Aggregate Größenoptimierung in Mikrotiterplattenvertiefungen für Abhänge-basierte Herz Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Herkömmliche Verfahren Aufhängungsaggregat Cardiac Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind geplagt mit Kultur Heterogenität bezüglich Aggregatgröße und Form zu initiieren. Hier beschreiben wir eine robuste Methode zur kardialen Differenzierung Mikrotitervertiefungen Verwendung Größe gesteuert erzeugen HPSC kultiviert Aggregate unter Herzfördernden Bedingungen.

Zusammenfassung

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Einleitung

In - vitro - Zellkultur kann unter einer Reihe von Modalitäten durchgeführt werden, sondern wird in der Regel entweder in zweidimensionalen adhärenten Bedingungen oder in der dreidimensionalen Suspension Bedingungen durchgeführt , die ausführlicher in vivo - Systemen rekapitulieren. Folglich gibt es in vielen Bereichen der Forschung eine wachsende Tendenz zur Erzeugung von dreidimensionalen Gewebekonstrukten robuste Verfahren zu entwickeln. In Szenarien , in denen Zelltypen und Prozesse erfordern eine unterstützende extrazelluläre Matrix (ECM) -Oberfläche und Adhäsion Signale, dreidimensionale Kultur kann über rüsteten Konstrukten aktiviert werden, in denen Zellen kultiviert werden , oder in einer exogenen Trägermatrix ^1. Die Zellen und Prozesse , die in erster Linie oder ausschließlich von Zellen (die ihre eigenen endogenen Matrizen zu erzeugen , können dann gehen) , zusammengesetzt in Suspension als unscaffolded Systeme erfolgen keine Haftung auf eine unterstützende Matrix erfordern , können ^2,3. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die kardiale Differenzierung of humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs - Stammzellen sind, mit einer Zelltyp im Körper immer, ob aus embryonalen oder anderen Quellen) in der Größe gesteuert, uniform, unscaffolded Aggregate.

Die Differenzierung der hPSCs als Suspension Aggregate wird durch große Schwankungen in der Aggregatgröße geplagt sowohl innerhalb eines Laufs und zwischen den Läufen. Diese Variabilität ist eine Folge des Verfahrens typischerweise diese Aggregate zu erzeugen, verwendet, die mechanische Dissoziation von Zellkolonien umfasst. Um diese Variabilität zu verringern, wurde eine Anzahl von Ansätzen verwendet, um die Anzahl der Zellen pro Aggregat zu steuern sowie Aggregatdurchmesser und der Gleichförmigkeit. Beispiele sind die Bildung von Aggregaten in Mikrozentrifugenröhrchen ⁴ oder als Hänge ⁵ Tropfen, Mikro definierten zweidimensionalen HPSC Kolonien ⁶ , die dann in Suspension überführt werden kann oder Zentrifugation von Zellen in U- oder V-Bodenplatten mit mehreren Vertiefungen ^{7,8, 9.} Jedoch sind alle diese ca.oaches zeichnen sich durch ihre geringen Durchsatz der aggregierten Generation beschränkt. Well-basierte Systeme verwenden einen ähnlichen Ansatz zur V-Bodenplatte Systemen ist jedoch die kleinere Größe der Mikrovertiefungen (in diesem Protokoll die jeweils eine Breite von 400 & mgr; m) ermöglicht die Erzeugung einer größeren Anzahl von gleichförmigen Aggregate aus einem einzigen Kulturplatte gut (Standarddurchmesser von ~ 15,5 mm enthält ~ 1200 Mikrotiterstreifen) als würden ¹⁰ von insgesamt V-Bodenplatte erzeugt werden. Nun basierte Aggregatbildung wurde in einer Reihe von Einstellungen , einschließlich der Differenzierung von hPSCs verwendet ¹¹ bis Ektodermale, endodermaler ^12, mesodermalen ¹³ und extraembryonic ¹⁴ Schicksale; Chondrogenese von mesenchymalen Stammzellen ^15; Erzeugung einheitlicher Substrate für toxikologische Screening ^16; und Untersuchungen von Mechanobiologie ^17.

Eine große Herausforderung bei der Entwicklung von robusten Fertigungs Protokolle für die Herstellung von HPSC abgeleiteten cardiomyocytes hat der Mangel an Reproduzierbarkeit der kardialen Differenzierung Effizienz zwischen den Läufen gewesen. Wir haben bereits gezeigt , dass diese Variabilität kann in der Start HPSC Bevölkerung Heterogenität zurückzuführen, die beide selbst erneuernden hPSCs und differenzierenden Zellen umfasst, die ^6,18 Gene im Zusammenhang mit Endoderm und neuronale Differenzierung zum Ausdruck bringen. Die Signale von diesen differenzierenden Zellen sezerniert Herz Induktion auswirken. Insbesondere fördert extraembryonic endoderm Herz Induktion, während neurale Vorläuferzellen Herz Induktion hemmen. Nach HPSC Aggregation Zellen innerhalb des Aggregats differentiate und zu organisieren , so dass undifferenzierten hPSCs sind durch eine Schicht aus extraembryonale Endoderm Zellen umgeben , die ¹³ auf der Gesamtoberfläche zu entwickeln. Durch Steuern Aggregatgröße kann man das Verhältnis von Herz induzierenden Endoderm Zellen undifferenzierte hPSCs (Oberfläche - zu - Volumen - Verhältnis) und Optimierung dieses Verhältnisses für eine maximale Herzinduktions ¹³ modulieren.

Protokoll

1. Herstellung von Mediumkomponenten

1. Bereiten Waschmedium. Pro 100 ml DMEM / F12, 1 ml 100x Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep), 1 ml 100x L-Glutamin und 5 ml Serumersatz.
2. Bereiten Sie die chemisch definierte Basal Cardiac Induktionsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Die folgenden Stamm Reagenzien für die Medien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
   1. L-Ascorbinsäure: Bereiten Sie eine Stammlösung von 5 mg pro ml in 4 ° C, steril ultrareinem destilliertem Wasser in einem konischen Rohr.
      1. Lassen Sie diese Lösung auf Eis und verwirbeln das Rohr regelmäßig, bis der gelöste Stoff vollständig gelöst ist. Filter-sterilisieren die Ascorbinsäure-Lösung eine 0,22 & mgr; m Spritzenfilter.
      2. Vorbereitung 1 ml Aliquots der Ascorbinsäure-Lösung und speichern diese Aliquots bei -20 ° C. Verwenden Sie ein frisch aufgetauten Aliquot jedes Mal Medium hergestellt wird.
   2. Am Tag der Medienherstellungs, 13 & mgr; l Monothioglycerin (MTG) in 1 ml Basal Cardiac Induktionsmedium verdünnen. Nicht verwendete, verdünnte MTG.
   3. Vorbereitung 1 ml Aliquots von Transferrin (30 mg / ml) bei -20 ° C zu speichern. Store-Aliquots für 3 Monate bei 4 ° C aufgetaut.
   4. Herstellung von 4 mM Salzsäure (HCl), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). In einem Abzug, fügen Sie 30 ul 6,0 N HCl-Lösung auf 50 ml ultrareinem destilliertem Wasser. Filter-sterilisieren die Lösung eines 0,22 & mgr; m Spritzenfilter. 2 ml 25% BSA-Lösung zu der Lösung 50 ml HCl.
   5. Bereiten Phosphate Buffered Saline (PBS), enthaltend 0,1% BSA. In 20 ul 25% BSA-Lösung pro ml PBS.
   6. Bereiten Sie Menschlicher Knochen morphogenetische Protein 4 (BMP-4) Stammlösung (10 ng / ul). Auflösen 10 ug lyophilisierte BMP-4 in 1 ml 4 mM HCl-Pufferlösung, enthaltend 0,1% BSA. Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern.
   7. Bereiten Menschliche Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (bFGF) Stammlösung(10 ng / ul). Auflösen 10 ug lyophilisierte bFGF in 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS), enthaltend 0,1% BSA. Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern.
   8. Bereiten Menschen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Stammlösung (5 ng / ul). Man löst 5 ug lyophilisierte VEGF in 1 ml PBS, enthaltend 0,1% BSA. Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern.
   9. Bereiten Sie Activin A-Stammlösung (10 ng / ul). Auflösen 10 ug lyophilisierte Activin A in 1 ml PBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern.
   10. Bereiten Sie Inhibitor der Wnt-Produktion-2 (IWP-2) Stammlösung (10 mM). Man löst 2 mg IWP-2 in 429 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). Herstellung von 10 & mgr; l-Aliquots bei -80 ° C zu speichern.
4. Bereiten Sie die komplette Cardiac Induktionsmedium. Zu 100 ml Basal Cardiac Induktionsmedium 1 ml 100x Pen / Strep, 1 ml 100x L-Glutamin, 500 & mgr; l Transferrin, 1ml frisch Ascorbinsäure aufgetaut, und 300 ul MTG. Nicht verwendete Medium.

2. Herstellung der Mikrotiterplatte

HINWEIS: Alle Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.

1. 0,5 ml Spüllösung (Kit-Komponente) zu jeder Vertiefung, die auf der Platte verwendet werden. Um sicherzustellen, dass die Lösung in Kontakt mit der gesamten Fläche innerhalb jeder Vertiefung, die Platte bei 840 × g für 2 min zentrifugiert.
2. Inkubiere die Platte für 30 bis 60 min bei RT.
3. Absaugen die Spüllösung aus den Brunnen. Waschen Sie sich gut zweimal wie folgt: 1 ml PBS in jede Vertiefung, Zentrifuge die Platte bei 840 × g für 2 min und dann auf die PBS absaugen.

3. Bildung von HPSC Aggregate in der Mikrotiterplatte

HINWEIS: Alle Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.

1. Legen Waschmedium in einem 37 ° C Wasserbad.
   HINWEIS: Das benötigte Volumen = 1 ml x Anzahl der Vertiefungen von hPSC, die getrennt werden wird.
2. Distanzieren hPSCs auf einzelne Zellen
   Hinweis: Diese Schritte beschreiben die Dissoziation von Zellen, die auf 6-Well-Platten - die Reagenzienvolumina für verschiedene Kulturformate proportional skaliert werden kann.
   1. Saugen Sie das Kulturmedium aus jeder HPSC Kultur gut für die Dissoziation. Spülen jede Vertiefung mit 1 ml der Dissoziation Enzym, und dann absaugen sofort die Dissoziation Enzym aus jeder Vertiefung.
      Hinweis: Rest Dissoziation Enzym sollte ausreichend sein, um die Zellen zu distanzieren.
   2. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 3 min.
   3. 1 ml Waschmedium zu jeder Vertiefung und mechanisch die Zellen aus dem Gewebekulturoberfläche dissoziieren durch Pipettieren des Waschmedium mit einem P1000 Mikropipetter über die Gewebekulturoberfläche. Wenn die Dissoziation erscheint an dieser Stelle unvollständig und Zellklumpen bleiben, passieren die Suspension durch ein Sieb sein.
   4. Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zu speicherndas Rohr in dem Inkubator während der Zellzahl wird in dem nächsten Schritt durchgeführt.
   5. Führen Sie eine Zellzahl:
      1. Nehmen Sie eine 10 ul Probe der Zellsuspension im vorherigen Schritt gesammelt. In 30 ul Trypanblau und gut mischen die Suspension durch Pipettieren.
      2. Übertragen Sie 10 ul Trypanblau gefärbten Zellen zu jeder Kammer eines Hämocytometer und zu visualisieren unter dem inversen Mikroskop mit dem 10X-Objektiv. Zählen Sie die Zellen.
   6. Aus den Zellzahl ergibt, zu berechnen , wie viele Brunnen können bei 1,2 x 10 ⁶ Zellen pro Vertiefung der Mikrotiterplatte ausgesät werden. Berechnen Aggregation Medium benötigt pro Vertiefung, die Zellen in 1 ml auf Saatgut.
   7. Bereiten Sie Aggregations Medium. Pro 10 ml vollständigen Herzinduktionsmedium, 0,5 ul BMP4-Stammlösung (Endkonzentration = 0,5 ng / ml) und Y-27632 ROCK-Inhibitor (Endkonzentration = 10 & mgr; M) hinzufügen.
   8. Entfernen Sie die konische Röhrchen, die hPSCs aus dem Inkubator und centrifu enthältge das Rohr bei 200 xg für 5 min. Absaugen Waschmedium und Resuspension der Zellen in Aggregations Medium bei einer Dichte von 1,2 x 10 ⁶ Zellen pro ml.
   9. Saugen Sie das PBS-Waschlösung aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte. Mit Hilfe eines P1000 Mikropipettierer gleichmäßig verteilen und Samen 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung auf der Mikrotiterplatte. Um eine große Anzahl von Vertiefungen Saatgut, vortexen periodisch die Zellsuspension zu verhindern Einschwingzeit.
   10. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 xg für 5 min. Beachten Sie die Platte unter dem Mikroskop zu bestätigen Zellen auf den Boden jeder Vertiefung gesponnen haben.
   11. Inkubiere die Platte für 24 Stunden bei 37 ° C in einem 5% CO _2, 5% O ₂ (hypoxisch) Inkubator.

4. Herz Induction Phase 1

1. Einen Tag nach Aggregation (Tag 1), bereiten Sie das erforderliche Volumen von Stufe 1 Induktionsmedium (für eine 24-Well-Platte, Volumen = 1 ml x Anzahl der Wells). Für 1 ml KomplettHerz-Induktionsmedium, fügen 1 ul BMP4-Stammlösung (Endkonzentration = 10 ng / ml), 0,5 ul bFGF-Stammlösung (Endkonzentration = 5 ng / ml) und 0,6 ul Activin A (Endkonzentration = 6 ng / ml). Legen Sie das Medium in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min.
2. Entfernen Sie die Mikrotiterplatte aus dem Inkubator. Überprüfen Sie die Aggregate unter dem Mikroskop. Im Vergleich zum unmittelbar nach der Zentrifuge Aggregation, sollten sie intakt mit glatten Rändern (runder und weniger Platz als am Vortag) erscheinen.
3. Entfernen Sie den Überstand ohne Störung der Aggregate innerhalb der Kavitäten:
   1. Halten Sie die Mikrotiterplatte horizontal Ebene (dh., Nicht verkanten). Für jede Vertiefung auf der Mikrotiterplatte, legen Sie die Spitze eines P1000 Mikropipetter an der Oberfläche des Kulturmediums und gegen den Rand des Brunnens.
   2. Langsam das Medium zu entfernen, man aufpassen, nicht die Aggregate am unteren Rand der Vertiefungen nicht zu stören. Nach Reduzierung ter mittlere Ebene auf etwa 1 bis 2 mm von der Mikrotiterplatten-Oberfläche strukturiert, kippen langsam das Plattenmedium an einer Seite des Brunnens zu sammeln (sobald das Volumen ausreichend niedrig ist, wird Fluidbewegung stark reduziert, und es ist einfacher, Aggregate vermeiden angehoben zu werden aus ihren einzelnen Mikrotitervertiefungen). Pipette langsam das restliche Medium in der gut.
4. frisch Stufe 1 Induktionsmedium hinzufügen, während die Aggregate in den einzelnen Kavitäten bleiben gewährleistet: Ziehe 1 ml Stufe 1 Induktionsmedium mit einem P1000 Mikropipetter. Halten der Pipettenspitze gegen die Innenkante des Schachts und sehr langsam das Medium gegen die Innenwand des Schachtes verzichtet werden kann. Wiederholen Sie für die verbleibenden Vertiefungen.
5. Bringen Sie die Platte in den Inkubator unter hypoxischen Bedingungen für 3 Tage.

5. Cardiac Induction Stufe 2

1. Am Tag 4 Ort Waschmedium (Volumen = Anzahl der Wells x 2 ml) in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min.
2. Bereiten Sie das notwendige Volumen von Stufe 2 Induktionsmedium (Volumen = Anzahl der Brunnen x 1 ml): Pro ml vollständigen Herzinduktionsmedium, fügen Sie 2 ul VEGF-Stammlösung (Endkonzentration = 10 ng / ml) und 0,5 ul IWP-2 Stammlösung (Endkonzentration = 5 & mgr; M). Legen Sie die vorbereitete Phase 2 Induktionsmedium in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min.
3. Mit einem 5 ml serologische Pipette, ernten die Aggregate aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte und sammeln die Aggregatsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen (sammeln bis zu 10 Wells pro 15 ml Tube).
4. Lassen Sie die Aggregate für 15 min in einem hypoxischen Inkubator zu begleichen.
   Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, einzelne Zellen und Zelltrümmer von den intakten Aggregate zu trennen.
5. Saugen Sie den Überstand sorgfältig und resuspendieren die Aggregate in 10 ml der vorgewärmten Waschmedium Rest induktive Cytokine zu entfernen (zB ist Activin A ein starkes Signal - Molekül auch bei sehr niedrigen concentrations).
6. Zentrifugieren Sie die Aggregate bei 50 × g für 2 min. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der pelletierten Aggregate in der vorgewärmten Induction 2 Medium.
7. Übertragen Sie die Aggregatsuspension auf eine 24-Well-Ultra-Low-Befestigung (ULA) Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Beachten Sie die Aggregate unter dem Mikroskop als einheitliche, feste Zellcluster. Inkubiere unter hypoxischen Bedingungen bis zum Tag 6.

6. Herz Induction Stufe 3

1. Am Tag 6, das notwendige Volumen von Stufe 3 Induktionsmedium (Volumen = Anzahl der Vertiefungen x 1 ml) herzustellen. Für 1 ml vollständigen Herzinduktionsmedium, fügen Sie 2 ul VEGF-Stammlösung (Endkonzentration = 10 ng / ml) und 0,5 ul bFGF-Stammlösung (Endkonzentration = 5 ng / ml). Vorbereitete Stufe 3 Induktionsmedium in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min.
2. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette die Aggregate auf 15 ml konischen Röhrchen zu übertragen, zu 10 ml Aggregat Pooling biss pro Röhrchen.
3. Warten Sie 10 min für die Aggregate zu begleichen. Den Überstand aspirieren und resuspendieren die Aggregate in die vorgewärmte Stufe 3 Induktionsmedium. Mit einem 5 ml serologische Pipette, verteilen die Aggregate in einer 24-Well ULA Platte mit 1 ml pro Vertiefung.
4. Am Tag 10 bereiten das notwendige Volumen von Stufe 3 Induktionsmedium (Volumen = Anzahl der Vertiefungen x 1 ml) gemäß Schritt 6.1.
5. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette die Aggregate auf 15 ml konischen Röhrchen zu übertragen, zu 10 ml Aggregate pro Röhrchen Pooling auf.
6. Warten Sie 10 min für die Aggregate zu begleichen. Den Überstand aspirieren und resuspendieren die Aggregate in Stufe 3 Induktionsmedium. Mit einem 5 ml serologische Pipette, verteilen die Aggregate in einer 24-Well ULA Platte mit 1 ml pro Vertiefung.
7. Inkubiere unter hypoxischen Bedingungen für zwei Tage. Am Tag 12 beginnen , für den Rest der Kulturzeit (37 ° C, 20% O _2, 5% CO ₂₎ der Zellen bei normoxischen Sauerstoffgehalt inkubiert.
   HINWEIS:Nach diesem Zeitpunkt werden die Zellen nicht kultiviert länger unter hypoxischen Bedingungen.
8. Wiederholen Sie diesen kompletten Austausch des Mediums (Schritte 6.2 und 6.3) alle 4 Tage, Tag, beginnend 14 bis Zellernte (in der Regel sind Spitzen Kardiomyozyten Konzentrationen für Tag beobachtet 14 der Differenzierung).

7. Durchflusszytometrie Analyse von Cardiac Troponin T (cTnT) Expression Häufigkeit der Mikrowell Kultur Output

1. Dissoziieren die Aggregate wie folgt:
   1. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette 1 gut von Aggregaten zu einem 15 ml konischen Röhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Aggregate bei 50 × g für 2 min und aspirieren vorsichtig den Überstand.
   2. 1 ml frisch gelöstes 1 mg / ml Kollagenase Typ II Lösung der Aggregate. Übertragung der Aggregatsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren die Aggregate in Kollagenase Typ II über Nacht bei Raumtemperatur.
   3. Am folgenden Tag, verwenden Sie einen P1000 Mikropipetter sanft die Aggregate zerfallenzu einer homogenen Einzelzellsuspension. Wenn die Aggregate nicht leicht dissoziieren, siedeln die Aggregate, die den Überstand aspirieren, und brüten die Aggregate in 700 ul Dissociation Enzym für 1 bis 2 Minuten bei RT. Pipette vorsichtig auf die Aggregate 1 bis 2 mal mit einem P1000 Mikropipetter zu distanzieren.
   4. Verdünnen Sie die Dissoziation Enzym: In 700 ul Waschmedium mit 14 & mgr; l von 1 mg / ml DNAse-Stammlösung. Nehmen Sie eine 10 ul Probe eine Zellzählung durchzuführen, und Zentrifuge die verbleibende Suspension mit einem Benchtop-Mikro bei 300 g für 2 min mit.
2. Führen Sie eine Zellzahl: Stain die 10 ul Zählprobe mit einem gleichen Volumen von Trypanblau und zählen eine Zählkammer.
3. Entfernen Sie die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen die verbleibenden Zellen aus dem Mikro enthält. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 200.000 bis 500.000 Zellen pro 100 & mgr; l, in Hanks Balanced Salt Solution, enthaltend2% Fetal Bovine Serum (HF).
4. Für jede Bedingung, dann 100 & mgr; l Zellsuspension pro Vertiefung 2 Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen (ein gut mit der cTnT Antikörper und der andere ist der sekundäre Antikörper-Kontrolle gefärbt werden).
5. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer mehrkanaligen Mikropipetter.
6. Fix die Zellen: Jeweils 200 ul Fixierungslösung (Kit-Komponente) pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 15 Minuten bei RT.
7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min. Verwenden Sie einen mehrkanaligen Mikropipetter zu den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen zurückziehen. Entsorgen Sie den Überstand in einem Paraformaldehydabfallbehälter.
8. Waschen Sie die fixierten Zellen zweimal: Jeweils 200 & mgr; l von HF zu jeder Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min. Den Überstand aspirieren, und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Die fixierten Zellen können bis zu einer Woche in HF bei 4 ° C gelagert werden.
9. Permeabilisierung der Zellen:
   1. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300· g für 2 min.
   2. 100 l Permeabilisierungs Solution (Kit-Komponente) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5 min.
   3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min und den Überstand aspirieren.
10. Vorbereiten eines Master-Mix anti-cTnT in HF bei der optimalen Konzentration für den gegebenen Chargennummer (Die optimale Verdünnung durch Titration bestimmt werden muss und typischerweise im Bereich von 1: 500 bis 1: 2000).
11. Für jede Bedingung (2 Wells pro Zustand), 100 & mgr; l Master-Mix in eine Vertiefung (gefärbte Probe) und 100 & mgr; l von einfachen HF mit dem anderen gut (sekundäre Antikörper-Kontrolle). Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 30 min.
12. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 2 min. Den Überstand aspirieren und fügen Sie pro Vertiefung 200 ul HF. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
13. Bereiten Sie einen Master-Mix des sekundären Antikörpers. Wird ein Volumen von HF, die für jeden gut (sekundäre Antikörperkontrolle zu 100 & mgr; l entspricht undcTnT-gefärbt) behandelt werden. 1 & mgr; l Ziegen-anti-Maus-sekundären Antikörper APC pro 200 ul HF (1: 200 Verdünnung).
14. Beflecken die Proben. 100 l Färbelösung in jede Vertiefung (sowohl den sekundären Antikörper-Kontrolle und Anti-cTnT befleckten Brunnen). Inkubieren Zellen im Dunkeln bei 4 ° C für 30 min (die Platte bedeckt halten oder in der Dunkelheit nach, fluoreszierenden sekundären Antikörper Zugabe zu vermeiden Photobleaching).
15. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 2 min. Den Überstand aspirieren und fügen Sie pro Vertiefung 200 ul HF. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
16. Übertragen Sie die Proben zu 5 ml Rundboden Durchflusszytometer Analyse Röhren und führen die Durchflusszytometrie für Signal in dem APC - Kanal ¹⁹ die Standardprotokolle für das Instrument.

Ergebnisse

Größe gesteuerte Aggregate von hPSCs wirksam gebildet werden unter Verwendung des Mikrotiterplatten-System, hängt nur von der Konzentration der Zellen und der Mikrovertiefungsoberfläche. Nach einer kurzen Zentrifugation, werden die entsprechenden Anzahlen von Zellen (1000 in diesem Protokoll) zusammengebracht werden , in jede Vertiefung (1A). Wichtig ist , dass diese Zellen wiederherzustellen intrazelluläre Verbindungen innerhalb von 24 Stunden, und sollte nicht mehr gut zu füllen, sondern erscheinen als kompakte Aggregate mit glatten Kanten (Abbildung 1B). Diese Aggregate stellen die Ausgangsmaterialien für die weitere Differenzierung zu einem kardialen Schicksal. Wenn die Zellen nicht dicht Cluster zu bilden, deutet dies möglich Zelltod nach Dissoziation und reaggregation, und die Eignung der einzelnen Zelle Passagierung und ROCK-Inhibitor-Konzentrationen für eine bestimmte Zelllinie untersucht werden sollten. Die folgenden drei Tage in Mikrotitervertiefungen zeigen wenig Veränderung in Aggregat Morphology, obwohl einige Wachstums ist evident. Wenn aus den Mikrovertiefungen entfernt, Aggregate sollten ihre runden, dicht gepackten Morphologie erhalten und ein anderes (1C) auf eine von ähnlicher Größe sein. Kultur in ULA 24-Well-Platten werden weitere Zell Expansion und Wachstum ermöglichen.

Am Tag 8 nach der Belichtung zuerst Activin - Signalisierung und Wnt - Hemmung, beginnen die Aggregate als größer und heller Aggregate (Figur 1D) zu erscheinen. Während dieser Zeit erhebliche Zelltrümmer werden am unteren Rand jeder Vertiefung offensichtlich sein und müssen, indem Aggregate vor dem Entfernen Medien absetzen entfernt werden. Gelegentlich werden viele Aggregate miteinander verschmelzen. Dies wird die Differenzierung von anderen Aggregaten in dem Bohrloch nicht hemmen, obwohl diese "Super-Aggregate" neigen nicht dazu, die morphologischen Veränderungen mit kleineren Aggregaten gesehen aufweisen und sind weniger wahrscheinlich vollständige Differenzierung zu unterziehen.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Fortsetzung Differenzierung führt zu bemerkenswerten morphologischen Veränderungen an den Aggregaten mit einer erhöhten Größe und das Aussehen der organisierten faserige Regionen. Am Tag 12 können Vertrags Aggregate beobachtet werden. Diese werden immer aus großen, transparenten Zellen hergestellt werden und enthalten häufig umfangreiche extrazellulären Matrix außerhalb des Aggregats (Abbildung 2). Während Aggregat weite Kontraktionen eine erfolgreiche Differenzierung zeigen, kann Herzmarker Ausdruck auch in Aggregaten beobachtet werden, scheinen nicht zu kontrahieren. Im Anschluss an die Dissoziation von Aggregaten und Immunomarkierung, eine Mehrzahl der Zellen wird für die Kardiomyozyten Marker cTnT mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3) positiv sein. Die Expression dieses Markers ist stabil in den Zellen und kann in Aggregaten so spät wie Tag 19 der Differenzierung beobachtet werden.

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Abbildung 1: Timeline von HPSC differenziert nach einem Herz Schicksal Unmittelbar nach der Aggregation, Zellen fast jede Vertiefung füllen (A).. Einen Tag später erscheinen die Aggregate kondensiert und glatt (B). Diese Morphologie bestehen bleibt , auch wenn die Aggregate aus den Kavitäten und plattiert in Well - Platten (C) entfernt werden. Am Tag 8, beginnen Aggregate erweitern und erscheinen heller in der Farbe (D). Maßstabsbalken:. 250 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Aggregates Beginnen Vertrags bis zum Tag 12 der Differenzierung Nach sechs Tagen in der Herz Induction Phase 3 Medium, kraftvolle Aggregat weite Kontraktionen (oben beobachtet wurden. Entspannenation, Mitteltafel: Kontraktion). Die untere Platte ist abgeleitet von den oberen und mittleren Platten abgezogen, wobei die meisten signifikanten Unterschiede als schwarz oder weiß (Pfeilspitzen) erscheinen. Maßstabsbalken:. 250 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig . 3: Immunmarkierung für Cardiac Troponin T in Differentiated hPSCs Am Tag 17 werden die meisten der Zellen , die positiv für Herz - Troponin T durch Durchflusszytometrie (gefüllte Histogramm). Ebenfalls gezeigt sind mit sekundären Antikörper gefärbten Zellen allein (ungefüllt Histogramm). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Es wurde beobachtet, dass eine effiziente kardiale Differenzierung von pluripotenten Stammzellen ist ein hoch variable Prozesses. Zwar ist es nicht überraschend , dass verschiedene Zelllinien weisen variierende Neigungen Differenzierungsfähigkeit auf bestimmte Zelltypen ist, wurde beobachtet, dass kardiale Differenzierung Effizienz dramatisch zwischen replicate schwankt der gleichen Zelllinie ⁶ verläuft verwenden. Das hier beschriebene Protokoll-Adressen eine wichtige Quelle für diese Variabilität durch direkte Eingabe der Zellzahl pro Aggregat zu steuern. Um weiter zu reduzieren Variabilität zwischen den Läufen, wird empfohlen , dass HPSC Linien für einzelne Zelle Passagierbarkeit angepasst werden verwendet, da diese Form der HPSC Erweiterung und Wartung Ergebnisse in konsistenter pluripotenten Populationen in Bezug auf Ausdruck Frequenzen von Pluripotenz Marker (zB Oct4, Nanog, TRA-1-60, etc.).

Das Protokoll, wie hier geschrieben gibt eine Gesamtgröße von 1.000 Zellen für optimale Herz Induktion von der HES-2 embryonale Stammzelllinie. Um dieses Protokoll zu verschiedenen Zelllinien gelten, ist es entscheidend, dass eine anfängliche Aggregatgröße Bildschirm durchgeführt werden, um die Zelllinie spezifische optimale Aggregatgröße zu bestimmen. Zwar ist es nicht direkt die Verfahren auswirken hier folgen, erinnern wir den Leser, dass die Sauerstoffzufuhr zu beeinflussen, werden voraussichtlich in Aggregatgröße und Gesamtzelldichte ändert. Dies kann eine entsprechende Berücksichtigung in nachgelagerten Anwendungen. Darüber hinaus ist apoptotischen Zelltod ein Problem bei der Dissoziation von hPSCs auf einzelne Zellen. Daher ist es entscheidend, dass ROCK-Inhibitor, um sicherzustellen, während der Zwangszellaggregation in die Vertiefungen vorhanden ist. Schließlich ist es wichtig, dass die Aggregate am Tag 4 der Differenzierung sind gut Spuren Activin A zu entfernen, gewaschen, in dem Induktions-1 Medium vor Resuspension in Induktion 2 Medium. Nach Tag 4 der Differenzierung fördert Activin A endoderm Differenzierung auf Kosten der Meso-derm Induktion ^20.

Die Hauptanwendung dieser Technik ist Aggregatgrößen zu suchen, die eine effiziente Herzdifferenzierung fördern. Allerdings ist eine der Einschränkungen der aktuellen Technik ist, dass es Herz-Produktion zu einer klinisch relevanten Ebenen mit Mikrotiterplatten zu skalieren ist eine Herausforderung. Scale - up der kardialen Differenzierung ist in der Regel ²¹ in der Masse Kulturbedingungen in gerührten Suspension Bioreaktoren durchgeführt. Daher wird, sobald die Mikrowellsystem verwendet worden annehmbarer Bereiche der Aggregatgröße für eine effiziente Herzinduktions zu bestimmen, ist der nächste Schritt nach oben zu skalieren ist Bioreaktor Laufrades Geschwindigkeiten bestimmen, die die gewünschte Zellaggregatgröße erzeugen kann.

Einer der wesentlichen Unterschiede dieser Technik gegenüber anderen Verfahren zur aggregatbasierten Herzdifferenzierung ist, dass es in Aggregaten als auch direkte Untersuchungen zur Modulation der Wirkungen von endogenem Signalisierung ermöglicht alsdie Co-Kultur von induktiven / inhibitorische Gewebearten mit den hPSCs im Aggregat ^13. Diese Arten von Untersuchungen können die Prozessentwicklung von großen Herz Produktion informieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet
Pipette aid
Serological pipettes (5 to 25 ml)
Aspirator
Aspirator or Pasteur pipettes
15 and 50 ml conical tubes
Fume hood
0.22 µm syringe filter
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator			Hypoxic (low oxygen) incubator
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates	Corning/Costar	3473
1.5 ml microcentrifuge tubes
Bench-top microcentrifuge
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4403
Sterile Ultrapure distilled water	Sigma-Aldrich	W3500
Vortex
Ice
-20 °C freezer
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage.
StemPro-34 Medium	Thermo Fisher Scientific	10639-011	Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C.
Transferrin	Roche	10652202001
BMP-4	R&D Technologies	314-BP
bFGF	R&D Technologies	233-FB
VEGF	R&D Technologies	293-VE
Activin A	R&D Technologies	338-AC
IWP-2	Reagents Direct	57-G89
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	Corrosive
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660
100x Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140
100x L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
TrypLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563	Dissociation enzyme
Hemocytometer
Trypan Blue
Aggrewell 400 plates	StemCell Technologies	27845	Microwell Plates
Aggrewell Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Y-27632 ROCK Inhibitor	Tocris	1254
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14025092
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483
96 well plate (for FACS staining)
Intraprep Permeabilization Reagent	Beckman Coulter	IM2389	Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic
cTnT antibody	Neomarkers	MS-295
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher	Molecular Probes	A865
5 ml round bottom flow cytometry tubes	FACS machine dependent