Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches

Résumé

Les méthodes conventionnelles pour initier la différenciation cardiaque sur la base globale de suspension de tiges pluripotentes humaines (cellules hPSCs) sont en proie à la culture hétérogénéité par rapport à la taille des agrégats et la forme. Ici, nous décrivons une méthode robuste pour la différenciation cardiaque en employant des micropuits pour générer taille contrôlée HPSC agrégats cultivés dans des conditions favorisant cardiaques.

Résumé

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Introduction

Dans une culture cellulaire in vitro peut être effectuée dans un certain nombre de modalités, mais elle est généralement effectuée soit dans des conditions adhérentes à deux dimensions ou dans des conditions de suspension en trois dimensions qui récapitulent plus complètement dans des systèmes in vivo. Par conséquent, il y a une tendance croissante dans de nombreux domaines de la recherche pour développer des méthodes robustes pour générer des constructions de tissu en trois dimensions. Dans les scénarios où les types et les processus cellulaires nécessitent un soutien matrice extracellulaire (ECM) des signaux de surface et d' adhérence, en trois dimensions de la culture peut être activé par l' intermédiaire des constructions échafaudés, où les cellules sont cultivées sur ou dans un exogène matrice support ^1. Les cellules et les processus qui ne nécessitent pas l' adhésion à une matrice de soutien peuvent être effectuées en suspension que les systèmes unscaffolded composés principalement ou exclusivement de cellules (qui peut alors procéder pour générer leurs propres matrices endogènes) ^2,3. Ici, nous présentons un protocole cardiaque différenciation of cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs - cellules souches capables de devenir tout type de cellule dans le corps, que ce soit à partir de sources embryonnaires ou autres) en taille contrôlée, uniforme, des agrégats unscaffolded.

Différenciation des hPSCs que les agrégats de suspension est en proie à de grandes variations dans la taille des agrégats à la fois dans une course et entre pistes. Cette variabilité est une conséquence de la méthode habituellement utilisée pour produire ces agrégats, ce qui implique une dissociation mécanique des colonies de cellules. Afin de réduire cette variabilité, un certain nombre d'approches ont été utilisées pour contrôler le nombre de cellules par agrégat, ainsi que le diamètre global de l'homogénéité. Des exemples comprennent la formation d'agrégats dans des microtubes ⁴ ou ⁵ gouttes comme tenture, micromodelage définies colonies HPSC bidimensionnelles ⁶ qui peuvent ensuite être transférés à la suspension, ou la centrifugation des cellules en U ou en plaques multi-puits à fond en V ^{7,8, 9.} Cependant, tous ces approches sont limités par leur faible capacité de production globale. systèmes basés bien utilisent une approche similaire à celle des systèmes de plaques à fond en V, mais la plus petite taille des micropuits (dans ce protocole ayant chacune une largeur de 400 um) permet la génération d'un plus grand nombre d'agrégats uniformes d'une culture-plaque seul puits (diamètre standard de ~ 15,5 mm contenant ~ 1200 micropuits) que celle qui serait produite à partir de toute une plaque de fond en V ^10. La formation d' agrégats à base bien a été utilisé dans un certain nombre de paramètres , y compris la différenciation des hPSCs à ectodermique ^11, endodermique ^12, mésodermiques ¹³ et ¹⁴ extraembryonnaires destins; chondrogenèse de cellules souches mésenchymateuses ^15; génération de substrats uniformes pour le dépistage toxicologique ^16; et les enquêtes de mécanobiologie ^17.

Un défi majeur dans le développement de protocoles de fabrication robustes pour la production de cardiom HPSC dérivésyocytes a été le manque de reproductibilité de l'efficacité de la différenciation cardiaque entre les courses. Nous avons déjà démontré que cette variabilité peut être attribuée à l' hétérogénéité de la population à partir HPSC, qui comprend à la fois des cellules auto-renouvellement et de différenciation hPSCs qui expriment des gènes associés à la différenciation neuronale endoderme et ^6,18. Signaux sécrétées par ces cellules différenciées impact sur l'induction cardiaque. Plus précisément, l'endoderme extra-embryonnaire favorise l'induction cardiaque, tandis que les cellules progénitrices neurales inhibent l'induction cardiaque. Lors de l' agrégation HPSC, les cellules au sein de la différencier globale et organiser de telle sorte que hPSCs indifférenciées sont entourés par une couche de cellules de l' endoderme extra - embryonnaires qui se développent sur la surface totale ^13. En contrôlant la taille des agrégats, on peut moduler le rapport des cellules de l' endoderme cardiaques induisant à hPSCs indifférenciées (de surface au rapport de volume) et d' optimiser ce ratio pour l' induction cardiaque maximale ^13.

Protocole

1. Préparation des composants Medium

1. Préparer Wash Medium. Par 100 ml de DMEM / F12, ajouter 1 ml de 100X pénicilline / streptomycine (Pen / Strep), 1 ml de L-glutamine 100X et 5 ml de remplacement de sérum.
2. Préparer la constitution chimique définie Basal cardiaque Induction moyenne selon les instructions du fabricant.
3. Préparer les réactifs d'achat d'actions suivantes pour les médias qui seront utilisés dans ce protocole.
   1. Acide L-Ascorbique: Préparer une solution mère de 5 mg par ml dans 4 ° C, l'eau distillée ultra pure stérile dans un tube conique.
      1. Laissez cette solution sur la glace et le tube vortex périodiquement jusqu'à ce que le soluté soit complètement dissous. Filtre à stériliser la solution d'acide ascorbique à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um.
      2. Préparer aliquotes de 1 ml de la solution d'acide ascorbique et de stocker ces aliquotes à -20 ° C. Utilisez un aliquote fraîchement décongelé chaque milieu de temps est préparé.
   2. Le jour de la préparation du milieu, Diluer 13 pi de monothioglycérol (MTG) dans 1 ml de Basal cardiaque Induction Medium. Jeter utilisé, MTG dilué.
   3. Préparer aliquotes de 1 ml de la transferrine (30 mg / ml) pour stocker à -20 ° C. Magasin aliquotes décongelée à 4 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
   4. Préparer l'acide 4 mM chlorhydrique (HCl) contenant 0,1% de sérum-albumine bovine (BSA). Dans une hotte aspirante, ajouter 30 ul de solution 6,0 N de HCl à 50 ml d'eau distillée ultra pure. Filtre à stériliser la solution en utilisant un filtre à seringue de 0,22 um. Ajouter 2 ml de solution de BSA à 25% à la solution 50 ml de HCl.
   5. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% de BSA. Ajouter 20 pl de solution de BSA à 25% par ml de PBS.
   6. Préparer Human Bone Morphogenetic Protein 4 (4-BMP) solution mère (10 ng / ul). Dissoudre 10 ug de BMP-4 lyophilisé dans 1 ml d'une solution tampon contenant 4 mM de HCl à 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C.
   7. Préparer Human Fibroblast Growth Factor 2 (bFGF) solution mère(10 ng / ul). Dissoudre 10 pg de bFGF lyophilisé dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C.
   8. Préparer Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) humain solution mère (5 ng / ul). Dissoudre 5 pg de VEGF lyophilisée dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C.
   9. Préparer activine Une solution mère (10 ng / ul). Dissoudre 10 ug lyophilisées activine A dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA). Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C.
   10. Préparer Inhibiteur de Wnt production-2 (2-IWP) solution mère (10 mM). Dissoudre 2 mg IWP-2 dans 429 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer 10 ul aliquotes pour stocker à -80 ° C.
4. Préparer Complete Cardiac Induction Medium. Pour 100 ml de Basal cardiaque Induction moyenne, ajouter 1 ml de 100x Pen / Strep, 1 ml de 100x L-glutamine, 500 pi de transferrine, 1ml d'acide ascorbique fraîchement décongelé et 300 pi de MTG. Jeter moyen utilisé.

2. Préparation de la plaque de micropuits

NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Ajouter 0,5 ml de solution de rinçage (composante de kit) à chaque puits qui sera utilisé sur la plaque. Pour veiller à ce que les contacts de la solution, la surface entière à l'intérieur de chaque puits, centrifuger la plaque à 840 g pendant 2 min.
2. Incuber la plaque pendant 30 à 60 min à température ambiante.
3. Aspirer la solution de rinçage des puits. Laver chaque puits deux fois comme suit: Ajouter 1 ml de PBS à chaque puits, la plaque centrifuge à 840 g pendant 2 min, puis aspirer le PBS.

3. Formation des HPSC Granulats dans la plaque de micropuits

NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Placez Wash Medium dans un bain d'eau C 37 °.
   NOTE: Le volume requis = 1 ml x nombre de puits de HpSC qui sera dissociée.
2. Dissocier hPSCs à des cellules individuelles
   REMARQUE: Ces étapes décrivent la dissociation des cellules en culture sur plaques de 6 puits - les volumes de réactifs peuvent être mis à l'échelle proportionnellement pour les différents formats de culture.
   1. Aspirer le milieu de culture de chaque culture HPSC bien pour la dissociation. Rincer chaque puits avec 1 ml de la dissociation enzymatique, puis aspirer immédiatement l'enzyme de dissociation de chaque puits.
      NOTE: résiduelle enzyme de dissociation devrait être suffisante pour dissocier les cellules.
   2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 3 min.
   3. Ajouter 1 ml de milieu de lavage dans chaque puits et se dissocier mécaniquement les cellules de la surface de culture de tissu en pipetant le milieu de lavage avec une micropipette P1000 sur la surface de culture tissulaire. Si la dissociation semble être des amas cellulaires incomplètes et restent, passer la suspension à travers une passoire à ce point.
   4. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml et conserverle tube dans l'incubateur pendant que la numération cellulaire est effectuée dans l'étape suivante.
   5. Effectuer une numération cellulaire:
      1. Prélever un échantillon de 10 ul de la suspension cellulaire recueillie dans l'étape précédente. Ajouter 30 pi de bleu Trypan et mélanger la suspension bien par pipetage.
      2. Transférer 10 pl de cellules colorées au bleu Trypan à chaque chambre d'un hémocytomètre et de visualiser au microscope inversé à l'objectif 10X. Compter les cellules.
   6. D'après les résultats de comptage de cellules, calculer le nombre de puits peuvent être ensemencées à 1,2 x 10 ⁶ cellules par puits de la plaque de micropuits. Calculer Agrégation moyen nécessaire pour ensemencer les cellules à 1 ml par puits.
   7. Préparer le milieu d'agrégation. Par 10 ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajouter 0,5 pi de BMP4 solution mère (concentration finale = 0,5 ng / ml) et Y-27632 ROCK Inhibitor (concentration finale = 10 uM).
   8. Retirer le tube conique contenant les hPSCs de l'incubateur et centrifuge du tube à 200 xg pendant 5 min. Aspirer le milieu de lavage et de remettre en suspension les cellules dans un milieu d'agrégation à une densité de 1,2 x 10 ⁶ cellules par ml.
   9. Aspirer la solution de lavage PBS de chaque puits de la plaque de micropuits. En utilisant une micropipette P1000, répartir uniformément et semences 1 ml de la suspension cellulaire à chaque puits sur la plaque de micropuits. Pour semer un grand nombre de puits, vortex périodiquement la suspension cellulaire pour empêcher la sédimentation.
   10. Centrifuger la plaque à 200 xg pendant 5 min. Observer la plaque sous le microscope pour confirmer les cellules ont filé au fond de chaque puits.
   11. Incuber la plaque pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO _2, 5% de O ₂ (hypoxique) incubateur.

4. cardiaque Induction Stage 1

1. Un jour suivant l'agrégation (jour 1), préparer le volume requis de l'étape 1 moyen d'induction (pour une plaque de 24 puits, volume = 1 ml x nombre de puits). Pour 1 ml de complètemilieu d'induction cardiaque, ajouter 1 pl de BMP4 solution mère (concentration finale = 10 ng / ml), 0,5 pi de solution mère bFGF (concentration finale = 5 ng / ml) et 0,6 pi d'activine A (concentration finale = 6 ng / mL). Placer le milieu dans un bain-marie à 37 ° C pendant au moins 15 min.
2. Retirer la plaque de micropuits de l'incubateur. Inspecter les agrégats sous le microscope. Par rapport à l'agrégation immédiatement post-centrifugeuse, ils doivent apparaître intact avec des bords lisses (plus rond et moins carré que la veille).
3. Retirer le surnageant sans déranger les agrégats à l'intérieur de la cupule:
   1. Tenir la plaque de micropuits horizontale (ie., Ne pas pencher). Pour chaque puits de la plaque de micropuits, placez la pointe d'une micropipette P1000 à la surface du milieu de culture et contre le bord du puits.
   2. Retirez lentement le moyen, en faisant attention à ne pas perturber les agrégats au fond de la cupule. Après réduction de til niveau moyen d'environ 1 à 2 mm de la surface de micropuits texturée, incliner lentement la plaque pour recueillir milieu d'un côté du puits (une fois que le volume est suffisamment faible, le mouvement du fluide est considérablement réduite et il est plus facile d'éviter les agrégats se lever de leurs micropuits individuels). pipette lentement le reste moyen dans le puits.
4. Pour ajouter frais Etape 1 Induction moyenne tout en assurant les agrégats restent dans leurs micropuits individuels: Dessinez 1 ml de la phase 1 milieu d'induction avec une micropipette P1000. Maintenez la pointe de la pipette contre le bord intérieur du puits et distribuer très lentement le moyen contre la paroi intérieure du puits. Répétez l'opération pour les puits restants.
5. Retourner la plaque dans l'incubateur dans des conditions hypoxiques pendant 3 jours.

5. Induction cardiaque Etape 2

1. Le jour 4, place de lavage moyen (volume = nombre de puits x 2 ml) dans un bain d'eau à 37 ° pour un minimum de 15 min.
2. Préparer le volume nécessaire de la phase 2 Induction Medium (volume = nombre de puits x 1 ml): Par ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajouter 2 pi de solution VEGF de stock (concentration finale = 10 ng / ml) et 0,5 ul IWP-2 solution mère (concentration finale = 5 uM). Placer le stade 2 préparé un milieu d'induction dans un bain d'eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min.
3. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, récolter les agrégats de chaque puits de la plaque de micropuits et de recueillir la suspension totale dans un tube de 15 ml conique (recueillir jusqu'à 10 puits par 15 ml tube).
4. Permettre aux agrégats de se déposer pendant 15 minutes dans un incubateur à hypoxique.
   REMARQUE: Cette étape est importante pour séparer les cellules individuelles et les débris cellulaires des agrégats intacts.
5. Aspirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension les agrégats dans 10 ml de la pré-chauffé Wash Medium pour éliminer les cytokines inductifs résiduelles (par exemple, l' activine A est une molécule de signalisation puissante , même à très faible concentrations).
6. Centrifuger les granulats à 50 x g pendant 2 min. Aspirer le surnageant. Resuspendre les agrégats granulées dans l'induction 2 Medium préchauffée.
7. Transférer la suspension totale à une plaque de fixation ultra-bas 24 puits (ULA) à 1 ml par puits. Observer les agrégats sous le microscope comme uniforme, des amas de cellules serrées. Incuber dans des conditions hypoxiques jusqu'au jour 6.

6. cardiaque Induction Etape 3

1. Le jour 6, préparer le volume nécessaire de la phase 3 Induction Medium (volume = nombre de puits x 1 ml). Pour 1 ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajoutez VEGF solution mère 2 pl (concentration finale = 10 ng / ml) et 0,5 pi de solution mère bFGF (concentration finale = 5 ng / ml). Placer préparé Etape 3 milieu d'induction dans un bain d'eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min.
2. Utiliser une pipette 5 ml sérologiques pour transférer les agrégats à 15 ml tubes coniques, la mise en commun jusqu'à 10 ml d'agrégats par tube.
3. Autoriser 10 min pour les agrégats de se déposer. Aspirer le surnageant et remettre les agrégats dans le pré-chauffé Etape 3 Induction Medium. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, redistribuer les agrégats dans une plaque de 24 puits ULA à 1 ml par puits.
4. Au jour 10, le volume nécessaire de préparer de l'étape 3 à induction moyenne (volume = nombre de puits x 1 ml) comme indiqué à l'étape 6.1.
5. Utilisez 5 ml pipette sérologique pour transférer les agrégats à 15 ml tubes coniques, la mise en commun jusqu'à 10 ml d'agrégats par tube.
6. Autoriser 10 min pour les agrégats de se déposer. Aspirer le surnageant et remettre les agrégats au stade 3 Induction Medium. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, redistribuer les agrégats dans une plaque de 24 puits ULA à 1 ml par puits.
7. Incuber dans des conditions hypoxiques pendant deux jours. Au jour 12, commencer l' incubation des cellules à des niveaux d'oxygène normoxiques pendant le reste de la période de culture (37 ° C, 20% de O _2, 5% CO _2).
   REMARQUE:Après ce point de temps, les cellules ne sont plus cultivées dans des conditions hypoxiques.
8. Répétez cet échange milieu complet (étapes 6.2 et 6.3) tous les 4 jours, à partir de 14 jours jusqu'à la récolte de cellules (typiquement, les concentrations de cardiomyocytes pics sont observés après 14 jours de différenciation).

7. cytométrie de flux Analyse de Troponine T (cTnT) Expression Fréquence des micropuits Culture sortie

1. Dissocier les agrégats comme suit:
   1. Utiliser une pipette de 5 ml sérologiques pour transférer 1 puits d'agrégats à un tube conique de 15 ml. Centrifuger les agrégats à 50 g pendant 2 min et aspirer soigneusement le surnageant.
   2. Ajouter 1 ml de solution fraîchement dissous 1 mg / ml de collagénase de type II aux agrégats. Transférer la suspension totale à un tube de 1,5 ml. Incuber les agrégats dans la collagénase de type II pendant une nuit à température ambiante.
   3. Le jour suivant, utiliser une micropipette P1000 pour dissocier doucement les agrégatsdans une suspension homogène de la cellule unique. Si les agrégats ne se dissocient pas facilement, régler les agrégats, aspirer le surnageant, et incuber les agrégats dans 700 ul de Dissociation enzymatique pour 1 à 2 min à température ambiante. pipeter doucement les agrégats 1 à 2 fois avec une micropipette P1000 à dissocier.
   4. Diluer l'enzyme de dissociation: Ajouter 700 pi de milieu de lavage contenant 14 pi de 1 mg / ml solution de DNase. Prenez un échantillon de 10 pi pour effectuer une numération cellulaire, et centrifuger la suspension restante en utilisant une microcentrifugeuse de paillasse à 300 g pendant 2 min.
2. Effectuer une numération cellulaire: Colorer le 10 ul comptage échantillon avec un volume égal de bleu Trypan et compter en utilisant un hémocytomètre.
3. Retirez le tube de 1,5 ml contenant les cellules restantes de la microcentrifugeuse. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 200 000 à 500 000 cellules par 100 pi, dans une solution saline équilibrée de Hanks contenant2% de sérum bovin fœtal (HF).
4. Pour chaque condition, transférer 100 ul de suspension cellulaire par puits à 2 puits d'une plaque à 96 puits (un puits sera coloré avec l'anticorps cTnT et l'autre sera le contrôle de l'anticorps secondaire).
5. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Retirer le surnageant avec une micropipette multicanaux.
6. Fixer les cellules: Ajouter 200 pi de solution de fixation (composant du kit) par puits et incuber la plaque pendant 15 min à température ambiante.
7. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Utilisez une micropipette multicanaux de retirer soigneusement le surnageant des puits. Jeter le surnageant dans un conteneur de déchets de paraformaldehyde.
8. Laver les cellules fixées à deux reprises: Ajouter 200 pi de HF à chaque puits. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant, et répéter l'étape de lavage une fois de plus. Les cellules fixées peuvent être stockées pendant jusqu'à une semaine dans HF à 4 ° C.
9. Perméabiliser les cellules:
   1. Centrifuger la plaque à 300g pendant 2 min.
   2. Ajouter 100 pi de solution de perméabilisation (composant du kit) à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 5 min.
   3. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min et aspirer le surnageant.
10. Préparer un mélange maître d'anti-cTnT en HF à la concentration optimale pour le numéro de lot donné (La dilution optimale doit être déterminée par titrage et est généralement comprise entre 1: 500 à 1: 2000).
11. Pour chaque condition (2 puits par condition), ajouter 100 pi de mélange maître d'un puits (échantillon coloré) et 100 pi de HF plaine à l'autre bien (contrôle d'anticorps secondaire). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 30 min.
12. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et ajouter 200 pi de HF par puits. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
13. Préparer un mélange maître de l'anticorps secondaire. Transférer un volume de HF qui correspond à 100 pi pour chaque puits (contrôle de l'anticorps secondaire etcTnT tachée) traitée. Ajouter 1 pi d'anticorps secondaire de chèvre anti-souris-APC par 200 ul de HF (dilution 1: 200).
14. Colorer les échantillons. Ajouter 100 pi de solution de coloration dans chaque puits (à la fois le contrôle de l'anticorps secondaire et les puits anti cTnT colorés). Incuber les cellules dans l'obscurité à 4 ° C pendant 30 min (garder la plaque couverte ou dans l'obscurité après avoir ajouté un anticorps secondaire fluorescent pour éviter photoblanchiment).
15. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et ajouter 200 pi de HF par puits. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
16. Transférer les échantillons à 5 ml flux fond rond cytomètre tubes d'analyse et d' effectuer de cytométrie en flux pour le signal dans le canal APC en utilisant les protocoles standards de l'instrument ^19.

Résultats

les agrégats de taille contrôlée de manière efficace hPSCs peuvent être formés en utilisant le système de micro-puits, dépendant uniquement de la concentration des cellules et la surface de microtitration. Après une brève centrifugation, le nombre approprié de cellules (1000 dans ce protocole) sont réunis dans chaque puits (figure 1A). Fait important, ces cellules rétablir les connexions intracellulaires dans les 24 heures, et ne doivent plus remplir le puits, mais apparaissent sous forme d' agrégats compacts avec des bords lisses (figure 1B). Ces agrégats fournissent les matières premières pour une différenciation plus poussée vers un destin cardiaque. Si les cellules ne parviennent pas à former des grappes serrées, cela suggère possible la mort cellulaire après la dissociation et réagrégation et la pertinence des concentrations de repiquage de cellules et inhibiteurs de ROCK simples pour une lignée cellulaire particulière devrait être examinée. Les trois jours suivants à micropuits montrent peu de changement dans morpho globallogie, bien que certains la croissance est évidente. Lorsqu'ils sont retirés de la cupule, les agrégats doivent maintenir leur tour, la morphologie serrés et être d'une taille similaire à l'autre (figure 1C). ULA culture dans des plaques à 24 puits permettra en outre l'expansion des cellules et la croissance.

Le jour 8, après la première exposition à la signalisation activine, et l' inhibition de Wnt, les agrégats commencent à apparaître sous forme d' agrégats plus grands et plus lumineux (Figure 1D). Pendant cette période, les débris cellulaires considérable sera évident au fond de chaque puits et doit être enlevé en permettant de régler les agrégats avant de retirer les médias. De temps en temps, de nombreux agrégats vont fusionner ensemble. Cela ne va pas inhiber la différenciation d'autres agrégats dans le puits, bien que ces agrégats «super» ont tendance à ne pas présenter les modifications morphologiques observées avec des agrégats plus petits et sont moins susceptibles de subir une différenciation complète.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Résultats de la différenciation Suite à des changements morphologiques notables aux agrégats avec une augmentation de la taille et l'aspect des régions fibreuses organisées. Le jour 12, les agrégats contractants peuvent être observés. Ceux - ci seront toujours composées de grandes cellules transparentes et comprennent souvent une vaste matrice extracellulaire à l'extérieur de l'ensemble (figure 2). Alors que les contractions agrégées à l'échelle indiquent une différenciation réussie, l'expression cardiaque marqueur peut également être observé dans les agrégats qui ne semblent pas se contracter. Après la dissociation des agrégats et immunomarquage, la majorité des cellules sont positives pour le marqueur cTnT des cardiomyocytes par cytométrie de flux (Figure 3). L'expression de ce marqueur est stable dans les cellules et peut être observé dans les agrégats aussi tard que le jour 19 de la différenciation.

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Figure 1: Chronologie de HPSC différenciée vers un destin cardiaque Immédiatement après l' agrégation, les cellules remplissent presque chaque micropuits (A).. Un jour plus tard, les agrégats semblent condensés et lisse (B). Cette morphologie persiste même lorsque les agrégats sont retirés des micropuits et étalées dans des plaques à puits (C). Le jour 8, les agrégats commencent à se développer et apparaissent plus légers en couleur (D). Barre d' échelle:. 250 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Granulats Begin contractant par Jour 12 de Différenciation Après six jours d'induction cardiaque Étape 3 moyenne, contractions agrégées à l' échelle énergiques ont été observés (panneau supérieur:. Détendreation, panneau central: contraction). Le panneau inférieur est dérivé de soustraire les panneaux supérieurs et intermédiaires, avec la plupart des différences significatives apparaissant comme noires ou blanches (flèches). Barre d' échelle:. 250 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3:. Immunomarquage pour Troponine T dans Differentiated hPSCs Au jour 17, la plupart des cellules sont positives pour la troponine T cardiaque par cytométrie de flux (histogramme rempli). Sont également indiquées les cellules colorées avec l' anticorps secondaire seul (histogramme non rempli). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Il a été observé que la différenciation cardiaque efficace de cellules souches pluripotentes est un processus très variable. Bien qu'il ne soit pas surprenant que les différentes lignées cellulaires présentent différentes inclinations pour la capacité de différenciation de types de cellules spécifiques, il a été observé que l' efficacité de la différenciation cardiaque varie considérablement entre répliquée exécute à l' aide de la même lignée cellulaire ^6. Le protocole décrit ici répond à l'une des principales sources de cette variabilité en contrôlant directement le numéro de cellule d'entrée par agrégat. Pour réduire davantage la variabilité entre les courses, il est recommandé que les lignes HPSC adaptées aux passages à cellule unique sont utilisés, car cette forme de résultats d'expansion et d' entretien HPSC dans les populations pluripotentes plus cohérentes par rapport aux fréquences d'expression de marqueurs de pluripotence (par exemple, Oct4, Nanog, Tra-1-60, etc.).

Le protocole écrit ici spécifie une taille globale de 1000 cellules pour oinduction cardiaque ptimal de la lignée de cellules souches embryonnaires HES-2. Pour appliquer ce protocole à différentes lignées cellulaires, il est essentiel que l'écran initial de la taille des agrégats être effectuée pour déterminer la taille globale optimale lignée cellulaire spécifique. Bien qu'il n'a pas d'impact directement sur les procédures à suivre ici, nous rappelons au lecteur que les changements dans la taille des agrégats et de la densité globale de la cellule devrait influer sur l'apport d'oxygène. Cela peut devenir une considération pertinente dans les applications en aval. De plus, la mort cellulaire apoptotique est une préoccupation lors de la dissociation de hPSCs aux cellules individuelles. Par conséquent, il est essentiel de veiller à ce que l'inhibiteur de ROCK est présent lors de l'agrégation cellulaire forcé dans les micropuits. Enfin, il est essentiel que le jour 4 de la différenciation des agrégats sont bien lavés pour éliminer les traces de l'activine A, présent dans l'induction 1 moyen, avant remise en suspension dans Induction 2 Medium. Après 4 jours de différenciation, activine A favorise la différenciation de l'endoderme au détriment de la mésoderm induction ^20.

La principale application de cette technique est de dépister tailles d'agrégats qui favorisent la différenciation cardiaque efficace. Cependant, une des limites de la technique actuelle est qu'il est difficile à l'échelle de production cardiaque à des niveaux cliniquement pertinents en utilisant des plaques de micropuits. Mise à l' échelle de la différenciation cardiaque est généralement effectuée dans des conditions de culture en vrac dans des bioréacteurs de suspension agités ^21. Par conséquent, une fois que le système de micro-puits a été utilisé pour déterminer les plages acceptables de la taille des agrégats pour l'induction cardiaque efficace, la prochaine étape à plus grande échelle consiste à déterminer les vitesses de roue bioréacteur qui peut générer la taille de l'agrégat cellulaire désirée.

L'une des différences significatives de cette technique par rapport à d'autres méthodes pour la différenciation cardiaque globale basée est qu'il permet de diriger des enquêtes en modulant les effets de la signalisation endogène dans les agrégats ainsi quela co-culture de différents types de tissus à induction / inhibition avec les hPSCs dans l'agrégat ^13. Ces types d'enquêtes peuvent éclairer l'élaboration des processus de production cardiaque à grande échelle.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet
Pipette aid
Serological pipettes (5 to 25 ml)
Aspirator
Aspirator or Pasteur pipettes
15 and 50 ml conical tubes
Fume hood
0.22 µm syringe filter
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator			Hypoxic (low oxygen) incubator
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates	Corning/Costar	3473
1.5 ml microcentrifuge tubes
Bench-top microcentrifuge
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4403
Sterile Ultrapure distilled water	Sigma-Aldrich	W3500
Vortex
Ice
-20 °C freezer
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage.
StemPro-34 Medium	Thermo Fisher Scientific	10639-011	Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C.
Transferrin	Roche	10652202001
BMP-4	R&D Technologies	314-BP
bFGF	R&D Technologies	233-FB
VEGF	R&D Technologies	293-VE
Activin A	R&D Technologies	338-AC
IWP-2	Reagents Direct	57-G89
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	Corrosive
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660
100x Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140
100x L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
TrypLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563	Dissociation enzyme
Hemocytometer
Trypan Blue
Aggrewell 400 plates	StemCell Technologies	27845	Microwell Plates
Aggrewell Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Y-27632 ROCK Inhibitor	Tocris	1254
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14025092
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483
96 well plate (for FACS staining)
Intraprep Permeabilization Reagent	Beckman Coulter	IM2389	Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic
cTnT antibody	Neomarkers	MS-295
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher	Molecular Probes	A865
5 ml round bottom flow cytometry tubes	FACS machine dependent