funktionierende Lösung für die Standardkurve (250 nM) zu erstellen, kombinieren 24,4 ul sekundären Lager und 975,6 ul mobiler Phase Puffer.
    4. Führen Sie weitere Verdünnungen, die erforderlich ist, um eine Standardkurve zu erstellen Lösungen (zB Tabelle 3). Shop-Lösungen auf Eis und bereiten täglich frisch. Führen Standards mit den experimentellen Proben.
  5. Quantifizierung
    1. Integrieren Sie die Fläche unter der Kurve für beide 8-oxo-dGuo und dGuo unter Verwendung von Standard-Software (als Teil der HPLC-Computer-Schnittstelle, siehe Zusatz 2A).
    2. Konstruieren Standardkurve (bekannte Konzentration jedes Analyten vs. Fläche unter der Kurve (Ergänzende 2B). Unter Verwendung der Gleichung der Standardkurve, wird das Verhältnis für 8-oxo-dGuo / dGuo für jede Probe.

6. Agarose-Gel-Elektrophorese

HINWEIS: Die Agarosegelelektrophorese ausgeführt, um die Vollständigkeit der DNA Verdau verifizieren.

  1. Bereiten 50x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE), die durch Auflösen von 242 g Tris-Base (FW = 121,14) in 750 ml Reinstwasser. In 57,1 ml Eisessig und 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA wird vollständig zu lösen, wenn der pH der Lösung auf 8,0 mit zB NaOH) und fügen Reinstwasser auf ein Endvolumen von 1 L. Lagern bei RT, Verdünnen dieser Lösung 50x vor der Verwendung.
  2. Abwiegen 1 g Agarose und löst ihn in 100 ml 1x TAE-Puffer, Heizung in der Mikrowelle für 1-2 min. Schutzbrille und Schutzausrüstung, um den Kontakt mit kochendem Agarose zu vermeiden.
  3. Die Lösung wird nach unten, bis ca. 50 ° C werden 5 & mgr; l Ethidiumbromid (Achtung: mutagen) und gießen Sie sie in das Agarose-Gel Laufgerät. Setzen Sie den Kamm.
  4. Warten, bis die Lösung erstarrt gießen TAE-Puffer über das Gel und Laden der Proben (Volumen hängt von der Kammgröße, typischerweise 10-20 ul DNA-Probe geladen, gemischt mit 6x ausgeführt Farbstoff sichtbar zu machen und zu erleichtern Beladung).
  5. Die Elektrophorese, bis der Farbstoff wandert etwa 2/3 der Länge des Gels (zB 45 min bei 150 V). Visualisieren DNA-Banden unter dem UV-Licht.

Ergebnisse

dGuo wurde beobachtet, dass eine Retentionszeit von 4,7 min wohin 8-oxo-dGuo hatte eine Retentionszeit von etwa 6,4 min (2A und B). Es gibt etwa 1000-facher Unterschied in den Peakhöhen der beiden Analyten, wie in 2C zu sehen. Voltammogramme für 8-oxo-dGuo und dGuo wurden durch Ausführen von Standards bei einer Arbeitsspannung im Bereich von 0,2 bis 1,1 V. erhaltene optimale Arbeitspotential für 8-oxo-dGuo bestimmt wurde auf +0,5 V und +0,9 betragen V für dGuo

Diskussion

Obwohl 8-oxo-dGuo wurde als nützlicher Biomarker von DNA-Oxidation berichtet, kann seine zuverlässige Quantifizierung eine Herausforderung darstellen. Obwohl mehrere veröffentlichte Verfahren existieren, gibt es einen Bedarf für eine umfassende, beschreibende Übersicht der Protokoll den Forschern ermöglichen, das Verfahren in ihren Laboratorien bereitstellen. Hier präsentieren wir Ihnen einen detaillierten Überblick über eine HPLC-basiertes Protokoll, das neue Benutzer erlauben, ein wirksames Verfahren für 8-o...

Offenlegungen

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) und der kanadischen Regulierungsstrategie für die Biotechnologie (CRSB) gefördert. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphataseSigma-AldrichP5931From E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylateSigma-AldrichD9533
dGuo standardSigma-AldrichD7145
Dibasic sodium phosphateSigma-AldrichS9390
DNA from salmon spermSigma-AldrichD1626Sodium salt
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, from bovine pancreas
DNAzolInvitrogen10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE4884The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K mediaATCC30-2004
Foetal bovine serumATCC30-2020
Guard columnChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 0204GCProtects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Monobasic sodium phosphateSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate buffered salineInvitrogen15190-250
Phosphodiesterase I enzyme Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizerThomas Scientific7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectivelyVolume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silicaChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT

Referenzen

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