Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Zusammenfassung

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Zusammenfassung

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Einleitung

Telomere schützt Chromosomenenden von anomalen Fusion und Abbau. Mammalian Telomer besteht aus G-reichen hexameren wiederholt, TTAGGG und Shelterin Komplexe. Die telomere Wiederholungssequenz des Nematoden ist ähnlich zu denen von Säugetieren (TTAGGC). Die meisten Eukaryoten nutzen Telomerase Telomerwiederholungen zu ihrer chromosomalen Enden hinzufügen. Allerdings, 10 - 15% der Krebszellen nutzen Telomerase unabhängigen Mechanismus, bekannt als Alternative Verlängerung von Telomeren (ALT) ^3. Zuvor berichteten wir , dass Telomerwiederholungen und die damit verbundenen Folgen, wie TALT genannt, in den Telomeren der Telomerase Mutantenlinien verstärkt wurden , die ^zwei kritische Sterilität überlebt.

Telomerlänge wurde durch quantitative PCR oder durch Southern - Blot gemessen, die ^4,5,6,7 durchschnittliche Länge von insgesamt Telomere zur Verfügung stellt. Lesen Anzahl der Telomer - Repeat in Genomsequenzierungsdaten ist auch ein Indikator für insgesamt Telomer Inhalt ^8. Obwohl Single Telomerlänge Analysis (STELA) könnte die Länge eines einzelnen Telomere liefern, es ⁹ räumliche Informationen der Telomere nicht zur Verfügung stellen kann. Während POT-1 :: mCherry Reporterprotein die räumliche Information der Telomere in vivo liefert, kann sie nicht Längen von doppelsträngigen Telomere darstellen, als POT-1 ein Einzelstrang ist Telomer - bindendes Protein ^10.

Während zuvor genannten Verfahren der gemittelten Daten von repetitiven Sequenzen bereitzustellen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht , die Menge und räumlichen Muster von individuellen Sequenzen von Interesse auf einer chromosomalen Skala zu beobachten. Anstelle der Reinigung von DNA werden Gewebe oder Zellen fixiert die native räumliche Informationen in FISH zu bewahren. Somit ist FISH eine sowohl quantitative als auch qualitative Werkzeug zur Beobachtung der einzelnen Wiederholungssequenzen, wie beispielsweise Telomerwiederholungen.

Dieses Protokoll liefert ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Nachweis beider teloC. bloße und andere Wiederholungen von zuvor beschriebenen Methoden ^11,12 auf Verbesserungen basieren. elegans Larven oder Erwachsene sind vielzelligen Organismus mit hoch differenzierten Zellen. Die Heterogenität von Zellen hemmt auf die quantitative Analyse einer großen Anzahl von Telomer Flecken. Um die Anzahl der analysierten Zellen zu maximieren, Embryonen isoliert und verteilt auf die Polylysin-beschichteten Objektträger für die Fische. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch mit Immunofluoreszenz kombiniert werden.

Als Beweis dafür, dass das Protokoll funktioniert, zeigen wir, dass es möglich ist, zwei unterschiedliche repetitive Sequenzen zu beobachten und zu quantifizieren. DNA-Sonde gegen TALT1 wurde erzeugt mit einfachen PCR-Digoxigenin-dUTP enthält. Dann ist diese TALT1 Sonde und Fluoreszenz-markierten Telomere PNA-Sonde wurden gleichzeitig hybridisiert. Anschließend wurde Digoxigenin durch kanonische Immunofluoreszenz Methoden nachgewiesen. Wir stellen Ihnen hier die repräsentativen Bilder , in denen TALT1 mit der Telomere in trt-1 kolokalisiert Überlebenden.

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Protokoll

1. Markierung von Sonden mit Digoxigenin-dUTP durch PCR

1. Führen Sie die PCR - Markierung mit 10x dNTP - Mix enthält Digoxigenin-dUTP wie zuvor ¹³ beschrieben.
2. Reinige PCR-Produkt mit Spin-Säulenreinigung nach Herstelleranleitung.
   1. Wenn die Sonde kürzer als 200 bp ist, entfernen freie Digoxigenin-dUTP mit Spin-Säulenchromatographie aus der Reaktionsmischung statt Spin-Säulenreinigung.

2. Vorbereitung Polylysin beschichteten Objektträger

Anmerkung: Die gesamte Prozedur dauert etwa 2 Stunden. Die meisten Schritte werden bei Raumtemperatur mit Ausnahme der Trocknungsschritt durchgeführt.

1. Die Reinigung der Folien
   1. Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter und spülen Sie die Objektträger kurz mit destilliertem Wasser (DW). Entfernen Sie das Wasser und füllen Sie den Behälter mit DW 1% Glasreiniger enthalten.
   2. Agitieren die Objektträger für 15 min bei 50 UpM bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Folien mit DW 3mal für 5 min bei RT jeweils.
   3. Waschen der Objektträger mit 70% Ethanol für 15 min unter Rühren. Entsorgen Sie 70% Ethanol und Objektträger auf einem 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 15 min.
2. Polylysin Beschichtung von Multi-Well-Objektträger aus Glas
   Hinweis: Polylysin Beschichtung von Glasobjektträger ist ein wichtiger Schritt, da es die Probe Adhäsion während des gesamten Färbeverfahrens liefert. Unzureichend beschichtete Folie in der Probenverlust führen wird.
   1. Verdünne die Polylysin-Stammlösung auf 0,01% (w / v) in destilliertem Wasser. Geben Sie 20 & mgr; l der verdünnten 0,01% (w / v) Polylysin in die Vertiefungen einer sauberen Glasobjektträger.
   2. Inkubieren Sie die Objektträger aus Glas für 5 min bei RT.
   3. Legen Sie die Dias auf einer 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 1 Stunde.
   4. Bewahren Sie die Polylysin Folien in der staubfreien Feld.

3. Fixierung von Worms auf dem Folie-Glas (Abbildung 1)

1. Vorbereiten von Embryonen für FISH
   Hinweis: Ernte Würmer vor allem ter bakterielle Nahrung wird durch die Beobachtung der Wachstumsmedien unter dem Mikroskop verbraucht. Starvation reduziert Eierproduktion von erwachsenen Würmer und erhöht Ei schlüpft. Detaillierte Verfahren sind in ^14,15 beschrieben.
   1. Wachsen die Würmer in 50 mm Petrischale nach Standardverfahren ^14.
   2. Nachdem das gesamte bakterielle Nahrung verbraucht wird, schneiden Sie die Agar-Medien in Quartal mit Spachtel. Sterilisieren Sie den Spachtel vor dem Schneiden eine Kontamination zu verhindern.
   3. Legen Sie die gesamte Stück Agar auf der 100 mm Nematoden Nährmedien (NGM) Platte. Drehen Sie den Agar Stück den Kopf für die Würmer die frische Bakterien Nahrung zu erreichen.
   4. Nach 48 bis 72 Stunden, die Würmer mit M9-Puffer zu sammeln. In 3 bis 5 ml M9-Puffer auf der NGM-Platte. Pipette M9-Puffer auf der Oberfläche der NGM die Würmer zu waschen.
   5. Sammeln Sie die Flüssigkeit mit Würmern und fügen Sie in ein 15-ml-Tube.
      Hinweis: Wenn es Agar Trümmer nach der Ernte, Zentrifuge die Würmer in einer 30% igen Saccharoselösung. Während Trümmer pelletiert werden, Würmer schwimmen aufdie Oberfläche.
   6. In M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie die meisten der M9-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male.
      Hinweis: Wenn die Würmer noch nach dem Zentrifugieren schwimmend, stellen die Bremse Niveau der Zentrifuge = 1 zu bewerten.
   7. Absaugen M9-Puffer. Hinzufügen Bleichlösung auf die Würmer. Pro 0,5 ml Würmer, 6,5 ml DW, 2 ml Hypochlorit, 1 ml 5 M KOH hinzu.
   8. Inkubiere die Würmer mit 3 min bei 50 Upm bei RT rocking. Vortex Würmer für 15 Sekunden, um mechanisch die Würmer abzuscheren und die Eier aus.
   9. Beachten Sie die Röhre unter einem Präpariermikroskop während der Bleiche. Stellen Sie sicher, dass Würmer in zwei Hälften geschnitten und Eier freigesetzt werden. Wenn die meisten der erwachsenen Körper gelöst ist, fügen M9 Puffer das Volumen auf 15 ml zu bilden.
   10. Zentrifuge bei 300 × g für 3 min. Aspirieren die meisten der M9 und fügen Sie frisches M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Wiederholen Waschschritt 3 mal.
       Hinweis:Vermeiden Sie übermäßige Menge an Würmer verwenden, da sie den Bleichprozess behindern. Halten Sie die Gesamtreaktionszeit von weniger als 8 Minuten, bis die Wäsche. Über gebleichten Eier produzieren starke Autofluoreszenz.
   11. In phosphatgepufferter Salzlösung mit Polysorbat-20 (PBST) bis zu 200 & mgr; l und 200 & mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) 2% PFA zu machen.
       Achtung: Da PFA krebserregend ist, tragen Schutzkleidung, Handschuhe und Augenschutz vor PFA.
   12. In 40 ul der Eier in 2% PFA auf den gut Polylysin beschichteten Folie.
   13. Legen Sie die Folien in einer feuchten Kammer und Inkubation für 15 min bei RT. Schließen Sie die feuchte Kammer direkt nach dem die Dias nach innen gesetzt werden.
       Hinweis: Die Eier an der Unterseite des Schlittens absetzen, während fixiert wird.
2. Vorbereiten seziert Gonaden für FISH
   1. Ernte erwachsenen Würmer auf 50 mm NGM Platte gewachsen durch Pipettieren 1 ml M9-Puffer. Ernte Würmer vor Bakterien Nahrung ist erschöpft.
   2. Waschen Sie die Würmer aus allen Bakterien Witzh M9-Puffer, 2 Mal.
      Hinweis: Rest Anhaften von Bakterien an Polylysin beschichteten Objektträger mit den seziert Gonaden stören können.
   3. Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 x g. Entfernen M9 und übertragen Sie die Würmer auf die leere NGM Platte von Mikropipette.
   4. In 30 ul M9-Puffer, der 2 mM Levamisol auf einem gut Polylysin behandelten Folie.
   5. Hinzufügen 500 ul M9-Puffer auf eine 1-ml-Röhrchen. Verwenden Sie diese Puffer die Würmer durch den Mund Pipette zu übertragen.
   6. Füllen Sie die Spitze des Mundpipette mit M9-Puffer durch eine Kapillare in der 1-ml-Röhrchen Platzieren der M9-Puffer enthält.
   7. Unter Binokular, legte die Spitze Mund Pipette direkt vor dem Kopf der erwachsenen Wurm und ziehen Mund Pipette so dass der Kopf von Würmern die Pipette den Mund gelangt. Sobald der Kopf von Würmern in die Spitze eintritt, wird der gesamte Körper der Wurm in die Spitze gezogen werden.
   8. Übertragen Sie die Würmer an die Polylysin beschichteten Objektträger mit Mund Pipette.
   9. Mit einer Rasierklinge geschnitten vonf den Kopf oder die Spitze des Schwanzes von Würmern auf der Folie. Wenn der Wurm geschnitten wird, erscheint die Gonaden aus. Gonaden wird auf den Folien kleben.
      1. Bereiten Sie mindestens 30 Würmer in einem gut. Weitere Brunnen kann für weitere 30 Würmer verwendet werden.
   10. Legen Sie die Folie in der feuchten Kammer und absaugen M9-Puffer mit Mund Pipette aus.
   11. Fixieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 ul 2% PFA bei RT für 15 min in der feuchten Kammer.

4. Fixierung und Permeabilisierung

1. Platzieren Sie ein Aluminiumblock auf Trockeneis und speichern sie in einem Tiefkühlschrank (-80 ° C). Store Methanol und Aceton in -20 ° C.
2. Nach PFA Fixierung Schritt 3.1.15 oder 3.2.11, entfernen Fixiermittel mit Mikro verlassen ~ 5 ul des Fixiermittel.
3. Mit anderen Polylysin beschichtete Folie auf dem Probenträger. Entfernen Sie die Fixiermittel mit einem Papiertuch, wenn die Lösung zu hoch ist. Sie nicht, die Dias zu bewegen, sobald sie aneinander haften.
4. Frieren Sie die Folienauf dem Aluminiumblock mindestens 15 min.
   Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage.
5. Während die Folien eingefroren werden, setzen die Gläser kaltes Methanol und Aceton auf Eis enthält.
6. Nehmen Sie die Folien aus und drehen sie die Probe zu gefrier knacken. Entsorgen Sie die obere Folie. einweichen sofort die Folie in die eiskalten Methanol für 5 min.
7. Die Objektträger in eiskaltem Aceton für 5 min.
8. Waschen Sie die Folien 3-mal mit PBST für 5 min Rest Fixiermittel zu entfernen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder speichern Sie die Folien in 100% Ethanol bei 4 ° C.
   Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage.

5. Die Hybridisierung von fixierten Zellen

1. Geben Sie 20 & mgr; l RNase-Lösung (PBST 10 ug / ml RNase A enthält). Inkubiere die Folie in der feuchten Kammer bei 37 ° C für 1 Stunde.
2. Waschen Sie die Folie zweimal in 2x Kochsalzlösung und mit Natriumcitrat Polysorbat-20 (2x SSCT) für 15 min jeweils.
3. In 20ul Hybridisierungslösung und setzen Sie die feuchte Kammer in den Inkubator 37 ° C. Nach 1 Stunde, entfernen Sie die Hybridisierungslösung durch Pipettieren.
4. Vor Hybridisierungslösung zu entfernen, bereiten Sie die Sonde. Wenn die Sondendoppelstrang-DNA ist, denaturieren die Sonden durch Erhitzen bei 95 ° C für 5 min auf einer trockenen Block. Nach dem Erhitzen kühlen, um die Sonde auf Eis kurz.
5. Zugabe von 10 & mgr; l Hybridisierungslösung Sonden an die Probe enthält. Für PNA-Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 2000 und für die DIG-markierte Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 200. Decken Sie die Probe mit Deckglas.
6. Setzen Sie ein Papiertuch mit Wasser auf dem Wärmeblock getränkt (80 ° C). Legen Sie eine Kunststoff-Box Abdeckung auf dem Wärmeblock die Feuchtigkeit und die Temperatur zu erhalten.
7. Nachdem die Temperatur des Wärmeblocks (bis 80 ° C) stabilisiert hat, stellen Sie den Probenträger auf dem erhitzten Papiertuch und decken die Proben mit dem Kunststoff-Box-Abdeckung. Denaturieren die Probe für 3 min.
8. IncUbate die Folien in einer feuchten Kammer über Nacht bei 37 ° C.

6. Wäscht und Immunofluoreszenz

1. Warm up der Hybridisierungswaschlösung (2 × SSC, 50% Formamid) bis 37 ° C.
2. Waschen Sie die Probe in dem PBST zweimal bei RT für 5 min. Entfernen Sie das Deckglas.
3. Waschen Sie die Probe in Hybridisierungswaschlösung bei 37 ° C für 30 min.
4. Waschen Sie die Probenträger in PBST 3 mal bei RT. Hinweis: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in feuchten Kammer bei RT.
5. In 20 ul Blockierungslösung und Inkubation für 1 h bei RT in der feuchten Kammer.
6. Entfernen Blockierungslösung und fügen FITC konjugiertem anti-Digoxigenin-Antikörper-Lösung (1: 200) für 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C.

7. Montage und Beobachtung

1. Waschen Sie den Probenträger mit PBST 2-mal für jeweils 15 min.
2. In 10 ul Lösung mit DAPI Montage. Legen Sie das Deckglas und drücken Sie vorsichtig. Entfernen Sie überschüssige Lösungmit einem Papiertuch.
3. Zum Verdampfen von Montagelösung, die Ränder des Deckglases mit Nagellack verhindern.
4. Beobachten Sie unter konfokalen Mikroskop. Ausschließen Embryonen mit hohem Hintergrund. Konzentrieren Sie sich auf ein Feld mit 4 - 20 Kernen.
5. Nehmen Sie Bilder nach den Anweisungen des Herstellers mit 100X Objektiv.
   Hinweis: Excite Probe mit 405-nm-Laser für DAPI, mit 555-nm-Laser für cy3, mit 488-nm-Laser für FITC.

8. Quantifizierung der Telomere Signal

Anmerkung: Die Quantifizierung erfolgte wie zuvor beschrieben ^16. Alle Bilder, die verglichen werden sollte mit derselben Einstellung einschließlich Belichtungszeit und Lichtquelle genommen werden.

1. Exportieren Sie das Bild in .tif-Format.
2. Downloaden und die Bildanalyse-Software zu installieren.
3. Führen Sie die Bildanalyse-Software und klicken Sie stimmen Taste.
4. Klicken Sie auf Öffnen-Taste. Öffnen Sie die Bilder mit Telomer FISH durch einen Doppelklick auf die Bilddatei.
5. Klicken[Bearbeiten] - [select Verarbeitungsbereich], wählen Sie eine Region von Interesse mit der linken Maustaste und ziehen. Ausschließen alle die nicht-spezifische Färbung.
6. Klicken Sie auf [Maßnahme] - [optischen Dichten vor Ort], wählen Sie den Kanal mit Telomer-Signal und geben Sie den Dateinamen, um die Ergebnisse in TXT-Datei zu speichern.
   Hinweis: Die Spalte der Ergebnisse sind in der folgenden Reihenfolge: Fluoreszenz von Spot, Hintergrund-Intensität von Spot und Bereich der Stelle.
7. Kopieren Sie die Werte und subtrahieren Hintergrund Intensität der Spot von Fluoreszenz von Spot. Die Werte können nun statistisch ausgewertet werden.

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Ergebnisse

Es wurde bereits berichtet , dass ALT Überlebende von Telomerase-defiziente Mutante entstehen kann, trt-1 (ok410), in niedriger Frequenz durch Replizieren intern lokalisierte 'Vorlage von ALT (TALT) Sequenzen für Telomererhaltung ^2. Mit PNA - Sonde konnten wir Telomere in den sezierten Gonaden (2A) zu visualisieren. Das schwache Telomer - Signal wurde sowohl in trt-1 (ok410) und ALT Überlebende entdeckt. Die Fuzzy-Signal wurde überlap...

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Diskussion

Der Hauptvorteil unserer Protokolls ist die Einfachheit des Verfahrens ohne nennenswerte Beschädigung der Morphologie der Zellstruktur. Wurden mehrere Schritte für C optimiert elegans FISH in diesem Protokoll. Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche FISH umfassen Kennzeichnung von Sonden, die Fixierung von Embryonen und Penetration. Digoxigenin-dUTP Markierungsverfahren bietet eine einfach zu bedienende Markierungsverfahren durch PCR oder Nick-Translation. Zur Kennzeichnung wird lange Ziel...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2x SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT			2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502