Funktionelle Komplementierung Analyse (FCA): A Laboratory Übung konzipiert und umgesetzt, die Lehre von Biochemical Pathways zur Ergänzung

Zusammenfassung

Die Validierung der enzymatischen Aktivitäten in biochemischen Wege beteiligt sind, können mit Hilfe der funktionellen Komplementierung Analyse (FCA) erläutert. Beschrieben in diesem Manuskript ist das FCA-Assay der enzymatischen Aktivität von Enzymen involviert in den Metabolismus von Aminosäuren, bakterielle stringenten Antwort und bakterielle Peptidoglycan-Biosynthese zeigen.

Zusammenfassung

Funktionelle Komplementierung Assay (FCA) ist ein in - vivo - Test , die häufig verwendet wird , um die Funktion / Rolle der Gene / Enzyme aufzuklären. Diese Technik ist in der Biochemie, Genetik und viele andere Disziplinen sehr verbreitet. Einen umfassenden Überblick über die Technik, um die Lehre der biochemischen Wege zur Ergänzung betreffend Säuren, Peptidoglycan und die bakterielle strenge Reaktion auf Amino ist in diesem Manuskript berichtet. Zwei cDNAs aus der Modellpflanzenorganismus Arabidopsis thaliana , die im Metabolismus von Lysin (L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) und Tyrosin - Aminotransferase (tyrB) involviert in den Metabolismus von Tyrosin und Phenylalanin sind markiert. Zusätzlich beteiligt sind, die bakterielle Peptidoglycan anabolen Stoffwechselweg wird durch die Analyse des UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE) Gen aus dem Bakterium Verrucomicrobium spinosum im Quer beteiligt hervorgehoben-Verknüpfung von Peptidoglycan. Die bakterielle stringent Antwort wird auch durch die Analyse des rsh (r ELA / s poT h omolog) bifunktionellen Gen für eine hyper mukoiden Phänotyp in dem Bakterium Novosphingobium sp berichtet. Vier Beispiele von FCA vorgestellt. Das Video konzentriert sich auf drei von ihnen, nämlich Lysin, Peptidoglykan und die strenge Antwort.

Einleitung

Funktionelle Komplementation im Zusammenhang mit der Funktion Aufklären (n) / Rolle (n) eines Gens wird als die Fähigkeit einer bestimmten homologe oder orthologe Gen definiert eine bestimmte Mutante mit einer beobachtbaren Phänotyp zu dem Wildtyp-Zustand, wenn die homologe wiederherzustellen oder orthologen Gen in cis oder trans in den mutierten Hintergrund eingeführt. Diese Technik wurde verwendet, um weithin isolieren und die Funktion (en) / Rolle (n) vieler Gene zu identifizieren. Ein besonderes Beispiel ist die Isolierung und Identifizierung von Orotidin-5-phosphat - Decarboxylase aus Candida albicans unter Verwendung des ura3 - Mutante von S. cerevisiae und die pyrF Mutante von E. coli. ¹ Die Autoren haben diese Technik verwendet , um die Funktion der Gene zu erhellen , die in den Stoffwechsel von Aminosäuren, Peptidoglycan und dem stringent Reaktion in ihre Forschungsprogramme beteiligt sind und haben diese Technik in ihre Lehrprogramme in der B eingebautiotechnology und Molecular Bioscience (BMB) Programm am Rochester Institute of Technology (RIT).

Die Autoren lehren Grundlagen der Pflanzenbiochemie / Pathologie (FPBP) (Hudson) und Bioseparations: Principles and Practices (BPP) (Hudson / Savka), zwei obere Abteilung Wahl Labor basierte Kurse im BMB-Programm an der RIT. Da einige der Themen, die in den Kursen diskutiert mit ihren Forschungsinteressen verbunden sind, haben die Autoren viele der Techniken und experimentellen Tools integriert, die in ihren jeweiligen Forschungsprogrammen in diese beiden Labor-basierte Kurse verwendet werden. Ein solches Beispiel ist funktionelle Komplementation als Laborübung der Vortragsmaterialien zu verstärken Bezug Säuremetabolismus von Pflanzen Amino, Peptidoglycan und dem stringent Reaktion Stoffwechsel von Bakterien.

Drei der Aminosäurewege von Pflanzen, die in der FPBB natürlich behandelt werden, sind die von Lysin (lys), Tyrosin(Tyr) und Phenylalanin (Phe). Der lys Weg wird im Rahmen hervorgehoben wegen der Bedeutung der Aminosäure als essentielle Aminosäure für alle Tiere insbesondere Menschen , da Tiere , die genetische Maschinerie fehlt lys de novo zu synthetisieren. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass es vor kurzem Pflanzen einen Weg für die Synthese von lys verwenden, die von der von Bakterien signifikant unterscheidet. Diese Entdeckung wurde zum Teil durch funktionelle Komplementierung der E. erleichtert coli Diaminopimelat (dap) , Mutanten unter Verwendung eines Gens , das das Enzym L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) von der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. ² ist die Variante Wege für die Synthese von lys durch den Zwischen Diaminopimelat kodiert sind in Fig. 1 gezeigten Zusätzlich erleichtert die Synthese von lys durch die Aspartat - Familie abgeleitet von Aminosäuren , die stark reguliert. ³ neben ihrer Bedeutung in Protein synthesis, die Wege für tyr und phe markiert sind ihre Bedeutung gegeben in die als Vorläuferverbindungen für den Anabolismus von Phenylpropanstoffwechsels Verbindungen , die die Synthese von Pflanzenabwehrstoffe beteiligt , wie:. Alkaloide, Lignine, Flavonoide, Isoflavonoide, Hydroxyzimtsäure unter anderem ⁴ Die tyr und phe Wege werden auch den Unterschied zu zeigen zwischen der Pflanzen- und Bakterien anabole Wege markiert. In Bakterien wird das Enzym Tyrosin-Aminotransferase (tyrB) in den Anabolismus beider Aminosäuren beteiligt sind, wohingegen in Pflanzen, das Enzym in den Katabolismus von tyr und phe primär beteiligt ist und nicht in den Anabolismus dieser Aminosäuren beteiligt. (Abbildung 2). ⁴

Die Unterschiede zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Bezug auf die Struktur von Peptidoglycan (PG) im FPBP natürlich hervorgehoben. Die PG von Gram-negativen Bakterien ist von Interesse, hinsichtlich Pflanzenpathologie basiert auf der Tatsache, dass die meistenPflanzenpathogene sind Gram-negative. Eine aktuelle Übersicht über die Top-10-bakterielle Phyto-Erreger ergeben, dass alle Gram negativ sind. Die Bakterien wurden aus den Gattungen:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya und Pectobacterium ⁵ eines der chemischen Unterschiede , wenn die PG Stamm Gram - negative und Gram - positive Bakterien Vergleich ist der Unterschied zwischen dem Vernetzungs amino Säuren beider Typen. Der erste Schritt für die unterschiedlichen Quervernetzung von PG in der zytoplasmatischen Schritt des PG Anabolismus auftritt , und wird durch das Enzym UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (Mure) erleichtert , (3A). Mure katalysiert die Addition einer bestimmten Diaminverbindung an der dritten Position des Peptids Stamm. ⁶ in den meisten Gram - negativen Bakterien, die vorletzte lys Vorläufer meso -diaminopimelate ( m -dap) dient als Vernetzungs Aminosäure und lys dient die gleiche Rolle in der PG für die meisten Gram - positiven Bakterien (3B). ^7. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass sowohl m -dap und lys besitzen zwei Amin Gruppen und sind zur Bildung von zwei Peptidbindungen zum Peptidschaft Vernetzung fähig.

In der Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Natürlich sind die Unterschiede zwischen offenen und geschlossenen Systemen für die Kultivierung von Bakterien und wie Nährstoffgehalt deutlich aufgrund von Umgebungsänderungen in beiden Systemen ändern werden diskutiert. Diese Ereignisse verknüpft sind regulatorische Änderungen ein "Herunterschalten" oder "hochschalten" ausgelöst durch Verhungern oder eine ausreichende Versorgung mit Aminosäuren oder Energie. Die "herunterschalten" Reaktion kann auftreten, wenn eine Bakterienkultur aus einer reichen und komplexen Medium zu einem chemisch definierten Medium mit einem einzigen Kohlenstoffquelle übertragen wird. Diese Änderung in der Umwelt führt zur schnellen Cessation von tRNA und rRNA-Synthese. Diese Einstellung führt zu dem Mangel an Ribosomen, Protein- und DNA-Synthese, obwohl die Biosynthese von Aminosäuren aufreguliert.

Im Anschluss an die "herunterschalten" Reaktion, werden die vorhandenen Ribosomen verwendet, um neue Enzyme zu produzieren, die die Aminosäuren nicht mehr verfügbar im Medium oder Umwelt zu synthetisieren. Nach einer gewissen Zeit werden rRNA Synthese und neue Ribosomen zusammengebaut und die Population von Bakterienzellen beginnt mit einer reduzierten Rate zu wachsen, obwohl. Der Verlauf der Ereignisse wird die "strengen Antwort" oder "strenge Kontrolle" bezeichnet und ist ein Beispiel für globale Zellregulation und kann zur Einstellung der Zelle Biosynthesemaschinerie als Mechanismus gedacht werden , um die Verfügbarkeit der erforderlichen Substrate und Energiebedarf zu kompensieren . ⁸ ist die stringent Reaktion ermöglicht somit Bakterien schnell Flüsse von Nährstoffen in der Umgebung zu reagieren und trägt und enhANCES die Fähigkeit von Bakterien in Umgebungen zu konkurrieren, die sich schnell in Bezug auf Nährstoff ändern und oder Substratverfügbarkeit. ^8-9

Die stringenten Antwort hat eine integrale Rolle bei der Genexpression , wenn die Verfügbarkeit von Aminosäuren, Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphat und Fettsäuren begrenzt sind. ^8,10-14 Diese stringenten Antwort durch zwei Nucleotide koordiniert ist, Guanosin tetraphosphat (ppGpp) und Guanosin Pentaphosphat (pppGpp) bezeichnet allgemein zusammen als alarmone (p) ppGpp. Wenn beispielsweise sind Aminosäuren begrenzt, die zu einem Engpass bei der Proteinsynthese-the alarmone führen kann, Guanosin 3,5- (bis) pyrophosphat (ppGpp) von Anabolismus von Guanosin 5-Triphosphat-3-diphosphat abgeleitet (pppGpp) ansammelt in der Zelle. Die Änderung in der (p) ppGpp-Ebene ist in der Expression von Genen beteiligt, die die Reaktion regulieren, das Fehlen von Substraten in die Umwelt zu überwinden, die in das Zellwachstum und developmen direkt beteiligt sindt. Zwei der Gene, die an diesem Prozess beteiligt sind, relA und spoT genannt. RelA ist eine Ribosomen-assoziierte (p) ppGpp-Synthetase, die in der Antwort auf die Anhäufung von unbeladenen tRNAs beteiligt ist, die das Ergebnis der Aminosäure-Begrenzung ist. SPoT Funktionen als bifunktionelles (p) ppGpp-Synthetase und Hydrolase. Die Synthetase - Aktivität von Flecks in der Antwort auf den Mangel an Kohlenstoff und Fettsäure Hunger beteiligt. ⁸ Die RelA / SPoT Homologe sind weit verbreitet in Pflanzen und Bakterien und sind als Rsh für R ela / S poT h omologs bezeichnet. ^{8.10 -12,16} eine kürzlich Manuskript zeigte , dass es eine spezifische Rsh Protein in der Synthese dieser Alarmone aus dem Bakterium Novosphingobium sp Rr 2-17 ¹⁷ beteiligt ist.

Hier präsentieren wir vier biochemischen Wege zu den funktionellen Komplementierung Assays gebunden. Die Komplementierung Assays in diesem Manuskript skizziert bietet eine Allee zu explore Verwendung dieses in vivo - Test als Mittel zur Identifizierung und Charakterisierung oder Enzyme , die vorhergesagt werden unknown / putative Funktion haben (s) oder als Lehrmittel die Lehre der biochemischen Wege zu ergänzen.

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Protokoll

HINWEIS: Die Autoren sind bereit, Bakterienstämme und rekombinante Plasmide bereitzustellen, um den Einbau von funktionellen Komplementierung Analyse zu Lehrzwecken für Personen zu erleichtern, die interessiert sind. Die Plasmide , die verwendet wurden funktionelle Komplementation Experimente zu erleichtern , sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Konstruktion von Plasmiden für Funktionelle Komplementierung

1. Klonierung von Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL) für Funktionelle Komplementierung.
   1. Amplify die DAPL offene Leserahmen (ORF) von der V. spinosum und cDNAs von A. thaliana und C. reinhardtii durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO _4, 0,5 mM jedes der 4 Desoxynukleotidtriphosphate und 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit PfxDNA-Polymerase.
      HINWEIS: Die vollständige Beschreibung im Zusammenhang mit dem rekombinanten Klonen von drei DAPL Orthologe aus der Anlage A. thaliana (At -dapL), das Bakterium Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) und die Alge Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) , die zuvor veröffentlicht wurde. ^2,18-20
      HINWEIS: Die Primer für die Klonierung der DAPL Orthologe sind wie folgt:
      Vs DAPL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      Vs DAPL R 5 'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3'
      Bei DAPL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      Bei DAPL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr DAPL F-5 'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3'
      Cr DAPL R -5' CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
   2. Klonen der PCR-Fragmente in ter Plasmid pET30a , die die rekombinanten Plasmide zu erzeugen, pET30a :: Vs DAPL, pET30a :: Bei DAPL und pET30a :: Cr DAPL der Primer, Restriktionsenzyme und T4 - DNA - Ligase.
      1. 50 ng des Einsatzes und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4-DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C kurz, inkubiert. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 50 ug / ml Kanamycin ergänzt durch ^-1 für 24 h bei 37 ° C inkubiert. ^18-20
   3. Um das Plasmid für die funktionelle Komplementation schaffen, verdauen pET30a :: Vs DAPL und pET30a :: Bei DAPL Plasmide mit den Restriktionsenzymen XbaI und SalI und XbaI und HindIII für den pET30a :: Cr DAPL. Ligieren der Einsätze in das Plasmid pBAD33 unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase , die die Plasmide pBAD33 :: Vs DAPL zu erzeugen; pBAD33 :: Bei DAPL und pBAD33 :: Cr DAPL.
      1. Inkubiere 50 ng des Einsatzes und 20 ngdes Vektors in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 34 ug / ml ^-1 Kanamycin um 37 ° C h für 24 inkubiert. ²⁰
2. Klonierung von Tyrosin - Aminotransferase (tyrB) von A. thaliana für Funktionelle Komplementierung.
   HINWEIS: Die vollständigen Einzelheiten der Klonierung der cDNA von A. thaliana durch die Locus - Tags kommentierten At5g36160 zuvor beschrieben worden ist . ⁴
   1. Amplify die cDNA durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO _4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, und 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Pfx DNA - Polymerase.
      HINWEIS: Die Primer für die cl verwendetenantrieb des At5g36160 sind wie folgt:
      An tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
   2. Klonen Sie das Fragment in das Plasmid pET30a, die die rekombinanten Plasmide pET30a :: At5g36160 durch Verdauen des PCR-Fragment mit EcoR1 und Sal1 zu erzeugen; Ligieren in das Fragment in pET30a unter Verwendung von T4 DNA - Ligase , wie unten beschrieben. ⁴
   3. Um die funktionelle Komplementierung Plasmid erstellen, verdauen die pET30a :: At5g36160 mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII und Ligieren des Inserts in pBAD33 die gleichen Restriktionsenzymschnittstellen unter Verwendung des rekombinanten Plasmids pBAD33 :: At5g3160 unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zu erzeugen.
      1. Inkubiere 50 ng Insert und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Wandeln Sie die Ligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 34 ug / ml ^-1 chlo ergänztramphenicol von 37 ° C für 24 h inkubiert. ⁴
3. Klonierung von UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE) von V. spinosum für Funktionelle Komplementierung.
   HINWEIS: Die Klonierung des ORF murE von V. spinosum wurde zuvor beschrieben. ¹⁸
   1. Amplify das offene Leseraster durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO _4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Pfx DNA - Polymerase. Dann klonen in das Plasmid pET100D das Plasmid pET100D :: Vs murE herzustellen.
      HINWEIS: Die Primer für die Klonierung des Vs murE verwendet sind wie folgt:
      Vs Mure F 5 'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3'
      VsMure R- 5 'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3'
   2. Um das Plasmid für die funktionelle Komplementierung produzieren, verdauen die pET100D :: Vs murE
      Mit den Restriktionsenzymen XbaI und Sal1 und Ligieren des Inserts in pBAD33 das rekombinante Plasmid pBAD33 :: Vs murE unter Verwendung von T4 DNA - Ligase zu erzeugen.
      1. Inkubiere 50 ng Insert und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer, zusammen mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 34 ug / ml Chloramphenicol supplementiert ^-1 um ​​37 ° C für 24 h inkubiert. ⁸
4. Klonierung von relA / s Topfes (rsh) von Novosphingobium sp für Funktionelle Komplementierung.
   . HINWEIS: Die Klonierung des rsh aus Novosphingobium sp wurde zuvor beschrieben ^17.
   1. Amplify die rsh ORF zusätzlich zu 599 Nukleotiden upstRieses der Initiationsstartstelle und 46 Nukleotide stromabwärts an der Terminierungsstelle durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO _4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Taq DNA - Polymerase. Dann klonen in das Plasmid pCR2.1 pCR2.1 :: Nsp rsh zu erzeugen.
      1. Inkubiere 1 ul amplifizierte PCR-Fragment, 1 ul pCR2.1 Vektor, 1 ul Salzlösung und 1 & mgr; l Wasser. Inkubieren bei 25 ° C für 5 min und 2 & mgr; l der Ligation in E. coli - Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 50 ug ergänzt / ml ^-1 Kanamycin um 37 Inkubation ° C für 24 Std.
         HINWEIS: Die Primer für die Klonierung des rsh verwendet werden, sind wie folgt:
         rsh F 5 'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3'
         rsh R- 5 'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. Für funktionelle Komplementierung, verdauen das Plasmid pCR2.1 :: Nsp mit EcoR1 rsh und abzubinden den Einsatz in die breiten Wirtsbereich pRK290 , um das rekombinante Plasmid pRK290 :: Nsp RSH unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase erzeugen.
         1. Inkubiere 50 ng Insert und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 10 ug / ml ^-1 Tetracyclin ergänzt durch 37 Inkubation ° C für 24 Std. ¹⁷

2. Herstellung von Elektro-kompetenten Bakterienzellen zur Erleichterung der Umgestaltung

HINWEIS: Die Herstellung von elektrokompetenten Zellen basiert auf dem Protokoll 26 für 1,0 l der Kultur , die auf ein kleineres Volumen verkleinert werden kann (dh 250 ml). Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll kann be verwendet , um alle Stämme zu machen kompetent , die in diesem Manuskript beschrieben FCA zu erleichtern. ²²

1. Impfen 50 ml flüssiges Medium mit einer Einzelkolonie in einen Kolben und wachsen über Nacht, so dass Sie sicher , dass das Erbgut der Mutante zu überprüfen , bevor Sie diesen Schritt (Tabelle 2) beginnt.
2. Am zweiten Tag, 1,0 l des geeigneten Mediums (LB für E. coli - Mutanten und PD für Novosphingobium sp) mit dem 50 ml der Übernachtkultur beimpft und bei 30 ° bis zu einer OD ₆₀₀ bis 0,4-0,6 (log - Phase) wachsen C.
3. Ernte Zellen bei 4 ° C bei 5.000 xg für 15 min zentrifugiert, dekantiert den Überstand und das Pellet in 500 ml sterilem eiskaltem reinem H ₂ O.
4. Zentrifuge die Zellen bei 5.000 × g für 20 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand und das Pellet in 250 ml sterilem eiskaltem 10% Glycerin.
5. Zentrifugieren der Zellen bei 5000 × g für 20 min bei 4 ° C, dekantiert die Supernatant und Resuspension des Pellets in 2,0 ml 10% Glycerin.
6. Aliquot der Zellen durch 50 ul in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und sofort gefrieren durch die Rohre in einem Trockeneis-Ethanol-Bad platzieren. Bewahren Sie die kompetenten Zellen bei -80 ° C für die Elektroporation.

3. Die Elektroporation von Bakterienzellen mit Komplementierung Plasmiden

1. Zur Elektroporation, fügen 1,0 ul (10-50 ng) des rekombinanten Plasmids zu einem Aliquot (50 ul) von kompetenten Zellen und für 5 min auf Eis stellen.
2. Übertragen Sie die Mischung über Pipettieren auf eine Elektroporationsküvette und stellen Sie die Elektroporationseinrichtung auf die folgende Einstellung: 25 & mgr; F Kapazität, 2,5 kV und 200 Ohm Widerstand und einen Impuls liefern.
3. 1,0 ml Wiederherstellungsmedien (LB) an die Elektroporationsküvette und Übertragung einer Pipette in ein 15 ml konischen Röhrchen mit. Erholen Sie sich bei leichter Rotation für 60 min in einem Schüttelinkubator.
4. Platte 100 ul der Kultur aus dem Recosehr Schritt auf den Agarplatten für Trans durch Pipettieren auszuwählen und Verbreitung eines sterilen Spreizer.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher , Tabelle 1 und Tabelle 2 zu überprüfen , bevor Sie diesen Schritt beginnen die Antibiotika und Genotypen zu überprüfen , die richtigen Agarplatten zu machen.

4. Transformation von AOH1 Funktionelle Komplementierung zu erleichtern Mit L, L-Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL)

1. Für die Komplementierung Analyse, Transformation AOH1 mit dem leeren Vektor (pBAD33) und mit den DAPL Expressionsvektoren in getrennten Transformationsereignisse die Elektroporation Protokoll in Abschnitt 3.0 skizziert werden.
2. Wählen Transformanten durch Ausplattieren auf LB - Agar - Medium , ergänzt mit 50 & mgr; g / ml ^-1 DAP und 34 & mgr; g / ml ^-1 Chloramphenicol und 50 ug / ml Kanamycin ^-1.
3. Test für funktionelle Komplementierung durch Replika-Plattierung Kolonien auf LB mir Ausstreichendium mit 0,2% (w / v) Arabinose mit und ohne 50 & mgr; g / ml ^-1 DAP und 34 & mgr; g / ml Kanamycin ^-1.
4. Die Platten bei 30 ° C für 24 Stunden und beobachten Ergebnisse.
   HINWEIS: Das Ergebnis sollte zeigen, dass die Mutante nur in der Lage ist, nur auf DAP freie Medien zu wachsen, wenn das DAPL Gen in der Mutante Hintergrund exprimiert wird, wenn nur die Kontrolle an den Vektor verglichen.

5. Transformation von TKL-11 funktionelle Komplementation Verwendung UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-Glutamyl-2,6- meso -diaminopimelate Ligase (murE) zu erleichtern

1. Wandeln Sie die Mutante mit dem leeren Vektor (pBAD33) und mit dem Mure exprimierenden Vektor (pBAD33 :: VsmurE) unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 3.0 beschrieben.
2. Plate und wählen Sie Transformanten auf LB - Agar - Medium mit 50 ug / ml ^-1 Thymin und 34 ug / ml ^-1 Chloramphenicol und Inkubation der Platten bei 30 ° C für 24 Stunden ergänzt.
3. Für die Komplementierung Test durch Ausstreichen oder Plattieren Kolonien sowohl von der Kontrolle und die experimentellen Transformationen auf zwei LB - Medium plus 0,2% (w / v) Arabinose und 50 & mgr; g / ml ^-1 Thymin.
4. Inkubieren einer Platte bei 30 ° C und die andere bei 42 ° C für 24 h, um visuell das Wachstum Phänotyp beurteilen.
   HINWEIS: Die Ergebnisse sollten zeigen, dass die Mutante der Lage ist, nur bei 42 ° C zu wachsen, wenn die murE Gen in der Mutante Hintergrund exprimiert wird, verglichen mit dem Vektor nur die Kontrolle.

6. Transformation von DL39 Funktionelle Komplementierung zu erleichtern Mit Tyrosinaminotransferase (tyrB)

1. Verwandeln DL39 mit entweder pBAD33 oder pBAD33 :: At5g36160, und wählen Sie Trans auf LB - Agar - Platten mit 50 ug / ml ^-1 Tyrosin ergänzt, 50 ug / ml ^-1 Phenylalanin und 34 ug / ml ^-1 Chloramphenicol unter Verwendung des Protokolls im Abschnitt 3.0.
2. Replik-Platte Kolonien auf Minimal (M9) Medien mit 50 ug / ml ^-1 Phenylalanin und 50 ug / ml ^-1 Tyrosin, 50 ug / ml ^-1 Aspartat, 50 ug / ml ^-1 Leucin, 50 ug / ml ^-1 Valin, 50 & mgr; g / ml ^-1 Isoleucin, 10 ug / ml Uracil ^-1 0,5% (w / v) Glycerol, 0,2% (w / v) Arabinose. Auch Replik-Platte Kolonien auf Platten fehlen Phenylalanin und Tyrosin durch die gleiche Kolonie beider Platten Ausstreichen.
3. Inkubiere Platten bei 30 ° C für 48 Stunden Wachstum Phänotyp zu beobachten.
   Hinweis: Das Ergebnis sollte zeigen, dass die Mutante nur in der Lage ist, an Phenylalanin und Tyrosin freien Medien zu wachsen, wenn nur das tyrB-Gen in der Mutante Hintergrund, wenn zu dem Vektor verglichen ausgedrückt wird nur die Kontrolle.

7. Transformation von Hx699 Funktionelle Komplementierung des Hypomucoid Phänotyps von Novosphingobium sp zu erleichtern. Der Stamm Hx699

1. Transwildtyp - Stamm Novosphingobium sp. (Rr2-17) und die Mutante Hx699 mit pRK290 und pRK290 :: rsh _Nsp in 2 separate Transformationsereignisse des Transformationsprotokolls in Abschnitt 3.0 skizziert werden.
2. Platte , die die Transformationen auf Kartoffel - Dextrose (PD) Agar mit 10 ug / ml ^-1 Tetracyclin, ergänzt und Inkubation für mindestens 24 Stunden oder bis Trans erscheinen.
3. Streak beide Transformationen in einem "X" Muster auf frische PD-Agar-Platten und Inkubation bei 30 ° C mindestens 4 Tage. Beachten Sie die Phänotypen des Vektors nur, und Experiment durch visuell das Wachstum Phänotyp der beiden Platten zu untersuchen.
   HINWEIS: Das Ergebnis sollte zeigen, dass die Hypo-schleimige Phänotyp ergänzt wird, wenn rsh in dem mutierten Hintergrund exprimiert wird, wenn im Vergleich zu dem Vektor nur die Kontrolle.

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Ergebnisse

Die Bakterienstämme, die in den verschiedenen funktionellen Komplementierung Analysen verwendet werden , sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Funktionelle Komplementierung Analyse: L, L-Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL)

Die E. coli - Doppelmutante AOH1 (Δ dapD :: kan2, dapE6) birgt eine Mutation in dem Gen dapE und eine...

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Diskussion

Viele der Kurse, die auf die Biotechnologie und Molekulare Biowissenschaften Lehrplan am Rochester Institute of Technology integral sind, haben eine Laborkomponente zusätzlich zur Vorlesung Teil des Kurses. Der Lehrplan für das akademische Jahr 2014-2015 enthält insgesamt 48 Kurse, von denen 29 eine Laborkomponente enthalten, die etwa 60% darstellen. Ein solcher Kurs ist Grundlagen der Pflanzenbiochemie und Pathologie (FPBP), einem gemischten Vorlesung / Praktikum und Bioseparations: Principles and Practices (BPP), e...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01