Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumo

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Resumo

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introdução

Telômeros protege as extremidades cromossômicas de fusão e degradação aberrante. dos telómeros de mamífero é composto de repetições rico em G hexaméricas, TTAGGG, e complexos shelterin. A sequência do telómero repetição da nemátodo é semelhante aos dos mamíferos (TTAGGC). A maior parte dos eucariotas utilizam telomerase para adicionar repetições telómeros para as suas extremidades cromossómicas. No entanto, de 10 - 15% de células de cancro utilizam mecanismo independente da telomerase, conhecido como Alongamento Alternativa dos telómeros (ALT) ^3. Anteriormente, relatou que repete a telómeros e suas sequências associados, nomeados como tAlt, foram amplificados nos telômeros de linhas mutantes de telomerase que sobreviveram a esterilidade crítica ^2.

Comprimento dos telómeros foi medida por PCR quantitativo, ou por transferência de Southern, o que proporciona o comprimento médio do total de telómeros ^4,5,6,7. Contagem lida da repetição dos telômeros em dados de sequenciamento do genoma inteiro é também um indicador do total conteúdo dos telômeros ^8. embora Single telômero Comprimento Análise (STELA) poderia fornecer o comprimento de uma única telômeros, ele não pode fornecer informação espacial dos telômeros ^9. Enquanto POT-1 :: proteína repórter mCherry fornece a informação espacial dos telômeros in vivo, não pode representar comprimentos de telômeros de cadeia dupla, como POT-1 é um single-filamento de proteína ¹⁰ de ligação dos telômeros.

Embora os métodos acima mencionados fornecer as informações média de seqüências repetitivas, hibridização fluorescente in situ (FISH) permite observar a quantidade e padrão espacial das seqüências individuais de interesse em uma escala cromossômica. Em vez da purificação do ADN, os tecidos ou as células são fixadas para preservar a informação espacial nativa em peixes. Assim, o peixe é uma ferramenta quantitativa e qualitativa para a observação de sequências de repetição individuais, como repete a telómeros.

Este protocolo fornece um método eficiente para a detecção simultânea de ambos telomeros e outras repete com base em melhorias de métodos anteriormente descritos ^11,12. C. elegans larvas ou adultos são organismo multicelular com células altamente diferenciadas. A heterogeneidade das células impede-se na análise quantitativa de um grande número de pontos a telómeros. Para maximizar o número de células analisadas, os embriões são isolados e espalhe sobre as lâminas revestidas com polilisina para os peixes. Além disso, este protocolo pode também ser combinada com a imunofluorescência.

Como uma prova de que o protocolo funciona, mostram que é possível observar e quantificar duas sequências repetitivas diferentes. sonda de DNA contra TALT1 foi gerado com simples PCR incorporando digoxigenina-dUTP. Em seguida, esta sonda TALT1 e sonda PNA telômero marcados com fluorescência foram hibridizadas simultaneamente. Subsequentemente, digoxigenina foi detectada por métodos de imunofluorescência canónicas. Apresentamos aqui as imagens representativas onde TALT1 colocalized com o telômero no TRT-1 sobreviventes.

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Protocolo

1. As sondas de marcação com digoxigenina-dUTP por PCR

1. Realizar etiquetagem 10x PCR com mistura de dNTP contendo digoxigenina-dUTP como previamente descrito ^13.
2. Purificar produto de PCR com a purificação spin-coluna de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Se a sonda é mais curto do que 200 pb, remover livre digoxigenina-dUTP por cromatografia em coluna de spin-a partir da mistura reaccional em vez de purificação de spin-coluna.

2. Preparar Slides polilisina revestido

Nota: O procedimento completo demora cerca de 2 horas. A maior parte dos passos são realizados à temperatura ambiente excepto para o passo de secagem.

1. Limpeza das lâminas
   1. Colocar as lâminas em um recipiente plástico e enxaguar as lâminas brevemente com água destilada (DW). Remover a água e encher o recipiente com DW contendo 1% de limpa-vidros.
   2. Agita-se as lâminas durante 15 minutos a 50 rpm à temperatura ambiente (TA). Lavar as lâminas com DW 3vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
   3. Lavam-se as lâminas com etanol a 70% durante 15 min com agitação. Descartar 70% de etanol e colocar as lâminas sobre um bloco seco de 65 ° C e secar ao ar durante 15 min.
2. polilisina revestimento de lâminas de vidro multi-poços
   Nota: revestimento polilisina de vidro corrediça é um passo importante, uma vez que prevê a adesão da amostra durante todo o processo de coloração. Mal lâmina revestida irá resultar na perda de amostra.
   1. Dilui-se a solução stock de polilisina a 0,01% (w / v) em água destilada. Adicionar 20 ul da diluído a 0,01% (w / v) de polilisina para os poços de uma lâmina de vidro limpa.
   2. Incubar a lâmina de vidro durante 5 min à TA.
   3. Colocar as lâminas em um bloco seco a 65 ° C e ar seco durante 1 h.
   4. Armazenar os slides polilisina na caixa livre da poeira.

3. Fixação de Worms na lâmina de vidro (Figura 1)

1. Preparando embriões para FISH
   Nota: vermes Colheita antes de tudo tele comida bacteriana é consumida por assistindo os meios de crescimento sob o microscópio. A fome reduz a produção de ovos de vermes adultos e aumenta a eclosão dos ovos. Métodos pormenorizados são descritos em ^14,15.
   1. Cresça os vermes em 50 mM de placa de Petri de acordo com métodos padrão ^14.
   2. Depois de toda a comida bacteriana é consumido, cortar o ágar no trimestre com uma espátula. Esterilizar a espátula antes de cortar para evitar a contaminação.
   3. Coloque todo o pedaço de agar na 100 milímetros meios de crescimento de nematóides (NGM) placa. Vire a peça agar de cabeça para baixo para os vermes para alcançar a comida bacteriana fresca.
   4. Após 48 a 72 horas, recolher os vermes com tampão M9. Adicionar 3 - 5 ml de tampão M9 na placa NGM. Pipeta tampão M9 na superfície de NGM para lavar os vermes.
   5. Recolhe-se o líquido com vermes e adicionar a um tubo de 15 ml.
      Nota: Se houver resíduos agar após a colheita, centrifugar os vermes em uma solução de sacarose 30%. Enquanto os detritos são sedimentadas, vermes flutuar sobrea superfície.
   6. Adicionar tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml. Agregar as minhocas por centrifugação a 300 xg durante 3 min e remover a maior parte do tampão M9. Repita este passo mais 2 vezes.
      Nota: Se os vermes ainda estão flutuando após a centrifugação, defina o nível de freio da centrífuga para o valor = 1.
   7. Aspirar tampão M9. Adicionar solução de branqueamento para os vermes. Por 0,5 ml de vermes, adicionar 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 mL de 5 M KOH.
   8. Incubar os vermes com agitação à TA durante 3 min a 50 rpm. vermes vortex durante 15 segundos para cortar mecanicamente os vermes e expor os ovos.
   9. Observe o tubo sob um microscópio de dissecção durante o clareamento. Certifique-se de que os vermes são cortadas ao meio e os ovos são liberados. Quando a maior parte do corpo adulto é dissolvido, adicione tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml.
   10. Centrifugar a 300 xg durante 3 min. Aspirar a maior parte da M9 e adicionar tampão M9 fresco para fazer aumentar o volume para 15 ml. etapa de lavagem Repita 3 vezes.
       Nota:Evitar o uso de quantidade excessiva de vermes, em que dificultam o processo de branqueamento. Manter o tempo de reacção total a menos de 8 minutos até a lavagem. Over-branqueada ovos produzem forte autofluorescência.
   11. Adicionar solução salina tamponada com fosfato de polissorbato-20 (PBST) até 200 uL e 200 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) para tornar a 2% de PFA.
       Atenção: Desde PFA é cancerígeno, usar vestuário de protecção, luvas e proteção ocular antes de utilizar PFA.
   12. Adicionar 40 ul de os ovos em 2% de PFA para o poço de polilisina revestida slides.
   13. Colocar as lâminas numa câmara húmida e incubar durante 15 min à TA. Feche a câmara úmida logo após os slides são colocados dentro.
       Nota: Os ovos para liquidar o fundo de slides enquanto está a ser corrigido.
2. Preparando gônadas dissecados para peixes
   1. Colheita vermes adultos crescidos em 50 mm placa NGM pipetando 1 ml de tampão M9. vermes colheita antes de alimentar bacteriana está esgotada.
   2. Lave os vermes a partir de qualquer wit bactériash tampão M9, 2 vezes.
      Nota: as bactérias residuais podem interferir com as gônadas dissecados de degola para lâminas de polilisina revestido.
   3. Agregar as minhocas por centrifugação a 300 x g. Remover M9 e transferir os vermes à placa NGM vazia por micropipeta.
   4. Adicionar 30 mL de tampão M9 contendo levamisole 2 mM em um poço de polilisina tratada slide.
   5. Adicionar 500 ul de tampão M9 para um tubo de 1 ml. Utilize este tampão para transferir os vermes com uma pipeta boca.
   6. Encher a ponta da pipeta de boca com tampão M9 pela colocação de um capilar no tubo 1 ml contendo o tampão M9.
   7. Sob microscópio de dissecação, coloque a ponta da pipeta na boca apenas na frente da cabeça do verme adulto e arraste pipeta de boca de modo que a cabeça de vermes entra na pipeta de boca. Uma vez que a cabeça de vermes entra a ponta, todo o corpo de verme serão atraídos para a ponta.
   8. Transfira os vermes para o slide polilisina revestido usando pipeta boca.
   9. Usando uma navalha, corte def a cabeça ou a ponta da cauda de vermes no slide. Quando o worm é cortado, as gônadas irá aparecer. Gônadas vai ficar com os slides.
      1. Preparar pelo menos 30 vermes em um poço. Mais poços pode ser usado por mais 30 vermes.
   10. Coloque a lâmina na câmara húmida e aspirar o tampão de M9 com pipeta de boca.
   11. Fixar a amostra por adição de 20 ul de 2% de PFA à TA durante 15 minutos em câmara húmida.

4. Fixação e permeabilização

1. Coloque um bloco de alumínio em gelo seco e armazená-lo em um congelador (-80 ° C). metanol loja e acetona em -20 ° C.
2. Após PFA passo de fixação 3.1.15 ou 3.2.11, remova o fixador usando micropipeta deixando ~ 5 mL do fixador.
3. Coloque outro slide polilisina revestido na lâmina de amostra. Remover o fixador com toalha de papel, se a solução for excessiva. Não mova os slides uma vez que eles estão presos juntos.
4. Congelar as lâminassobre o bloco de alumínio de pelo menos 15 min.
   Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias.
5. Enquanto os slides estão sendo congelados, coloque os frascos contendo metanol frio e acetona em gelo.
6. Tome os slides fora e torcê-los a congelar-rachar a amostra. Descartar a corrediça superior. mergulhar imediatamente o slide para o metanol gelado durante 5 min.
7. Transferir as lâminas para acetona arrefecida em gelo durante 5 min.
8. Lavar as lâminas 3 vezes com PBST, durante 5 min para remover fixador residual. Avance para o próximo passo ou armazenar as lâminas em etanol a 100% a 4 ° C.
   Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias.

5. Hibridação de células fixadas

1. Adicionar 20 ul de solução de RNase (PBST contendo 10 ug / ml de RNase A). Incubar a lâmina na câmara húmida a 37 ° C durante 1 h.
2. Lava-se a corrediça duas vezes em solução salina e 2x com citrato de sódio polissorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada.
3. Adicionar 20ul de solução de hibridação e o colocar em câmara húmida a 37 ° C incubadora. Depois de 1 h, remover a solução de hibridação por pipetagem.
4. Antes de remover solução de hibridização, preparar a sonda. Se a sonda é DNA de cadeia dupla, desnaturar as sondas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min num bloco seco. Após o aquecimento, esfriar a sonda brevemente gelo.
5. Adicionar 10 ul de solução de hibridação contendo sonda com a amostra. Para sonda de PNA, a concentração de uso a uma razão de 1: 2000 e de uma sonda marcada com Dig, concentração de uso a uma razão de 1: 200. Cobrir a amostra com tampa de vidro.
6. Coloque uma toalha de papel embebido com água sobre o bloco de aquecimento (80 ° C). Coloque uma tampa de caixa de plástico no bloco de aquecimento para preservar a umidade e temperatura.
7. Depois de a temperatura do bloco de aquecimento se estabilizou (a 80 ° C), colocar a lâmina de amostra sobre a toalha de papel e aquecida cobrir as amostras com a tampa da caixa de plástico. Desnaturar a amostra durante 3 minutos.
8. IncUbate as lâminas em câmara úmida durante a noite a 37 ° C.

6. lavagens e Imunofluorescência

1. Aquecer a solução de lavagem de hibridação (SSC 2x, 50% de formamida) a 37 ° C.
2. Lava-se a amostra em duas vezes o PBST à TA durante 5 min. Retire a tampa de vidro.
3. Lava-se a amostra na solução de lavagem de hibridação a 37 ° C durante 30 min.
4. Lave a lâmina de amostra em PBST 3 vezes à temperatura ambiente. Nota: Execute todos os passos subsequentes na câmara húmida à temperatura ambiente.
5. Adicionar 20 ul de solução de bloqueio e incubar durante 1 h à TA na câmara húmida.
6. Remoção da solução de bloqueio e adicionar solução de anticorpo conjugado com FITC anti-digoxigenina (1: 200) durante 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.

7. Montagem e Observação

1. Lava-se a lâmina de amostra com PBST 2 vezes durante 15 minutos cada.
2. Adicionar 10 ul de solução de montagem com DAPI. Coloque a tampa de vidro e pressione suavemente. Remova qualquer excesso de soluçãocom uma toalha de papel.
3. Para evitar a evaporação da solução de montagem, selar as bordas da tampa de vidro com unha polonês.
4. Observar ao microscópio confocal. Excluir embriões com elevado ruído de fundo. Concentre-se em um campo com 4 - 20 núcleos.
5. Tome imagens de acordo com as instruções do fabricante com lente objetiva de 100X.
   Nota: Excite amostra com 405 a laser nm para DAPI, com 555 a laser nm para Cy3, com 488 a laser nm para FITC.

8. Quantificação dos Telómero sinal

Nota: A quantificação foi realizada tal como anteriormente descrito ^16. Todas as imagens que estão a ser comparadas deve ser tomado com mesma configuração, incluindo o tempo de exposição e uma fonte de luz.

1. Exportar a imagem em formato .tif.
2. Baixar e instalar o software de análise de imagem.
3. Executar o software de análise de imagem e clique no botão Concordo.
4. Clique no botão aberto. Abra as imagens com os peixes dos telômeros, clicando duas vezes no arquivo de imagem.
5. Clique[Editar] - [região de processamento seleção], seleccione uma região de interesse por clique com o botão esquerdo e arrastando. Excluir toda a coloração não específica.
6. Clique [medida] - [manchar densidades ópticas], selecione o canal com o sinal dos telômeros e digite o nome do arquivo para salvar os resultados no arquivo .txt.
   Nota: A coluna de resultados estão na seguinte ordem: A fluorescência de ponto, a intensidade da mancha e a área da mancha de fundo.
7. Copiar os valores e subtrair intensidade da mancha de fundo de fluorescência da mancha. Os valores podem agora ser analisados ​​estatisticamente.

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Resultados

Foi relatado anteriormente que o sobrevivente ALT pode emergir de mutante telomerase deficiente, TRT-1 (ok410), em baixa frequência, replicando localizada internamente 'Template da ALT' (tAlt) sequências para manutenção dos telômeros ^2. Usando sonda PNA, fomos capazes de visualizar os telômeros nas gônadas dissecados (Figura 2A). O sinal dos telômeros fraco foi detectado tanto no TRT-1 (ok410) e sobrevivente ALT. O sinal fuzzy...

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Discussão

A principal vantagem do nosso protocolo é a simplicidade do processo sem danos visíveis para a morfologia da estrutura celular. Vários passos foram otimizados para C. elegans FISH neste protocolo. Os passos críticos para os peixes de sucesso incluem a rotulagem de sondas, a fixação de embriões e penetração. método de marcação com digoxigenina-dUTP fornece um método de rotulagem de fácil utilização por PCR ou por nick-translation. Para rotular sequência alvo por muito tempo, é o preferido nick-...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2x SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT			2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502