JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является определение степени окисления ДНК-маркера, 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo) с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных.

Аннотация

Оксидативный стресс, связанный с многих физиологических и патологических процессов, а также метаболизма ксенобиотиков, приводит к окислению биомакромолекул, в том числе ДНК. Таким образом, эффективность обнаружения окисления ДНК важно для различных исследовательских дисциплин, в том числе медицины и токсикологии. Общий биомаркер окислительного поврежденной ДНК является 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo; часто ошибочно называют 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OH-dGuo или 8 оксо-DG)). Несколько протоколов для 8-оксо-dGuo измерения методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с электрохимическим детектированием (ВЭЖХ-ЭД) были описаны. Тем не менее, они были в основном применяется для очищенной ДНК, обработанной прооксидантов. Кроме того, из-за методологических различий между лабораториями, в основном из-за различий в аналитическом оборудовании, принятие опубликованных методов обнаружения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД требуется тщательная оптимизация по каждой лаборатории.комплексный протокол, описывая такой процесс оптимизации, не хватает. Здесь Подробный протокол описан для обнаружения 8-оксо-dGuo с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных. Это показывает, как подготовка проб ДНК может быть легко и быстро оптимизированы, чтобы свести к минимуму нежелательное окисление ДНК, которые могут возникнуть при подготовке пробы. Этот протокол показывает, как определить 8-оксо-dGuo в культивированных человеческих клеток аденокарциномы альвеолярного (т.е. клетки А549), обработанные с окислителем KBrO 3, и из селезенки мышей, подвергнутых воздействию полициклических ароматических углеводородов дибензо (DEF, р) хризена (DBC, ранее известный как дибензо (, л) пирена, DalP). В целом, эта работа показывает, как методика ВЭЖХ-ЭД может быть легко оптимизирована для обнаружения 8-оксо-dGuo в биологических образцах.

Введение

Активные формы кислорода (АФК), чьи стационарное уровни могут увеличить в течение многих патологических состояний и xenotoxic метаболизма, способствует увеличению частоты окислительного повреждения ДНК. Среди нескольких возможных нуклеотидных продуктов окисления, окислительного повреждения ДНК легко может быть измерена с помощью стабильного маркер 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo), который является одним из окисленных форм 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-оксо-dGuo является наиболее распространенным поражение DNA 2, и, следовательно, был изучен более подробно в качестве биомаркера окисления ДНК, несмотря на существование нескольких продуктов окисления ДНК 3. В людях, это повреждение можно отремонтировать с помощью базовой ремонта вырезания на 8-оксогуанин гликозилазы 1 (hOGG1) 4. Если осталось без ремонта, 8-оксо-dGuo может способствовать формированию базовых мутаций пара-замещение (т.е. е к т трансверсии) 4. Важно отметить, что 8-оксо-dGuo является установленным маркером FOг повреждение ДНК в отношении установления и развития канцерогенеза 2. Таким образом, точное определение количества 8-оксо-dGuo является полезным и желательным биомаркер окислительного повреждения ДНК 5.

Существует распространенное заблуждение в литературе о правильных названий окислительно-поврежденных форм 2-дезоксигуанозина и, кроме того, правильное название соединения (ий) обычно измеряется в качестве биомаркеров окислительного повреждения ДНК 6. В 6,8-дикето и 6-енольные, 8-кето таутомерные формы 8-оксо-dGuo (показано на рисунке 1) являются двумя наиболее видные таутомерам, обсуждаемые в литературе 5,7. Форма 6,8-дикето является наиболее заметной формой при физиологическом рН 7,4, и наиболее заметным продуктом окисления ДНК 7. Таким образом, 8-оксо-dGuo, а не 8-гидрокси-dGuo является наиболее подходящее название для этого продукта окисления 6. Важно также отметить, что 2-дезоксигуанозин (dGuo), а не nucleobаза гуанин (гуа) или рибонуклеозид гуанозин (Го), соответственно, обнаружена в большинстве методов 6.

Точное обнаружение и количественное определение 8-оксо-dGuo является сложной задачей из-за: я) изменчивости в переваривании образца ДНК, II) случайный окисление dGuo 8-оксо-dGuo, которые могут возникнуть во время подготовки образца, и III) необходимость для эффективного проверки результаты анализа методом ВЭЖХ-ЭД 8. В этом протоколе, мы нацелены на достижение I), обеспечивая условия, благоприятные для полного переваривания ДНК и б) путем включения хелатор металла и хелаторных обработанных растворов и специального ДНК-выделении реагента, а III) был только частично решены путем включения Положительные контроли и, таким образом, обеспечивая, что метод способен обнаруживать 8-оксо-dGuo в биологических образцах. Кроме того проверка выходит за рамки данной статьи. Тем не менее, мы уверены, что этот протокол поможет перспективнымпользователи определяют степень, до которой они должны формально подтвердить протокол, в зависимости от их целей. Перечень шагов, необходимых для формального проверки метода обеспечивается дальше. В ходе разработки и развертывания метода для обнаружения 8-оксо-dGuo, опубликованных методов были рассмотрены и консолидированы. Таким образом, этот метод устраняет необходимость сбора информации из нескольких опубликованных источников, которые зачастую не имеют важные экспериментальные детали, а также предоставляет быстрый и простые средства тестирования, если метод обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo успешно принят. Это адаптировать метод был использован для успешного анализа образцов ДНК из культивируемых клеток мышиной и ткани. Это видео статья поможет другим группам в создании эффективного способа для надежного обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД.

протокол

Убедитесь, что все животноводство, жилье, обработки и эксперименты в соответствии с местными нормами и правилами и что экспериментирование протоколы утверждаются до начала каких-либо исследование. Для описанных экспериментов, уход за животными, обработка и лечение были одобрены Комитетом по уходу здравоохранения Канады животного. Смотрите таблицу "Реагенты" для информации поставщиков.

1. Сбор биологических образцов

  1. Клетки или тканями животных
    1. Выращивают альвеолярных клеток А549 аденокарциномы человека в F12-К среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
    2. Семенной клетки примерно в 1 миллион клеток на 10 см пластины. Для каждого эксперимента, использовать набор из 12 пластин в общей сложности (три пластины в одной биологической повторности х четыре дозы), чтобы обеспечить достаточно ДНК (80 мкг) для ферментативного переваривания и анализа ВЭЖХ.
    3. Когда плотность клеток становится больше, чем примерномерно 70% от площади поверхности пластины, удалить носитель и промыть клетки дважды 4 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,4.
    4. Для культивируемых клеток животных, используют KBrO 3 в качестве положительного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: положительный линейный отношения между KBrO 3 концентрации и частоты 8-оксо-dGuo сообщалось в литературе 9.
    5. Растворите KBrO 3 в PBS. Убедитесь, что конечная концентрация в среде для культивирования клеток больше, чем 1 мм, чтобы получить статистически значимое увеличение 8-оксо-dGuo по отношению к не-подвергаются клетки. Добавить ту же концентрацию KBrO 3 к каждой пластине в серии (например, 12 10 см пластинах).
    6. Инкубируйте пластин в течение 3 ч при 37 ° С. Удалить СМИ и мыть один раз PBS.
    7. Добавить 1 мл раствора трипсина (акций концентрации 2,5 г / мл) и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С.
    8. Промыть 4 мл PBS, сбора клеток из каждого набора в единый 50 мл коническую polystyrен центрифужную пробирку, и центрифугируют при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    9. Удалить PBS и хранить осадок клеток при -80 ° С до дальнейшего анализа. Окисление Искусственный ДНК может быть дополнительно уменьшена путем ядерного изоляции, как описано в другом месте 10.
  2. Тканях животных
    1. Доза животных, как требуется. Для этого протокола, взрослые (9-недельного возраста) лечения мужского Muta мышь через желудочный зонд ежедневно в течение трех дней подряд с 20 мг DBC / кг живой массы в растворенном в оливковом масле день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот трансгенных животных гавани инженерии λ-бактериофаг и мутации гена LacZ репортер из Е. палочка 11 используется для трансгенных грызунов мутации анализов 12.
    2. Выполните животных вскрытии например, под наркозом мыши могут с помощью изофлуран а затем с помощью эвтаназии смещением шейных позвонков с последующим открытием полости грудной клетки. Сразу мигать замораживание ткани в жидком азоте. Магазин тканей при -80 ° С до анализа.
      Примечание: Время эвтаназии после обработки может быть другим важным параметром (например, окисление ДНК была максимальной при 72 ч после воздействия шума в головном мозге крыс и печени 13).

2. ДНК Добыча, осадки и промывка (для тканей приступить непосредственно к 2.2)

  1. Однородный собранные клетки в 50 мл коническую центрифужную пробирку из полистирола с 1 мл ДНК изоляции агентом, таким как DNAzol. Используйте кончик 1000 мкл пипетки, чтобы разогнать осадок клеток, пока раствор не станет однородной. Передача гомогената к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Инкубируют на льду в течение 10-20 мин. Перейдите к 2.3.
  2. Перемешать 15-20 мг ткани в 1 мл КПК антипригарной стеклянном гомогенизаторе, содержащем 500 мкл выделения ДНК агента. Аккуратно поднимать и опускать гомогенизатор около 1 мин; мягкие ткани потребуется меньше времени. Бережное обращение обеспечивает меньше стрижка ДНК. Хранить гомогената на льду в течение примерно 10-20 мин.
  3. ГранулаГомогенат центрифугированием в течение 10 мин при 10000 х г и 4 ° С в 1,5 мл коническую центрифужную пробирку.
  4. Тщательно передачи полученного супернатанта в новую 1,5 мл трубки микроцентрифужных обращая особое внимание, чтобы избежать контакта гранул.
  5. Осадок ДНК из гомогената путем добавления 0,5 мл 100% этанола на 1 мл гомогената. Обратить труб 10 раз, чтобы убедиться изолирующий реагент и этанола достаточно смешанные.
  6. В этот момент, осадок ДНК вязкая, катушка его на кончике пластмассовой пипетки (например, с максимальной удерживающей способности 200 мкл) и затем переносили в новую 1,5 мл коническую центрифужную пробирку.
    Примечание: Краткое центрифугирования могут быть использованы для удаления остатков лизат из выделенной ДНК.
    (ДНК Вымойте и Солюбилизация)
  7. Добавить 1 мл 75% этанола в изолированной ДНК. Приостановить осадок ДНК тщательно обращением труб 10 раз.
  8. Тщательно слейте этанола из трубки. Убедитесь, что ее ДНК гранул прилипает к стороне трубки. Хранить пробирки вертикально в течение 1-2 мин и использовать пипетку, чтобы удалить избыток EtOH из нижней части трубки.
  9. Повторите ДНК мыть еще раз, и либо хранить образцы в EtOH при -20 ° С (стабильной в течение нескольких месяцев) или сразу перейти к перевариванию.
  10. Растворите ДНК в пищеварении буфера (описано ниже), а затем количественно с использованием стандартных спектроскопических методов (т.е. поглощение при 260 нм с использованием спектрофотометра NanoDrop).

3. ферментативного расщепления

  1. Подготовка "пищеварение буфер" путем объединения соответствующих объемов (в зависимости от количества образцов, чтобы быть переварены) 50 мМ одноосновного фосфата натрия (содержащего 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ Desferal (ДФО) и 200 мМ MgCl 2) с 50 мМ двухосновного фосфата натрия (также содержащий 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ ДФО и 200 мм MgCl 2). Каждый образец требуется 4,0 мкл одноосновных и 17,0 мкл вторичный кислый фосфат решения.
  2. Удалить все оставшиеся EtOH из нижней части образцов труб и воздушно-сухих около 5 мин. Убедитесь, что ДНК не полностью высохнуть.
  3. Растворить 80 мкг экстрагированной ДНК в 21,0 мкл буфера пищеварения, добавить 1 единица ДНКазы I, растворенного в 2,0 мкл буфера пищеварения.
  4. Вихревой слегка, чтобы получить тщательное перемешивание и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 ° С.
  5. В конце инкубационного периода, добавить 216,4 мкл 50 мМ двухосновного фосфата Na раствора, содержащего 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ ДФО и 200 мМ MgCl 2.
  6. Подготовка "пищеварение буфера-2" путем комбинирования одного объем буфера пищеварения с девяти томах двухосновных, 50 мм фосфата натрия (с 2,0 мм KCl, 1,0 мМ ДФО и 200 мм MgCl 2).
  7. Добавить 0,025 единиц фосфодиэстеразы (ФДЭ) я фермента в 16,3 мкл буфера пищеварения-2. Пипетка вверх и вниз в течение нескольких секунд, а затем вихрь слегка, чтобы получить тщательное перемешивание и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 ° С.
  8. Добавить 00,4 единицы щелочной фосфатазы (AP) в 8,0 мкл буфера пищеварения-2. Пипетка вверх и вниз в течение нескольких секунд, а затем вихрь слегка, чтобы получить тщательное перемешивание и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 ° С. Добавить 33,0 мкл ВЭЖХ метанолом.
  9. Запуск перевариваются образцы ДНК с помощью ВЭЖХ, а не описано ниже, сразу или хранить при температуре -80 ° С до использования, чтобы свести к минимуму окисление. ПРИМЕЧАНИЕ: 1,5-ч шаги пищеварения, предлагаемые здесь, основаны на таких интервалах предложил в другом месте 9 и на выводах, что подобные протоколы достичь полного переваривания ДНК 9. Таким образом, предполагалось, что единственным ограничивающим фактором для достижения полного переваривания было время, и что фермент, ингибирование и образец неоднородности были незначительны.

4. ВЭЖХ Пробег: Подготовка подвижной фазы, приборостроения установки и технического обслуживания

  1. Используйте сверхчистой воды, чтобы подготовить все буферные растворы и обрабатывают высокой прочности связи смолы (например, Chelex 100: стирол divinylbenzene сополимер с иминодиацетатную ионов, что хелатные переходных металлов с высоким сродством) к минимуму загрязнение металла и окисления ДНК пробоподготовки.
  2. Подготовьте 250 мм Na фосфатный буфер, рН 6,2. Использование соотношении 1: 3,6957 из двухосновного фосфата натрия (FW = 177.99 г / моль), чтобы одноосновного фосфата натрия (FW = 119.98 г / моль).
    Пример: Таким образом, для 3 л раствора объединить 70,81 г одноосновной и 28,43 г порошка двухосновной, добавить воды до, например, 2,8 L и убедитесь, что рН раствора 6,2. Отрегулируйте рН с 250 мм моно или двузамещенный фосфат натрия решений, подготовленных отдельно, а не концентрированных кислот или оснований. Добавить 2,24 г KCl, чтобы получить концентрацию 10 мМ KCl.
  3. Подготовка подвижной фазы в три бутылки, по крайней мере, 1 л каждая, содержащий: растворитель B - ВЭЖХ-класса метанола, растворитель - B сверхчистой воды и растворителя C - фосфатный буфер с шагом 4,2. Вставьте ВЭЖХ подвижной фазы трубки питания в бутылках; remainiнг трубки должны быть также погружают в одну из бутылок (например, раствор C) и грунтуют, даже если они не требуются для смешивания.
  4. В перспективе, смешать фазовые мобильных решений как 6% растворителя А, 74% В и растворителя 20% C растворителя для достижения конечного раствора 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,2) с 2,0 мМ KCl, 6% MeOH.
  5. Снять электрод из электрохимического детектора, разобрать его и очистить ссылку и рабочие электроды с чистящими электрод решений и шлифовальные диски, рекомендованные производителем. Промыть очищенных поверхностей с особо чистой воды, вытрите воду осторожно и обеспечить детектор сухой перед включением системы на.
  6. Соберите детектор и подключить вход подвижной фазы к электроду. Включите потока и позволяют подвижной фазы, чтобы заполнить электрод перед установкой выпускной фазе трубки мобильного. Установите новый столбец перед началом оптимизации. Убедитесь, что установка находится в правильном направлении и Follows все рекомендации производителя.
  7. Включите КВУП приборов задолго (например, 1 час) образца анализы позволяют уравновешивание и снижение базовой шум. В Таблице 1, предложенных условиях; предел давления обратно должен быть установлен до 3000 фунтов на квадратный дюйм, чтобы избежать повреждения колонки. Включите дегазатора. Продолжить грунтовки насосы и установки градиента растворителя.
  8. Сухой премьер насосы в соответствии с инструкциями изготовителя. Для этого к влажному линии, когда подвижная фаза была заменена или впускной трубки подвергается воздействию воздуха.
  9. Найдите диск грунтовки и вставьте 10-15 мл пластиковый шприц там. Убедитесь, что шприц полностью вставлен перед открытием линии. Чтобы открыть линии просто поверните диск против часовой стрелки на один ход.
  10. Начните штрих с соответствующим выбором интерфейса ВЭЖХ. Осторожно потяните шприц для извлечения флюида в линии. После того, как жидкость течет, премьер завершения; Позволяет программезавершить пробег. Повторите для всех линий (обычно четыре, в зависимости от инструмента).
  11. Альтернативно, влажный простое, когда линии уже увлажненный с более ранней сухой расцвете (смотри ниже).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда большое количество времени, прошедшее между использования (например, 2 недели или больше), сухой премьер рекомендуется.
  12. Изменение состава компонентов подвижной фазы растворителей до 25% каждого с помощью пользовательского интерфейса ВЭЖХ. Из интерфейса, выберите опцию "Функция прямого", а затем выберите опцию "Мокрый" Премьер. Это будет премьер все линии в то же время.
  13. Убедитесь, что все воздух из системы путем наблюдения мокрой основную линию, как он поступает в контейнер для отходов. После хорошего расцвете, убедитесь, что не было пузырей слева в строке. Если пузырьки сохраняются, повторите грунтования.
  14. После того, как насос заполнен, начинают перемещение подвижной фазы ВЭЖХ. Использование интерфейса ВЭЖХ вручную изменить состав подвижной фазы до 6% метанола (растворитель A) и 94%Вода (растворитель В), и выбрать скорость потока 0,9 мл / мин. Разрешить 5 мин, чтобы очистить любую метанола из колонки стадии очистки.
  15. Через 5 мин, изменение состава до 6% метанола (растворитель А), 74% воды (растворитель B), 20% буфером (растворителем C), увеличивают скорость потока 1,0 мл / мин. Установить другие параметры, как в таблице 1, и установить предел противодавления до 3000 фунтов на квадратный дюйм, чтобы избежать повреждения колонки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможные проблемы с установкой ВЭЖХ включают дрейфующий базовый, сплит пика и интенсивность уменьшилась сигнала. Они, как правило, могут быть преодолены путем очистки колонку после каждого использования, частая очистка электрода, и обеспечение того, буферные растворы свободны от загрязнения (например, твердых частиц или микробного роста).
  16. Запуск подвижной фазы около 1-1,5 ч, чтобы достичь стабильного сигнала линии.
  17. Использование интерфейса инструмент программного обеспечения, выберите параметры, как указано в таблице 1, и набор эксплуатацию время до 15 мин. Вводите СэмPLE. Использование увеличение времени работы для сложных образцов (эмпирически определить это путем наблюдения за наличие или отсутствие пиков после 15-минутного интервала).
    ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение прибора позволяет программировать иллюстративный характер условиях бегать и установки для autosampling.
  18. После работает уже завершены, выключите ячейку детектора с помощью интерфейса детектора. Важно следовать рекомендациям производителя относительно выключения детектора, как неправильного обращения и выключения может привести к повреждению прибора. НЕ выключайте ячейки путем переключения обратно детектора как это может привести к повреждению прибора.
  19. Ручное изменение фазового состава мобильный до 6% метанола и 94% воды. Запуск в течение 5 мин.
  20. Вручную уменьшить скорость потока 0,7 мл / мин, немедленно изменить состав до 50% МеОН и 50% воды. Запуск по крайней мере 20 мин. Невыполнение запустить этот шаг для рекомендованного времени может привести к повреждению колонки и детектора. Выключите поток,D затем выключите дегазатора.

5. Приготовление стандартов

  1. Подготовка буфера подвижной фазы, как описано в пунктах 4.1-4.3 выше. Важно использовать подвижной фазы ВЭЖХ для подготовки стандартов, чтобы избежать пиков в результате смешения разнородных растворов после инъекции пробы.
  2. Развести это решение один в пяти сверхчистой водой перед использованием, и окончательное решение должно содержать 6% МеОН.
  3. dGuo Стандартный
    Примечание: высокий окислительный потенциал, необходимые для обнаружения dGuo может увеличить риск измерения вмешательства электроактивных соединений. Это может быть проверено, например, со стандартной кривой УФ-детектированием на dGuo при 260 нм, и сравнив ее с калибровочной кривой, созданной при обнаружении EC. Если оба выровнять хорошо (например, Дополнительное Рисунок 1) и матричные эффекты образец были приняты во внимание, можно приступить обнаружения dGuo УФ при 260 нм, а не обнаружения EC.
    1. Измерить 1,0 мг dGuo в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 1,0 мл МеОН ВЭЖХ.
    2. Вихрь на высокой скорости до dGuo полностью растворяется. Это основной инвентарь; хранить при -20 ° С в течение нескольких недель.
    3. Для создания вторичного dGuo запас (0,5 мм), разбавленной 143 мкл первичного dGuo складе в 857 мкл подвижной фазы ВЭЖХ. Храните на льду до использования и подготовить свежий ежедневно.
    4. Проведение дальнейших разбавлений, чтобы создать стандартную кривую (например, Таблица 2). Хранить растворы на льду и подготовить свежий ежедневно. Запуск стандарты в серии с экспериментальными образцами.
    5. До запуска, варьировать детектора напряжение, используя самую высокую концентрацию акций, чтобы найти оптимальное напряжение.
  4. 8-оксо-dGuo Стандартный
    1. Мера 1,0 мг 8-оксо-dGuo в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 0,1 мл МеОН ВЭЖХ. Вихрь на высокой скорости до 8-оксо-dGuo полностью растворяется. Это основной запас 8-оксо-dGuo. Хранить при -20 ° С в течение SEVEral недели.
    2. В отдельную пробирку, объединить 2,9 мкл первичного складе и 997,1 мкл подвижной фазы ВЭЖХ буфера, вихря. Это вторичный фондовый (10000 нм).
    3. Чтобы создать рабочий раствор для стандартной кривой (250 нм), объединить 24,4 мкл вторичного складе и 975,6 мкл буфера подвижной фазы.
    4. Выполните дальнейшие разведения, чтобы обеспечить решения, необходимые для создания стандартной кривой (например, таблица 3). Хранить растворы на льду и подготовить свежий ежедневно. Запуск стандарты с экспериментальными образцами.
  5. Определение
    1. Интеграция площадь под кривой для обоих 8-оксо-dGuo и dGuo с использованием стандартного программного обеспечения (как часть ВЭЖХ-компьютерный интерфейс, см Дополнительный рисунок 2А).
    2. Построить стандартную кривую (известную концентрацию в каждой пробе против площади под кривой (Дополнительное фиг.2В). Используя уравнение стандартной кривой, рассчитать соотношение для 8-оксо-dGuo / dGuo для каждого образца.

6. Электрофорез в агарозном геле

ПРИМЕЧАНИЕ: электрофорез в агарозном геле, может быть выполнена проверка полноты пищеварения ДНК.

  1. Подготовка 50x Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфер, путем растворения 242 г трис-основания (FW = 121,14) в 750 мл сверхчистой воды. Добавить 57,1 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0; ЭДТА будет полностью растворяются при рН раствора доводят до 8,0 с помощью, например, NaOH) и добавить сверхчистой водой до конечного объема 1 л Хранить при комнатной температуре, разбавить этот раствор 50x до использования.
  2. Взвесить 1 г агарозы и растворить его в 100 мл 1x TAE буфер, отопления в микроволновой печи в течение 1-2 мин. Носите защитные очки и средства защиты, чтобы избежать контакта с кипящей агарозы.
  3. не Охлаждают раствор вниз примерно до 50 ° С, добавить 5 мкл этидийбромида (Внимание: мутаген) и залить его в агарозном геле проточной аппарата. Вставьте расческу.
  4. Подождите, пока не затвердеет раствор, заливают TAE буфер на геле и загрузить образцы (объем зависит от размера гребень; правило, 10-20 мкл образца ДНК загружен, смешанный с управлением 6x красителя для визуализации и облегчает загрузку).
  5. Запуск гель, пока краситель не мигрирует примерно 2/3 длины геля (например, 45 мин при 150 V). Представьте полос ДНК под УФ-светом.

Результаты

dGuo наблюдалось иметь время удерживания 4,7 мин, тогда как 8-оксо-dGuo имел врем удерживани приблизительно 6,4 минут (фиг.2А и Б). Существует около 1000-кратное различие в пиковых высот между двумя аналитов, как видно на фиг.2С. Вольтамперограммах для 8-оксо-dGuo и dGuo были п...

Обсуждение

Хотя 8-оксо-dGuo сообщалось полезным биомаркеров окисления ДНК, его надежность количественное может создать проблему. Хотя существует несколько опубликованных методов, есть необходимость всеобъемлющего, описательной обзор протокола, чтобы позволить исследователям развернуть метод в ?...

Раскрытие информации

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Канада геномики исследований и развития инициативы в области здравоохранения (GRDI) и Стратегии канадской регулированию в области биотехнологии (CRSB). Авторы не имеют конфликта интересов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphataseSigma-AldrichP5931From E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylateSigma-AldrichD9533
dGuo standardSigma-AldrichD7145
Dibasic sodium phosphateSigma-AldrichS9390
DNA from salmon spermSigma-AldrichD1626Sodium salt
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, from bovine pancreas
DNAzolInvitrogen10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE4884The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K mediaATCC30-2004
Foetal bovine serumATCC30-2020
Guard columnChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 0204GCProtects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Monobasic sodium phosphateSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate buffered salineInvitrogen15190-250
Phosphodiesterase I enzyme Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizerThomas Scientific7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectivelyVolume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silicaChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT

Ссылки

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  13. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  14. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  15. Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  16. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  17. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  18. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  19. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  20. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  21. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  22. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  23. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  24. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  25. . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1028 78 28 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены