Ein neuer Ansatz Motor Ergebnis der tiefen Hirnstimulation Effekte in der Hemiparkinsonian Rat zur Bewertung: Treppe und Zylinder-Test

Zusammenfassung

Deep brain stimulation (DBS) is an effective treatment option for Parkinson's disease. We established a study design to screen novel stimulation paradigms in rats. The protocol describes the use of the staircase test and cylinder test for motor outcome assessment in DBS treated hemiparkinsonian rats.

Zusammenfassung

Tiefe Hirnstimulation des Nucleus subthalamicus ist eine wirksame Behandlungsoption für die Parkinson-Krankheit. In unserem Labor haben wir ein Protokoll verschiedene Neurostimulationsmuster in hemiparkinsonian (unilateral läsionierte) Ratten zu screenen. Es besteht aus durch Einspritzen von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in das rechte mediale Vorderhirnbündel, Implantieren chronische Stimulationselektroden in den Nucleus subthalamicus eine einseitige Parkinson Läsion Erstellung und Auswertung von Motor Ergebnisse am Ende der 24-Stunden-Perioden von kabelgebundenen externen Neurostimulations . Die Stimulation wurde mit einem konstanten Strom Stimulation durchgeführt. Die Amplitude wurde 20% unter dem individuellen Schwellenwert für Nebenwirkungen eingestellt. Der Motor Ergebnisevaluation wurde von der Beurteilung der spontanen Pfote Verwendung im Zylinder Test erfolgt nach Shallert und durch die Beurteilung der Fach erreicht im Treppenhaus-Test nach Montoya. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Ausbildung im Treppenhaus-Box, der cylinder Test, sowie die Verwendung sowohl in hemiparkinsonian Ratten. Die Verwendung beider Tests ist notwendig, da die Treppe Test sensitiver für Feinmotorik Beeinträchtigung zu sein scheint, und weist eine höhere Empfindlichkeit bei der Neurostimulation zu ändern. Die Kombination aus der einseitigen Parkinson-Modell und die beiden Verhaltenstests ermöglicht die Bewertung verschiedener Stimulationsparameter in standardisierter Form.

Einleitung

Tiefe Hirnstimulation des Nucleus subthalamicus (STN) ist eine wirksame Behandlungsoption für die Parkinson-Krankheit ¹ und anderen Bewegungsstörungen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind immer noch wenig verstanden und multifaktoriell, aber ein wesentliches Merkmal ist die Modulation der neuronalen Netzwerkaktivität durch wiederholte Depolarisation von Axonen in der Nähe der Stimulationselektrode ^2-4. Hochfrequenz (> 100 Hz) Stimulation ist für eine vorteilhafte Wirkung in den meisten Gehirnziele erforderlich, und für die meisten Indikationen der DBS. Nebenwirkungen der tiefen Hirnstimulation Ergebnis durch unbeabsichtigtes Koaktivierung anderer Fasern, die durch das Stimulationsvolumen abgedeckt werden und die subserve verschiedene Funktionen, wie beispielsweise der Pyramidenbahn. Daher wäre es wünschenswert, die Stimulationsparameter zu entwickeln, die bevorzugt von Vorteil neuralen Elemente zu aktivieren, wobei die Coaktivierung von Nebeneffektelemente vermieden ^5,6. Obwohl Neurophysiologie solche feinen tuni bieten kannng Optionen von DBS, der wissenschaftliche Fortschritt hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten minimal, weil die Programmierung Strategien durch "trial and error" bei Patienten und beschränkt durch die begrenzten Programmiermöglichkeiten von handelsüblichen DBS-Geräte in erster Linie geprüft worden, anstatt neurophysiologische Erkenntnisse mit und experimentelle Einstellungen definiert, um systematisch den vollen Parameterraum zu erkunden.

Zur Überwindung der translationalen Straßensperre in DBS Forschung wir ein Protokoll schlagen alternative Stimulationsparameter in Nagetiermodellen von Parkinsonismus vor der klinischen Untersuchung zu screenen. Unilaterale Parkinson-Krankheit bei Ratten modelliert wird unter Verwendung von 6-Hydroxydopamin - Injektionen in das rechte mediale Vorderhirnbündel ^7,8. Die resultierende Läsion, weiter beschrieben als hemiparkinsonian, in der Apomorphin-Test durch Auswertung von Dreh-Score nach niedrigen Dosis Apomorphin Injektion beurteilt und bestätigt wird post mortem durch Tyrosin-Hydroxylase immunohistochemistry. Das Verfahren ist einfach anzuwenden und sehr gut reproduzierbar, während eine niedrige Mortalität und Morbidität tragen. Die daraus resultierenden motorischen Defiziten sind sehr diskret ^7,8; die Tiere während einer leichten Beeinträchtigung der kontralateralen linken Pfote sowohl spontane Exploration und komplexe Greifverhalten ^9,10 aufweisen.

Zur Beurteilung der Wirksamkeit der tiefen Hirnstimulation Protokolle Tests erforderlich, die eine schnelle und zuverlässige Änderung der Motorleistung ermöglichen die Messung und kann im Laufe der Zeit mit verschiedenen Neurostimulation Einstellungen wiederholt werden. Mehrere Gruppen haben unterschiedliche Stimulation Ansätze und verschiedene Tests vorgeschlagen ^11-14 die motorischen Funktionen bei Ratten ¹¹ mit sehr variabel und inkonsistente Ergebnisse zu bewerten. Dies zwang uns eine Reihe von Tests mit hoher vorhersagen Gültigkeit und Komplementarität zu wählen. Zusätzlich wird für die Beurteilung der motorischen Ergebnis unter tiefen Hirnstimulation Bedingungen wurden Tests begünstigt, die von ani durchgeführt werden konnteMals über Kabel an den Stimulusgenerator angeschlossen ist. Für diese Zwecke haben wir unsere Testbatterie, bestehend aus einem Test für die Pfote Verwendung Asymmetrie und ein Test für qualifizierte reichend. Das Studiendesign ist in Abbildung 1 veranschaulicht.

Für spontane Pfote Verwendung führten wir den Zylinder Test von Shallert ¹⁵ beschrieben, die eine weit verbreitete Test für die Pfote Verwendung während der vertikalen Exploration ist. Keine Ausbildung des Tieres erforderlich ist. Für die Beurteilung von komplexeren Greifverhalten haben wir die Treppe Test nach Montoya ^16. Unser Protokoll wird entsprechend modifiziert Kloth ^17. Die Ratten werden für einen Zeitraum von zwölf Tagen geschult Pellets aus dem Testfeld zu erreichen. Nach der Ausbildung kann der Test durch das Zählen der Erfolgsrate als Anzahl von Pellets gegessen beschrieben das komplexe Greifverhalten zu messen, angewendet werden. Der Artikel stellt die detaillierte Ausbildung im Treppenhaus Feld sowie die Leistung der beiden behavioral Tests unter naiv, hemiparkinsonian und tiefe Hirnstimulation Bedingungen.

Protokoll

Tierversuche wurden von der Universität Würzburg und der gesetzlichen staatlichen Behörden von Unterfranken in Übereinstimmung mit den Tierschutzrichtlinien und Europäischen Gemeinschaften Leitlinien des Rates (Zulassungsnummer: 55,2-2531,01 76/11) zugelassen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, verwendet, um Schmerzen oder Beschwerden der Tiere zu minimieren.

Hinweis: Elektrodenimplantation durchgeführt wurde , wie an anderer Stelle beschrieben ^18.

1. Zylinder Test (Figur 2)

1. Bereiten Sie einen durchsichtigen Kunststoff-Glaszylinder (Höhe: 40 cm, Durchmesser: 19 cm) durch den Zylinder mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung reinigen.
2. Bereiten Sie Karten mit Datum des Experiments und der jeweiligen Identifikationsnummer der Ratte.
3. Legen Sie zwei Spiegel in 90 ° Winkel hinter dem Zylinder.
4. Die Kamera in die vor dem Zylinder, so dass der Abstand zwischen der Kamera und dem Zylinder eine gute Sicht auf die Pfoten ermöglicht.
5. Legen Sie die Ratte in der Transportkiste.
   Anmerkung: Die Tiere sollten vor der Prüfung durch den Experimentator gehandhabt werden Stress zu vermeiden.
6. Transportieren Sie die Ratte von zu Hause Käfig mit dem Zylinder mit der Transportbox.
7. Legen Sie die Ratte in den Zylinder (Abbildung 3).
   1. Immer führen alle Verhaltenstests zur gleichen Zeit des Tages circadian Aktivitätsunterschiede zu vermeiden. Wenn das Tier auf den Reizgenerator durch Kabel verbunden ist sicherzustellen, dass das Kabel nicht während des Experiments verdreht ist.
8. Drücken Sie die "Record" -Taste auf der Kamera. Zeigen Sie die Karte mit dem aktuellen Datum des Experiments und der Ratte Kennnummer auf die Kamera. Starte die Aufnahme.
9. Nach fünf Minuten das Tier aus dem Zylinder zu entfernen und sie in den Käfig mit der Transportbox setzen.
10. Reinigen Sie den Zylinder mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung.
11. Bewerten Sie die Pfote Verwendung von aufgezeichneten Videos durch die linken und rechten Pfote Wandkontakte gezählt (paw Verwendung in Prozent) sowie rearings (stehend auf den Hinterpfoten mit oder ohne an der Zylinderwand unterstützen). Der Zylindertest kann auch automatisch durch eine entsprechende Software ausgewertet werden.
    Hinweis: Eine gesunde Ratte gleich beide Pfoten verwendet. Die hemiparkinsonian Ratte verwendet die Pfote auf Grund beeinträchtigt ein geringeres Ausmaß an Läsion.

2. Treppen Test (Figur 4)

1. Akquisitionsphase
   1. Einen Tag vor dem Training vertraut machen, die Tiere mit den Pellets im Treppentest verwendet.
      1. Optional: Um das Tier die Motivation , eine diätetische Einschränkung verwenden erhöhen (10-15 g Standardlaborfutter Körpergewicht bei 90% des freien Futtermenge ¹⁶ zu halten). Dies ist jedoch nicht zwingend eine positive Trainingseffekt zu erzielen. Diese Studie wurde ohne Nahrung Einschränkung durchgeführt.
   2. Bereiten Sie eine klare Kunststoff-Glastreppe Feld (Höhe: 34,5 cm, Länge: 35,5 cm, Breite: 12 cm und engen Abteil 6 cm), indem Sie die Box mit einer 0,1% ac Reinigungetic Säurelösung. Anmerkung: Die Treppe Feld ist ein Zweifach-Box mit einer erhöhten Plattform und zwei Stufen in der schmalen Kammer. Die linken Schritte auf der Treppe in dem schmalen Fach kann nur mit der linken Pfote, die richtigen Schritte mit der rechten Pfote nur erreicht werden.
      : Die Standardtreppenkästen bestehen aus zwei Kammern mit einem Deckel, wenn er für Experimente mit Ratten über Kabel stimuliert verwendet werden soll, mit einem hohen Box ohne Deckel.
   3. Nehmen Sie die Treppe und füllen die Vertiefungen auf jedem Schritt mit acht 45 mg Tabletten.
   4. Legen Sie die Treppe und legte acht zusätzliche Pellets auf der erhöhten Plattform.
   5. Legen Sie die Ratte in der Transportkiste.
   6. Transportieren Sie die Ratte von zu Hause Käfig zur Treppe Feld mit der Transportbox.
   7. Legen Sie die Ratte in der Treppe Feld (Abbildung 5).
   8. Nach fünf Minuten das Tier von der Treppe Feld entfernen und es in den Käfig mit der Transportbox setzen.
   9. Beachten Sie, wie vielePellets wurden von Plattform und (schließlich) von rechts und links Treppe gegessen.
   10. Füllen Sie die Treppe durch Auffüllen der Vertiefungen auf jeder Stufe mit acht 45 mg Tabletten.
   11. Reinigen Sie die Treppe Box mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung und legen Sie die weiteren Pellets auf der Plattform.
   12. Wiederholen Sie diesen Vorgang (Akquisitionsphase) drei Tage in einer Reihe.
       Anmerkung: Alle beschriebenen Versuche wurden an männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Die Dauer der einzelnen Trainingsmodule können bei Ratten verschiedener Stamm, Geschlecht und vender unterscheiden.
2. Free Choice-Test
   1. Reinigen Sie die Treppe Box mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung.
   2. Nehmen Sie die Treppe und füllen die Vertiefungen auf jedem Schritt mit acht 45 mg Tabletten.
   3. Legen Sie die Ratte in der Transportkiste.
   4. Transportieren Sie die Ratte von zu Hause Käfig zur Treppe Feld mit der Transportbox.
   5. Legen Sie die Ratte in der Treppe Feld.
   6. Nach fünf Minuten, entfernen Sie das Tier von der TreppeFall-Box und legte es in den Käfig der Transportkiste mit zurück.
      Man beachte, wie viele Pellets wurden aus rechten und linken Treppe gegessen.
   7. Hinweis: Wenn die Tiere immer noch Probleme haben mit Pellets zu erfassen, fügen Sie einige mehr auf der Plattform, wo sie leicht zu erreichen.
   8. Füllen Sie die Treppe durch Auffüllen der Vertiefungen auf jeder Stufe mit acht 45 mg Tabletten.
   9. Reinigen der Treppe Feld mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung für das nächste Tier.
   10. Wiederholen Sie diesen Vorgang (freie Wahl Phase) drei Tage in einer Reihe.
       Hinweis: Die hier vorgestellten Ergebnisse durch die Ausbildung durchgeführt wurden erhalten, ohne eine Ruhezeit zwischen den Modulen. Einige Gruppen bevorzugen eine Ruhe Tag für die Konsolidierung, den Trainingsprozess zu unterstützen.
3. Forced-Choice-Test
   1. Reinigen Sie die Treppe Box mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung.
   2. Nehmen Sie die Treppe und füllen die Vertiefungen auf jedem Schritt auf der linken Treppe mit acht (ersten drei Tagen des Moduls) oder vier (konsekutiv three Tage der Baugruppe) 45 mg Pellets.
      1. Führen Sie die Zwangs-Choice-Test auf der Seite, wo die Wertminderung eintritt.
         Hinweis: Wir haben die Parkinson-Läsion auf der rechten Hemisphäre durchführen und deshalb trainieren selektiv die linke Pfote.
   3. Legen Sie die Ratte in der Transportkiste.
   4. Transportieren Sie die Ratte von zu Hause Käfig zur Treppe Feld mit der Transportbox.
   5. Legen Sie die Ratte in der Treppe Feld.
   6. Nach fünf Minuten das Tier von der Treppe Feld entfernen und es in den Käfig mit der Transportbox setzen.
   7. Beachten Sie, wie viele Pellets wurden von der linken Treppe gegessen.
   8. Füllen Sie die Treppe durch Auffüllen der Vertiefungen auf jeder Stufe mit acht oder vier 45 mg-Pellets (Anzahl der Pellets hängt von Trainingstag).
   9. Reinigen der Treppe Feld mit einer 0,1% igen Essigsäurelösung für das nächste Tier.
   10. Wiederholen Sie diesen Vorgang (erzwungene Wahl Phase) werden sechs Tage in einer Reihe.
4. Datenerfassung
   1. Führen Sie das Experiment, wie für die erzwungene Wahl Modul (vier Pellets in jeder Vertiefung auf der linken Treppe) an zwei aufeinander folgenden Tagen beschrieben. Berechnen Sie die Erfolgsquote (Anzahl der Pellets gegessen) als Mittel der zwei Tage.

Ergebnisse

Alle Tiere wurden einer post mortem histologische Überprüfung sowohl der dopaminergen Läsion und der Elektroden Lage. Nur Tiere korrekte Platzierung der Elektroden im Inneren des STN (Abbildung 6) und vollständige dopaminerge Läsion (> 90% Verlust von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra) in den Ergebnisteil (Abbildung 7).

Der Zylindertest unter lädierten Zustand durchgeführ...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Trainingsprotokoll für den Zylinder und Treppentest. Letzteres ist so konzipiert , komplexe Greifverhalten und feinmotorische Bewegung zu beurteilen aufgrund qualifizierte ^16,17 bei Ratten zu erreichen. Das Ergebnis Messung wird als Anzahl von Pellets während des Tests gegessen ausgedrückt, die eine objektive Messung ist. Das Protokoll kann in Rattenmodellen der Parkinson-Krankheit und anderen Motorkrankheitsmodellen verwendet werden. Der Zylinder Test beinhaltet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Staircase box without lid	Glas Keil, Germany		custom made
Cylinder box	Glas Keil, Germany		custom made
Dustless precision pellets, 45 mg	Bio Serv	F0021