JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

A validação de actividades enzimáticas envolvidas nas vias bioquímicas podem ser elucidada utilizando a análise de complementação funcional (FCA). Descritos neste manuscrito é o ensaio de FCA que demonstra a actividade enzimática de enzimas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, resposta rigorosas bacteriana e biossíntese bacteriana do peptidoglicano.

Resumo

Ensaio de complementação funcional (FCA) é um ensaio in vivo que é amplamente utilizado para elucidar a função / função de genes / enzimas. Esta técnica é muito comum em bioquímica, genética e muitas outras disciplinas. Uma visão abrangente da técnica para complementar o ensino de vias bioquímicas que pertencem aos aminoácidos, peptidoglicano e da resposta rigorosa bacteriana é relatado neste manuscrito. Dois ADNc do thaliana organismo modelo Arabidopsis planta que estão envolvidas no metabolismo de lisina (L, aminotransferase L-diaminopimelato (dapL) e tirosina aminotransferase (tyrB) envolvida no metabolismo da tirosina e fenilalanina são realçados. Além disso, o peptidoglicano bacteriano via anabólico é realçada por meio da análise da -acetylmuramoyl-L-alanil-D-meso-ligase glutamate- -2,6-diaminopimelato (mûre) gene UDP-N a partir da bactéria Verrucomicrobium spinosum envolvido na transversal-linking de peptidoglicano. A resposta rigorosa bacteriana também é relatado por meio da análise do rsh (R ela / s Pot h omolog) gene bifuncional responsável por um fenótipo hiper-mucóide na sp bactéria Novosphingobium. Quatro exemplos de FCA são apresentados. O vídeo vai se concentrar em três deles, ou seja, lisina, peptidoglicano e da resposta rigorosa.

Introdução

complementação funcional no contexto da elucidação da função (s) / papel (s) de um gene é definido como a capacidade de um homólogo particular ou gene ortólogo para restaurar um mutante particular com um fenótipo observável para o estado de tipo selvagem quando o homólogo ou gene ortólogo é introduzido na forma cis ou trans para o fundo mutante. Esta técnica tem sido amplamente utilizado para isolar e identificar a função (s) / papel (s) de vários genes. Um exemplo particular é o isolamento e identificação de descarboxilase orotidina-5-fosfato a partir de Cândida albicans utilizando o mutante URA3 de S. cerevisiae e o mutante pyrF de E. coli. 1 Os autores têm utilizado esta técnica para elucidar a função dos genes que estão envolvidos no metabolismo de aminoácidos, peptidoglicano e a resposta rigorosa em seus programas de pesquisa e incorporaram esta técnica em seus programas de ensino do Biotechnology e programa do Rochester Institute of Technology (RIT) Bioscience Molecular (BMB).

Os autores ensinam Fundamentos de Bioquímica / Patologia (FPBP) (Hudson) e Bio Separação: Princípios e Práticas (BPP) (Hudson / Savka), dois cursos baseados superior divisão laboratório eletiva no Programa BMB na RIT. Desde alguns dos temas que são discutidos nos cursos são filiados com seus interesses de pesquisa, os autores têm incorporado muitas das técnicas e ferramentas experimentais que são usados ​​em seus programas de investigação para estes dois cursos em laboratório. Um tal exemplo é a complementação funcional, tal como um exercício de laboratório para reforçar os materiais de aula pertencentes aos amino metabolismo do ácido a partir de plantas, de peptidoglicano e o metabolismo resposta rigorosa a partir de bactérias.

Três das vias de aminoácidos de plantas que são discutidos no curso FPBB são o de lisina (Lys), tirosina(Tyr) e fenilalanina (Phe). A via de Lys é realçada no curso, devido à importância de o aminoácido como um aminoácido essencial para todos os animais particularmente em seres humanos dado que os animais não possuem a maquinaria genética para sintetizar de novo Lys. Além disso, foi recentemente descoberto que as plantas utilizam uma via para a síntese de Lys, que é significativamente diferente da das bactérias. Esta descoberta foi parcialmente facilitada pela complementação funcional da E. diaminopimelato coli (DAP) mutantes que utilizam um gene que codifica a enzima L, L-diaminopimelato aminotransferase (DapL) do thaliana modelo da planta Arabidopsis. 2 As vias variantes para a síntese de Lys através da diaminopimelato intermédia são mostrados na Figura 1. Além disso , a síntese de Lys facilita através do aspartato derivado da família de aminoácidos que é altamente regulado. 3 para além da sua importância na proteína Synthesis, as vias para Tyr e Phe são destacadas por sua importância para servir como compostos precursores para o anabolismo de compostos fenilpropanóides envolveu a síntese de compostos de defesa da planta, tais como:. alcalóides, ligninas, flavonóides, isoflavonas, ácido hidroxicinâmico entre outros 4 O Tyr e as vias de phe também são destacados para mostrar a diferença entre a central e as vias anabólicas bacterianas. Em bactérias, o aminotransferase enzima tirosina (TyrB) está envolvida no anabolismo de ambos os ácidos aminados, enquanto que nas plantas, é a enzima primariamente envolvidas no catabolismo de Tyr e Phe e não está envolvida no anabolismo destes aminoácidos. (Figura 2). 4

As diferenças entre Gram positivas e Gram negativas em relação à estrutura do peptidoglicano (PG) são destacadas no curso FPBP. O PG de bactérias Gram-negativas é de interesse em relação a patologia vegetal baseado em ao facto de a maioriapatógenos de plantas são gram negativa. Uma revisão recente sobre os 10 melhores fito-patógenos bacterianos revelou que todos são Gram negativo. As bactérias eram de entre os géneros Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya e Pectobacterium 5 Uma das diferenças químicas quando comparando a haste de PG de bactérias positivas negativas e Gram Gram é a diferença entre o grupo amino de ligação cruzada. ácidos de ambos os tipos. O passo inicial para que a ligação cruzada diferente de PG ocorre na etapa citoplasmática de PG anabolismo e é facilitada por a enzima UDP-N--acetylmuramoyl-L-alanil-D glutamate- meso-ligase -2,6-diaminopimelato (mûre) (Figura 3A). Mûre catalisa a adição de um composto de diamina nomeadamente em terceira posição da haste péptido. 6 Na maioria das bactérias Gram-negativas, os Lys penúltimo precursor, meso -diaminopimelate ( m -DAP) serve como a reticulação de aminoácidos Lys e serve a mesma função no PG da maioria das bactérias Gram-positivas (Figura 3B). 7 Isto é devido ao facto de que ambos m e -DAP Lys possuem dois amina e os grupos são capazes de formar duas ligações peptídicas para a haste péptido reticulação.

Nos Bio Separação: Princípios e Práticas de curso (BPP), as diferenças entre os sistemas abertos e fechados para o cultivo de bactérias e como nutriente níveis mudará significativamente em ambos os sistemas, devido às mudanças ambientais são discutidas. Estes eventos estão ligados a mudanças regulatórias chamado de "deslocar para baixo" ou "deslocar-se" desencadeada pela fome ou uma oferta adequada de aminoácidos ou de energia. A resposta de "mudança para baixo" pode ocorrer quando uma cultura bacteriana é transferida a partir de um meio rico e complexo para um meio definido quimicamente com uma única fonte de carbono. Esta mudança no ambiente leva à rápida cessação da síntese de ARNt e ARNr. Esta cessação resulta na falta de ribossomas, proteína e síntese de ADN embora a biossíntese de aminoácidos são regulados positivamente.

Na sequência da resposta "deslocar para baixo", os ribossomos existentes são usadas para produzir novas enzimas para sintetizar os aminoácidos não disponíveis no meio ou ambiente. Depois de um período de tempo, a síntese de rRNA e novas ribossomas são montados e a população de células bacterianas começa a crescer, embora a uma taxa reduzida. O curso dos acontecimentos é denominado o "resposta rigorosas" ou "controlo rigoroso" e é um exemplo de regulação celular global e pode ser pensado como um mecanismo para ajustar maquinaria biossintética da célula para compensar a disponibilidade dos substratos necessários e as necessidades de energia . 8 a resposta rigorosa permite, assim, as bactérias de responder rapidamente a fluxos de nutrientes no meio ambiente e contribui ea ENHANCES a capacidade das bactérias para competir em ambientes que podem mudar rapidamente com relação aos nutrientes e ou disponibilidade de substrato. 8-9

A resposta rigorosas tem um papel integral na expressão do gene quando a disponibilidade de aminoácidos, carbono, azoto, fosfato e ácidos gordos são limitados. 8,10-14 Esta resposta rigorosa é coordenado por dois nucleótidos, tetrafosfato de guanosina (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp) vulgarmente designado em conjunto, como o alarmone (p) ppGpp. Por exemplo, quando os aminoácidos estão limitados-o que pode levar a um gargalo na síntese de proteína-a alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivado de anabolismo de guanosina-difosfato 3 5-trifosfato (pppGpp) acumula na célula. A mudança no nível (p) ppGpp está envolvida na expressão de genes que regulam a resposta para superar a falta de substratos no ambiente que estão diretamente envolvidos no crescimento celular e development. Dois dos genes que estão envolvidos neste processo são chamados relA e local. RelA é uma (P) ppGpp sintetase associada ao ribossoma que está envolvido na resposta à acumulação de ARNt que não carregados é o resultado de limitação de aminoácidos. funções de ponto como um bifuncional (p) ppGpp sintetase e hidrolase. A actividade da sintetase da mancha está envolvido na resposta à falta de carbono e ácido graxo fome. 8 Os homólogos RelA / local são comuns em plantas e bactérias e são referidos como Rsh para R ELA / S da panela H omologs. 8,10 -12,16 um manuscrito recente mostrou que há uma proteína Rsh específica envolvida na síntese destes alarmones a partir da bactéria Novosphingobium sp Rr 17/02 17.

Aqui nós apresentamos quatro vias bioquímicas amarrados aos ensaios de complementação funcional. Os ensaios de complementação descritos neste manuscrito fornece uma avenida para explminério utilizando este ensaio in vivo como um meio de identificar e caracterizar ou enzimas que estão previstos para ter função desconhecida / putativo (s) ou como ferramentas de ensino para complementar o ensinamento das vias bioquímicas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

NOTA: Os autores estão dispostos a fornecer estirpes bacterianas e plasmídeos recombinantes para facilitar a incorporação da análise de complementação funcional para fins de ensino para os indivíduos que estão interessados. Os plasmídeos que foram usados ​​para facilitar experiências de complementação funcionais estão listados na Tabela 1.

1. Construção de plasmídeos para a complementação funcional

  1. Clonagem de diaminopimelato aminotransferase (dapL) para complementação funcional.
    1. Amplificar o enquadramento de leitura aberto dapL (ORF) do V. spinosum e ADNc a partir de A. thaliana e C. reinhardtii por PCR. Use 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmol de cada iniciador, 1 mM de MgSO4, 0,5 mM de cada um dos 4 trifosfatos de desoxinucleótido, e 0,5 ng de ADN molde e 1 unidade de Pfxpolimerase de ADN.
      NOTA: A descrição completa referente à clonagem recombinante de três orthologs dapL da planta A. thaliana (At -dapL), a bactéria Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) e da alga Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) foi publicado anteriormente. 2,18-20
      NOTA: Os iniciadores utilizados para a clonagem dos ortólogos dapL são como se segue:
      Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      Vs dapL R 5'-CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      No dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      No dapL R-5'-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr dapL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
    2. Clonar os fragmentos de PCR em tele plasmídeo pET30a para produzir os plasmídeos recombinantes, pET30a :: Vs dapL, pET30a :: Em dapL e pET30a :: Cr dapL utilizando os iniciadores, enzimas de restrição e ligase de DNA de T4.
      1. Resumidamente, incubar 50 ng de inserção e 20 ng do vector em 1x tampão de ligase e 1 unidade de ligase do DNA de T4 durante a noite a 17 ° C. Transformação de ligação em E. coli DH5a e ecrã de colónias em placas de LB suplementado com 50 ug / ml-1 de canamicina por incubação a 37 ° C durante 24 horas. 18-20
    3. Para criar o plasmídeo de complementação funcional, digerir pET30a :: Vs dapL e pET30a :: Em plasmídeos dapL com as enzimas de restrição Xbal e Sall e Xbal e HindIII para o pET30a :: Cr dapL. Ligar o insere no plasmídeo pBAD33 utilizando a ligase de ADN de T4 para produzir os plasmídeos pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: Em dapL e pBAD33 :: Cr dapL.
      1. Incubar 50 ng de inserção e 20 ngde vector em 1x tampão de ligase e 1 unidade de ligase do DNA de T4 durante a noite a 17 ° C. Transformação de ligação em E. coli DH5a e ecrã de colónias em placas de LB suplementado com 34 ug / ml-1 de canamicina por incubação de 37 ° C durante 24 hr. 20
  2. Clonagem da tirosina aminotransferase (tyrB) a partir de A. thaliana para complementação funcional.
    NOTA: Os detalhes completos sobre a clonagem do ADNc de A. thaliana anotada pelas tags de locus At5g36160 foi descrito anteriormente 4.
    1. Amplificar o ADNc por PCR. Use 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmol de cada iniciador, 1 mM de MgSO4, 0,5 mM de cada um dos quatro trifosfatos de desoxinucleótido, e 0,5 ng de ADN molde e 1 unidade de ADN-polimerase Pfx.
      NOTA: Os iniciadores utilizados para a cloning do At5g36160 são como se segue:
      No tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT 5'-3 '
    2. Clonar o fragmento no plasmídeo pET30a para produzir os plasmídeos recombinantes pET30a :: At5g36160 por digestão do fragmento de PCR com EcoR1 e Sal1; ligar no fragmento em pET30a usando DNA ligase de T4 como descrito abaixo de 4.
    3. Para criar o plasmídeo de complementação funcional, digerir o pET30a :: At5g36160 com as enzimas de restrição Xbal e HindIII, e ligar o inserto em pBAD33 utilizando os mesmos locais de enzimas de restrição para produzir o plasmídeo recombinante pBAD33 :: At5g3160 utilizando a ligase de ADN de T4.
      1. Incubar 50 ng de inserção e 20 ng do vector em 1x tampão de ligase e 1 unidade de ligase do DNA de T4 durante a noite a 17 ° C. Transformar a ligação em E. coli DH5a e tela de colônias em placas de LB suplementado com 34 ug / ml chlo -1ramphenicol por incubação de 37 ° C durante 24 hr 4.
  3. Clonagem de UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-meso-ligase glutamate- -2,6-diaminopimelato (mûre) de V. espinhoso para complementação funcional.
    NOTA: A clonagem do Mure ORF de V. spinosum foi descrito anteriormente. 18
    1. Amplificar o enquadramento de leitura aberto por PCR. Use 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmol de cada iniciador, 1 mM de MgSO4, 0,5 mM de cada um dos quatro trifosfatos de desoxinucleótido, 0,5 ng de ADN molde e 1 unidade de ADN-polimerase Pfx. Em seguida, clonar no plasmídeo pET100D para produzir o plasmídeo pET100D :: Vs Mure.
      NOTA: Os iniciadores utilizados para a clonagem do mûre Vs são os seguintes:
      Vs Mure F- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
      vsMure R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
    2. Para produzir o plasmídeo para a complementação funcional, digerir o pET100D :: Vs Mure
      Com as enzimas de restrição Xbal e Sal1 e ligar o inserto em pBAD33 para produzir o plasmídeo pBAD33 recombinante :: Vs mûre utilizando a ligase de ADN de T4.
      1. Incubar 50 ng de inserção e 20 ng do vector em 1x tampão de ligase, juntamente com uma unidade de ligase de ADN de T4, durante a noite a 17 ° C. Transformação de ligação em E. coli DH5a e ecrã de colónias em placas de LB suplementadas com cloranfenicol -1 34 ^ g / ml por incubação de 37 ° C durante 24 h. 8
  4. Clonagem de relA / s Pot (RSH) do Novosphingobium sp para complementação funcional.
    NOTA:. A clonagem do RSH Novosphingobium de SP tem sido descrito previamente 17.
    1. Amplificar o ORF RSH além de 599 nucleótidos upstresma do local de iniciação de início e de 46 nucleótidos a jusante para o local de terminação por PCR. Use 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmol de cada iniciador, 1 mM de MgSO4, 0,5 mM de cada um dos quatro trifosfatos de desoxinucleótido, 0,5 ng de ADN molde e 1 unidade de polimerase de ADN de Taq. Em seguida, clonar no plasmídeo pCR 2,1 para produzir pCR2.1 :: Nsp RSH.
      1. Incubar 1 ul do fragmento amplificado por PCR, 1 pi de vector pCR2.1, 1 ul da solução de sal e 1 uL de água. Incubar a 25 ° C durante 5 min e 2 ul de ligação em E. células de E. coli, e um ecrã para colónias em placas de LB suplementado com 50 ug / ml-1 de canamicina por incubação de 37 ° C durante 24 h.
        NOTA: Os iniciadores utilizados para a clonagem do RSH são como se segue:
        RSH F- GTTGAAAAACGCCGAATAGC 5'- -3 '
        rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. Para complementação funcional, digerir o plasmídeo pCR2.1 :: Nsp rsh com EcoR1 e ligar o encaixe de encontro ao ampla gama de hospedeiros pRK290 para produzir o plasmídeo recombinante pRK290 :: Nsp RSH utilizando a ligase de ADN de T4.
        1. Incubar 50 ng de inserção e 20 ng do vector em 1x tampão de ligase e 1 unidade de ligase do DNA de T4 durante a noite a 17 ° C. Transformação de ligação em E. coli DH5a e ecrã de colónias em placas de LB suplementadas com tetraciclina -1 10 ^ g / ml por incubação de 37 ° C durante 24 hr. 17

2. Preparação de células bacterianas Electro-competentes para facilitar a transformação

NOTA: A preparação de células eletro-competentes baseia-se no protocolo de 26 para 1,0 L de cultura que pode ser reduzida para um volume mais pequeno (isto é, 250 ml). Por favor note que este protocolo pode be usado para fazer todas as cepas competente que são descritos neste manuscrito para facilitar FCA 22.

  1. Inocular 50 ml de meio líquido com uma única colónia para um balão e crescem durante a noite, tendo o cuidado de verificar o genótipo do mutante antes de iniciar esta etapa (Tabela 2).
  2. No dia dois, inocular 1,0 L do meio apropriado (LB para mutantes de E. coli e de DP para Novosphingobium SP) com 50 ml da cultura durante a noite, e crescer até uma DO600 de 0,4-0,6 (log fase) a 30 ° C.
  3. Células colheita por centrifugação a 5000 xg durante 15 min a 4 ° C, decanta-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ml de estéril gelada puro H 2 O.
  4. Centrifugar as células a 5000 xg durante 20 min a 4 ° C, decanta-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ml de estéril arrefecido em gelo 10% de glicerol.
  5. Centrifugar as células a 5000 xg durante 20 min a 4 ° C, decantar o supernatant, e ressuspender o sedimento em 2,0 ml de glicerol a 10%.
  6. Alíquota as células através da transferência de 50 uL para tubos de micro-centrifugação e congelar imediatamente, colocando os tubos num banho de gelo seco-etanol. Armazenar as células competentes a -80 ° C durante electroporação.

3. Eletroporação de células bacterianas com plasmídeos de Complementação

  1. Para a electroporação, adicionar 1,0 mL (10-50 ng) do plasmídeo recombinante com uma aliquota (50 uL) de células competentes e colocar em gelo durante 5 min.
  2. Transferir a mistura através de pipetagem para uma cuvete de electroporação e definir o aparelho de electroporação com a configuração seguinte: 25 capacitância uF, 2,5 KV e 200 ohms de resistência e fornecer um impulso.
  3. Adicionar 1,0 ml de mídia de recuperação (LB) para a cuvete de electroporação e transferência usando uma pipeta para um tubo de 15 ml. Recuperar com rotação suave durante 60 min em uma incubadora de agitação.
  4. Placa de 100 ul da cultura da Recomuito passo para as placas de ágar para seleccionar os transformantes por pipetagem e espalhar usando um espalhador estéril.
    NOTA: Certifique-se de verificar Tabelas 1 e 2 antes de iniciar esta etapa para verificar os antibióticos e genótipos para fazer as placas de agar adequadas.

4. Transformação de AOH1 para Facilitar a complementação funcional Usando L, L-diaminopimelato aminotransferase (dapL)

  1. Para a análise de complementação, transformar AOH1 com o vector vazio (pBAD33), e com os vectores de expressão DapL em eventos de transformação separadas, usando o protocolo de electroporação descrito na secção 3.0.
  2. Seleccionar transformantes por plaqueamento em meio de agar LB suplementado com 50 ug / ml-1 DAP e 34 ug / ml de cloranfenicol -1 e 50? G / ml-1 de canamicina.
  3. Teste para complementação funcional por colônias replica-plating por estrias em LB mimdium com 0,2% (w / v) de arabinose, com e sem 50 ng / ml -1 DAP e 34 ug / ml-1 de canamicina.
  4. Incubar as placas a 30 ° C durante 24 h e observar os resultados.
    NOTA: O resultado deve mostrar que o mutante é capaz apenas de crescer em meio isento de DAP apenas quando o gene é expresso dapL no fundo mutante quando comparado com o vector de controlo única.

5. Transformação de TKL-11 para Facilitar a complementação funcional Usando meso UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6- -diaminopimelate Ligase (mûre)

  1. Transformar o mutante com o vector vazio (pBAD33) e com a expressão vector Mure (pBAD33 :: VsmurE) utilizando o protocolo descrito na secção 3.0.
  2. Placa e seleccionar os transformantes em meio de agar LB suplementado com 50 ug / ml de timina -1 e 34? G / ml-1 de cloranfenicol e incubar as placas a 30 ° C durante 24 h.
  3. Teste de complementação por estrias ou chapeamento de colónias a partir de ambos o controlo e os experimentais em duas transformações meio LB mais 0,2% (w / v) de arabinose e 50 ug / ml -1 timina.
  4. Incubar uma placa a 30 ° C e o outro a 42 ° C durante 24 horas para avaliar visualmente o fenótipo de crescimento.
    NOTA: Os resultados devem mostrar que o mutante é capaz de crescer a 42 ° C só quando o gene é expresso mûre no fundo mutante em comparação com o vector de controlo única.

6. Transformação de DL39 para Facilitar a complementação funcional Usando tirosina aminotransferase (tyrB)

  1. Transformam DL39 com qualquer pBAD33 ou pBAD33 :: At5g36160, e seleccionar os transformantes sobre placas de agar LB suplementado com 50 ug de tirosina / ml-1, 50 ug / ml -1 fenilalanina, e 34 ug / ml de cloranfenicol -1 utilizando o protocolo descrito na secção 3.0.
  2. Réplica-plate colónias em meio mínimo M9 (50) com ug / ml fenilalanina -1 e 50 ug / ml de tirosina -1, 50 ug / mL -1 aspartato, 50 ug / ml de leucina-1, 50 ug / ml-1, valina 50 ug / ml isoleucina -1, 10? g / ml-1 de uracilo de 0,5% de glicerol (p / v), 0,2% (w / v) de arabinose. Também colónias réplica em placa sobre placas sem fenilalanina e tirosina por estrias da mesma colónia de ambas as placas.
  3. Incubar as placas a 30 ° C durante 48 horas para observar o fenótipo de crescimento.
    NOTA: O resultado deve mostrar que o mutante é capaz apenas de crescer em meio isento de fenilalanina e tirosina, apenas quando o gene é expresso tyrB no fundo mutante quando comparado com o vector de controlo única.

7. Transformação de Hx699 para Facilitar a complementação funcional do sp Hypomucoid Fenótipo de Novosphingobium. Hx699 Strain

  1. Transformação de tipo selvagem estirpe Novosphingobium sp. (Rr2-17) e o mutante com Hx699 pRK290 e pRK290 :: Nsp RSH em 2 eventos de transformação separadas, usando o protocolo de transformação descrito na secção 3.0.
  2. Placa as transformações em dextrose de batata (PD) de agar suplementado com 10 ug / ml de tetraciclina -1, e incuba-se durante pelo menos 24 h ou até que os transformantes aparecem.
  3. Streak tanto transformações em um padrão de "X" em placas de ágar PD fresco e incuba-se a 30 ° C durante pelo menos 4 dias. Observar os fenótipos de apenas o vector, e a experiência por exame visual do fenótipo de crescimento de ambas as placas.
    NOTA: O resultado deve demonstrar que o fenótipo mucóide hipo-RSH é complementado quando é expressa no fundo mutante quando comparado com o vector de controlo única.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

As estirpes bacterianas que são empregues nas várias análises de complementação funcional estão listados na Tabela 2.

análise de complementação funcional: L, aminotransferase L-diaminopimelato (dapL)

A E. coli mutante duplo AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) abriga uma mutação no gene DAPE e uma deleção completa do...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Muitos dos cursos que são parte integrante da Biotecnologia e currículo Molecular Bioscience no Instituto de Tecnologia de Rochester têm uma componente laboratorial, além da parte de leitura do curso. O currículo para o ano lectivo 2014-2015 contém um total de 48 cursos, 29 dos quais contêm um componente laboratorial que representam aproximadamente 60%. Um tal curso é Fundamentos de Bioquímica e Patologia (FPBP), um curso de blended aula / laboratório e Bio Separação: Princípios e Práticas (BPP), um curso ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

AOH e MAS reconhece a Faculdade de Ciências e da Thomas H. Gosnell Escola de Ciências da Vida no Instituto de Tecnologia de Rochester para o apoio. Este trabalho foi apoiado em parte pela United States National Science Foundation (NSF) prêmio para AOH MCB-1120541.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantsHudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Temperature controlled incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Potato Dextrose MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
PhenlylalanineSigma-AldrichP2126
AspartateSigma-AldrichA9256
ValineSigma-AldrichV0500
LeucineSigma-AldrichL8000
IsoleucineSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polymeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

Referências

  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
  3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
  4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572(2010).
  5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
  6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).
  7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
  8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
  9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
  10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
  11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
  12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
  13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
  14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
  15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
  16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
  17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
  18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183(2012).
  19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
  20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).
  21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
  24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
  25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
  26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
  27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
  28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
  29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
  30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
  31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
  32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
  33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Molecular Biology112 Edi oan lise de complementa o funcionallisinatirosinafenilalaninametabolismo de amino cidosresposta rigorosaspeptidoglicanoo sensor de quorum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados