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Zusammenfassung

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Zusammenfassung

Viele wichtige biomedizinische Anwendungen, wie Zell Bildgebung und Fernmanipulation können durch Markierung Zellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) erreicht werden. ausreichende zelluläre Aufnahme von SPIONs zu erreichen, ist eine Herausforderung, die durch Aussetzen Zellen zu erhöhten Konzentrationen von SPIONs oder durch Verlängerung Belichtungszeiten (bis zu 72 Stunden) traditionell erfüllt hat. Allerdings sind diese Strategien wahrscheinlich Toxizität zu vermitteln. Hier präsentieren wir die Synthese des Proteinbasis SPION magnetoferritin sowie eine leichte Oberflächenfunktionalisierung-Protokoll, das die Magnetisierung mit niedrigen Expositionskonzentrationen schnelle Zelle ermöglicht. Der SPION Kern magnetoferritin besteht aus Kobalt-dotiertes Eisenoxid mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 8,2 nm mineralisierten innerhalb des Hohlraums des Pferds Milz apo-Ferritin. Chemische Kationisierung von magnetoferritin erzeugt eine neuartige, hochmembranaktive SPION, die humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) magnetisiert unter Verwendung von Inkubationszeiten alskurz als einer Minute und Eisenkonzentrationen als Tiefs als 0,2 mm.

Einleitung

Oberflächenbindung oder Internalisierung von superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) hat Magnetisierung einer Vielzahl von Zelltypen für Anwendungen wie Bildverarbeitung und Fernmanipulation aktiviert. 1 kann jedoch eine ausreichende zelluläre Magnetisierung zu erreichen sein , eine Herausforderung, vor allem , wenn die Wechselwirkung zwischen der SPION und der Zelloberfläche schwach ist. 2 In der Vergangenheit längerer Exposition oder hoher SPION Konzentrationen wurden als Strategien verwendet , um diese Herausforderung zu überwinden. Trotzdem 3,4 sind diese Strategie sehr problematisch , weil sie Toxizität 5,6 und haben sehr begrenzten Erfolg in Zelltypen mit geringer Internalisierung Raten, wie Lymphozyten erhöhen. 7 Zur Verbesserung haben die zelluläre Aufnahme von SPIONs, mehrere Oberflächenfunktionalisierung Ansätze wurden untersucht. Beispielsweise wurden Antikörper verwendet rezeptorvermittelte Endozytose, 8 zu fördern , während nicht-spezifische Aufnahme Transfektion a erreicht werden kann unter Verwendung vonHAU 9,10 oder zellpenetrierenden Arten, wie HIV tat-Peptid. Jedoch 11,12, Antikörper und Peptid Funktionalisierung Ansätze werden durch teure Reagenzien und komplexe synthetische Herstellung beschränkt, während Transfektionsagentien Nanopartikel Fällung induzieren können und sich negativ auf die Zellfunktion beeinflussen. 13,14

Vor kurzem berichteten wir über die Synthese von chemisch kationisierte magnetoferritin, eine neuartige SPION die in Magnetisierungs humanen mesenchymalen Stammzellen hoch wirksam war (hMSCs) Inkubationszeiten so kurz wie 1 Minute verwendet wird. 15 Magnetoferritin wird durch Rekonstitution eines SPION im Inneren des demineralisiertem Hohlraum des Eisenspeicherprotein Ferritin synthetisiert. 16 Diese Proteinbasis SPION kombiniert viele Eigenschaften , die es gut geeignet für die Zell Magnetisierung wie die Kontrolle über die magnetischen Eigenschaften des Magnetkerns, 17-19 und Biokompatibilität und Wasserlöslichkeit durch die Proteinhülle übertragen werden. Des Weiterenmehr wird Oberflächenfunktionalisierung leicht aufgrund adressierbaren Aminosäuren erreicht , die chemisch 20-22 oder genetisch modifiziert sein kann. 23-25 Wir haben gezeigt , dass die chemische Kationisierung der sauren Aminosäurereste des Proteinhülle eine stabile Nanopartikel erzeugt , die leicht mit anionischen Bereichen auf der Zelloberfläche in Wechselwirkung führt zu einer schnellen und anhaltende Zell Magnetisierung. Dieses Verfahren beseitigt die Notwendigkeit mühsamer Funktionalisierung und langwierige Inkubationsprotokolle und aufgrund der nicht-spezifischen Kennzeichnung Mechanismus dieser schnelle Magnetisierung Strategie sollte weitverbreitete Anwendung in anderen Zelltypen zu finden. Hier präsentieren wir eine eingehende Bericht der ultraschnelle Zellmarkierungsverfahren, einschließlich detaillierter Protokolle der Synthese, Reinigung und Oberflächenfunktionalisierung von kationisierten magnetoferritin.

Protokoll

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus dem proximalen Femur Knochenmark von arthrotischen Patienten einer Operation unterziehen Hüfttotalendoprothese geerntet, in voller Übereinstimmung mit Bristol Southmead Hospital Research Ethics Committee Richtlinien (Referenz # 078/01) und nach Zustimmung des Patienten erhalten.

1. Magnetoferritin Synthese und Reinigung

  1. Allgemeine Bemerkungen
    1. Führen magnetoferritin Synthese in einem verschließbaren, Doppelmantelreaktionsgefäß bei 65 ° C unter Stickstoffatmosphäre die Oxidation der Metallvorläufer zu beschränken. Injizieren Metallsalzlösungen und Wasserstoffperoxid durch Zugangsöffnungen in dem Deckel in das Reaktionsgefäß eine Spritzenpumpe.
    2. Nach magnetoferritin Synthese, Reinigung des Proteins durch Anionenaustauschchromatographie zu entfernen Nanopartikel nicht eingeschlossen in der Proteinhöhle, gefolgt von Größenausschlusschromatographie (siehe Abschnitt 1.5) zu isolieren Protein Monomere (siehe Abschnitt 1.4). Determine Proteinkonzentration einen Bradford-Test (siehe Abschnitt 1.6).
  2. Die Vorbereitungen vor der Synthese
    1. Desoxygenierung 500 ml entionisiertes Wasser über einen Schlauch mit einem Stickstoffgaszylinder in dem Wasser verbunden Platzieren des Gefäßes mit Frischhaltefolie Dichtungs- und sprudelnden durch etwa 60 min für Stickstoffgas.
    2. Erhitzen Wasserbad auf dem Doppelmantelreaktionsgefäß mit 65 ° C. Hinzufügen 75 ml 50 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) -Puffer (pH 8,6) in das Reaktionsgefäß, wobei das Gefäß abdichtet, und Desoxygenierung von etwa 20 min Stickstoffgas durch die Pufferlösung sprudelt. Zur gleichen Zeit, rühren Sie die Pufferlösung mit einem Magnetrührer.
    3. die HEPES-Pufferlösung Nach Entfernen von Sauerstoff aus, entfernen Sie das Rohr um das Stickstoffgas aus dem Puffer Versorgung und halten es in dem Behälter suspendiert, um eine Stickstoffatmosphäre aufrecht zu erhalten. Hinzufügen apo-Ferritin in einer Endkonzentration von 3 mg / m zu erreichen,l. Weiter den magnetischen Rühren, sondern reduzieren die Rührgeschwindigkeit wenn Schäumen auftritt.
    4. Bereiten Sie eine 25 mM Stammlösung von Kobaltsulfat-Heptahydrat von 0,19 g in 50 ml desoxygeniertem deionisiertem Wasser gelöst.
    5. Bereiten Sie eine 25 mM Lösung von Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat-Lösung von 0,98 g in 100 ml von Sauerstoff befreitem deionisiertem Wasser gelöst.
    6. Entfernen Sie 2,5 ml der Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat-Lösung und ersetzen mit 2,5 ml des Kobaltsulfat-Heptahydrat.
    7. Bereiten einer 8,33 mM Lösung von Wasserstoffperoxid in Sauerstoff befreitem deionisiertem Wasser hergestellt, indem zuerst 965 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (30% w / w) zu 9 ml von Sauerstoff befreitem deionisiertem Wasser und dann Zugabe von 1 ml dieser Unter Lager 99 ml von Sauerstoff befreit entsalztem Wasser.
  3. Magnetoferritin Synthese
    1. Injizieren 10,1 ml sowohl des Eisen-Kobalt-Vorläufer und dem Wasserstoffperoxid gleichzeitig in die apo-Ferritin-Lösung (s magnetischtirred) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,15 ml / min unter Verwendung von zwei Spritzenpumpe (Gesamtvolumen injiziert: 20,2 ml).
    2. Während der Einspritzperiode, desoxygenieren weitere 500 ml entionisiertes Wasser.
      HINWEIS: Der Inhalt des Reaktionsgefäßes allmählich eine dunkelbraune Farbe wie die Reaktion fortschreitet nehmen.
    3. Kurz vor Abschluss der ersten Injektion, bereiten weitere 100 ml Eisen-Kobalt-Vorläufer und Wasserstoffperoxid-Lösung, die frisch deoxygenated entsalztes Wasser.
    4. Wiederholen der Einspritzschritt beschrieben in 1.3.1 unter Verwendung von frisch hergestellten Lösungen von Eisen-Kobalt und Wasserstoffperoxid.
    5. Während der Einspritzdauer, desoxygenieren weitere 500 ml VE-Wasser, und gehen Sie wie in 1.3.3 und 1.3.4 beschrieben.
    6. Nach der dritten Injektion, lassen Sie die Lösung für 15 Minuten unter Rühren zu reifen.
    7. 1,5 ml einer 1 M Natriumcitrat-Lösung in das Reaktionsgefäß freien Metallionen in der Lösung zu chelieren.
    8. Entfernen der Lösung aus dem ReaktionsGefäß in 50 ml Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge für 30 min bei 4350 xg und den Überstand durch ein 0,22 um-Spritzenfilter passieren. In diesem Stadium kann die filtrierte Überstand bei 4 ° C bis zur Reinigung gelagert werden.
  4. Ionenaustauschchromatographie
    1. Laden der Probe auf eine Säule (2,5 cm Durchmesser, 20 cm lang) mit einer kationischen Matrix eine peristaltische Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml / min verwendet wird.
    2. Die Säule wird mit ca. 100 ml Laufpuffer (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris) -Puffer, pH 8,0) mit einer Gradientenpumpe mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml / min verwendet wird.
    3. Um das Protein zu eluieren, Waschen der Säule bei 10 ml / min mit steigenden Konzentrationen von Natriumchlorid (NaCl) in Tris-Puffer: 150, 500 und 1000 mM NaCl-Endkonzentration, 150 ml jeder Konzentration.
    4. Da das Protein bei einer NaCl-Konzentration von 500 mM eluierte, sammelt es in 50 ml-Fraktionen eines automatisierten Fraktionssammler verwendet.
      HINWEIS: Für einedetailliertes Protokoll der Ionenaustausch-Chromatographie konsultieren zuvor veröffentlichten Protokollen. 26
  5. Grßenausschlußchromatographie
    1. Konzentriere das 150 ml magnetoferritin auf ein Volumen von etwa 2 ml ein 15 ml Zentrifugenfiltereinheit durch eine 4 ml Volumeneinheit gefolgt werden. Wenden Sie sich an die Anweisungen des Herstellers der Schleuderfiltereinheiten (Materialliste) für ein detailliertes Protokoll dieses Verfahrens.
    2. Legen Sie die konzentrierte Probe auf eine Gelfiltrationssäule unter Verwendung einer Injektionsschleife.
    3. Die Säule wird mit Laufpuffer (50 mM Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 150 mM NaCl) bei einer Durchflussrate von 1,3 ml / min.
    4. Sammeln Sie 6 ml Fraktionen einen automatisierten Fraktionssammler verwendet wird. Protein-Monomere eluieren zuletzt. An diesem Punkt gereinigt magnetoferritin kann bei 4 ° C bis zur Kationisierung gespeichert werden.
      HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll der Grßenausschlußchromatographie eine Gelfiltrationssäule konsultieren mit previonuierlich Protokolle veröffentlicht. 27
  6. Die Bestimmung der Proteinkonzentration
    1. Vorbereitung Ferritin-Standards von 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 und 1 mg / ml in 50 mM Tris-Puffer handelsüblichen Pferd Milz-Ferritin verwendet.
      HINWEIS: Die Proteinkonzentration von kommerziell erhältlichen Ferritin auf der Flasche angesetzt. Wenn nicht, sich an den Lieferanten für diese Informationen.
    2. Verdünnen Sie magnetoferritin Proben unbekannter Konzentration in 50 mM Tris-Puffer, bis die Farbe der Lösung etwa die Farbe des mg / ml Standard 0,5 entspricht. Notieren Sie den Verdünnungsfaktor.
    3. In 10 ul jeder Standard und magnetoferritin Probe in dreifacher Ausführung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
    4. In 200 ul fertiger Bradford-Reagenz in jede Vertiefung (siehe Materialliste für Bradford-Assay-Reagenz Details).
    5. für 8 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Messen der Extinktion bei λ = 595 nm unter Verwendung vonein Mikroplatten-Reader.
    7. Zeichnen Sie die mittlere Absorption der Ferritin-Standards als Funktion der Proteinkonzentration und verwenden, um die Steigung und der linearen Anpassung der Konzentration der magnetoferritin Probe zu berechnen.
      HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen, dass verwendet wurde, die magnetoferritin Probe mit der Standardkurve einzustellen.

2. Magnetoferritin Kationisierung

  1. Allgemeine Bemerkungen
    HINWEIS: Für magnetoferritin Kationisierung, N, N - Dimethyl-1,3-propandiamin (DMPA) wurde an Asparagin- und Glutaminsäure-Reste auf der Oberfläche unter Verwendung von MF N - (3-dimethylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide - hydrochlorid (EDC).
    1. Tragen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur unter Rühren aus. Das Protokoll ist unten angegeben für die Kationisierung von 10 mg magnetoferritin in einem Gesamtvolumen von 5 ml (Proteinkonzentration 2 mg / ml). nach oben oder unten jedoch skalierendurch das Protein zu halten: DMPA: EDC-Verhältnisse konsistent sowie die Volumina des Puffers und magnetoferritin Lösung.
    2. Vor der Kationisierungsreaktion, dialysieren die magnetoferritin Proben in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7) 50 mM NaCl enthielt. Dies ist wichtig, Tris Elutionspuffer zu entfernen und unerwünschte Reaktionen zwischen dem Tris Amin und die EDC-aktivierten Carbonsäurereste zu vermeiden. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach der Dialyse und stellen Sie es auf 4 mg / ml vor der Kationisierung.
  2. Kationisierung Protokoll
    1. Man wiegt 374 mg DMPA und lösen sich in 2,5 ml 200 mM 2- (N - Morpholino) ethansulfonsäure (MES) Puffer.
    2. Stellen Sie die Lösung pH auf etwa 7 unter Verwendung von konzentrierter (6 M) Salzsäure (HCl).
      ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug, als Zugabe der Säure zu DMPA frei giftige Dämpfe!
    3. In 2,5 ml magnetoferritin Lösung bei 4 mg / ml (endgültige Konzentration von MES 100 mM, Endkonzentration von magnetoferritin 2 mg / ml, Gesamtmenge an Protein beträgt 10 mg).
    4. Hinzufügen, einem Magnetrührer und rühre 2 Stunden äquilibrieren.
    5. justieren Sie vorsichtig die Lösung auf pH 5,0 mit 1 M HCl.
    6. In 141 mg EDC Pulver auf die DMPA / magnetoferritin Lösung.
    7. Fahren Sie für 3,5 Stunden gerührt worden.
    8. Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Spritzenfilter, um alle Präzipitate zu entfernen.
    9. Fügen Sie die Lösung in einen Dialyseschlauch mit einem 12-14 kDa Molekulargewicht cut-off und dialysiert gegen 4 l 50 mM Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 50 mM NaCl für 2 Tage bei 4 ° C, anstelle der Dialysepuffer mindestens drei Zeiten während dieser Zeit.
      HINWEIS: An diesem Punkt kationisierte magnetoferritin kann bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

3. humanen mesenchymalen Stammzellen Markierung mit kationisiertem Magnetoferritin

  1. Allgemeine Bemerkungen
    1. Führen Sie alle Zellkultur unter Verwendung von Klasse-II-Laminar-Flow-Schränke und befeuchteten Inkubatoren bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid-Atmosphäre.
    2. Kultur - Zellen als Monolayern mit 175 cm 2 - Kolben und 20 ml Kulturmedium, das alle 3 wieder aufgefüllt wurde - 4 Tage. Kulturmedium bestand aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 1.000 mg / L Glukose, 10% (v / v) fötales Rinderserum, 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin-Lösung, 1% (v / v) L alanyl-L-Glutamin-Lösung und 5 ng / ml frisch menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt.
  2. Magnetische Kennzeichnung von hMSC mit kationisierten magnetoferritin
    1. Seed 150.000 hMSCs in 25 cm 2 Flaschen und lassen über Nacht bei 37 ° C zu halten.
    2. Filter sterilisieren kationisierten magnetoferritin durch ein 0,22 um-Spritzenfilter und Bestimmung der Proteinkonzentration.
    3. Halten sterilen Bedingungen, bereiten eine 0,5 & mgr; M Lösung von kationisierten magnetoferriZinn in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Halten Sie in einem sterilen Kultur Kapuze mit einer Kappe bedeckt bis zur Verwendung.
    4. Waschen der plattierten Zellen mit 2 ml PBS Raumtemperatur.
    5. 1 ml der sterilisierten kationisierte magnetoferritin Lösung der plattierten Zellen und Inkubation für den gewünschten Zeitraum (1 min bis 1 h).
    6. Wasche die Zellen mit PBS und dann Ernte die Zellen durch 0,5 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure Zugabe (EDTA) gegeben und 5 min bei 37 ° C inkubiert.
    7. 1 ml Kulturmedium, um das Trypsin / EDTA wird die Lösung in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 524 x g zu inaktivieren.
    8. Überstand verwerfen und resuspendiere das Zellpellet in 0,5 ml magnetische Trennpuffer, bestehend aus 0,5% (w / v) fötalem Rinderserum und 2 mM EDTA in PBS.
  3. Magnetzellseparation
    1. Befestigen Sie den Magneten an den Multiständer, und fügen Sie eine magnetische Trennsäule zum Magneten. Legen Sie eine Pre-Trennfilter auf the Spalte.
    2. Legen Sie 0,5 ml magnetische Trennpuffer in der Pre-Trennfilter und lassen Sie es laufen beide durch den Filter und die Säule zu waschen und zu nass sie.
    3. Legen Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen unter der Spalte.
    4. 0,5 ml der Zellsuspension in dem Filterbehälter der magnetischen Trennsäule.
    5. Wenn das Reservoir leer ist, fügen Sie 0,5 ml magnetische Trennung Puffer.
    6. Wenn das Reservoir leer ist, fügen Sie weitere 0,5 ml der magnetischen Trennpuffer.
    7. Wiederholen noch einmal (das Gesamtvolumen der magnetischen Trennpuffer zum Waschen verwendet wird, sollte 1,5 ml sein). Dieser Waschschritt eluiert alle nicht-magnetisierten Zellen aus der Säule (nicht magnetisierten Zellfraktion).
    8. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie sie in einem frischen 15 ml Zentrifugenröhrchen. Filter entfernen aus der Säule Reservoir.
    9. 1 ml der magnetischen Trennpuffer zum Vorratsbehälter und Druck unmittelbar durch die Säule durch den Kolben der Herstellung zugeführt unter Verwendung vonr. Dies eluiert die magnetisierten Zellen aus der Säule in die Zentrifugenröhre (magnetisiert Zellfraktion).
    10. Zentrifuge beide Röhrchen für 5 min bei 524 x g.
    11. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren die Zellpellets in 0,3 ml PBS.
    12. Zähle die Anzahl der Zellen-Nummern in jeder Fraktion unter Verwendung eines Hämozytometers.
    13. Bestimmen den Anteil von magnetisierten Zellen, M (%), unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-14321
      wobei n (M) die Anzahl der Zellen in der magnetisierten Fraktion beträgt und n (M + NM) ist die Summe aus der Anzahl der Zellen in den magnetisierten und nicht magnetisierten Fraktionen.
  4. Vorbereitung mit kationisierten magnetoferritin markierten hMSCs zur Quantifizierung Eisen mit induktiv gekoppeltem Plasma optische Emissionsspektroskopie unter Verwendung von (ICP-OES)
    HINWEIS: Das Protokoll muss möglicherweise für andere ICP-OES-Geräte angepasst werden. Es ist ratsam, mit der Wieder zu konsultierenverantwortlich Techniker.
    1. Zentrifuge mit einer bekannten Anzahl von Zellen für 5 min bei 524 x g.
    2. Entfernen Sie den PBS Überstand und Zugabe von 0,25 ml 50% (v / v) Salpetersäure.
    3. Vortex mischen der angesäuerten Zellsuspension.
    4. über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. In 4,75 ml destilliertem Wasser zu jeder Probe und Vortex-Mix.
    6. Analysieren Sie mit ICP-OES. 28
    7. Normalisieren der gemessenen Eisengehalt auf die Anzahl der Zellen einen Wert für die zelluläre Eisengehalt zu bestimmen.

Ergebnisse

TEM wurde verwendet Nanopartikel Mineralisierung innerhalb des Apoferritin Hohlraum zu bestätigen und die durchschnittliche Kerngröße (1A und 1B) bestimmen. Bildanalyse von ungefärbten magnetoferritin Proben ergaben einen durchschnittlichen Kerndurchmesser von 8,2 ± 0,7 nm und Aurothioglucose stain bestätigte die Anwesenheit von Nanopartikeln innerhalb des Proteins Käfig. Beachten Sie, dass die Bilder eine magnetoferritin Probe zeigen, die weiter gereinigt wurde magnetische Trennung unter Anwendung einheitlicher Nanopartikelkerne zu isolieren. Magnetoferritin Proben, die nicht magnetisch gereinigt wurden, haben einen etwas breiteren Kerngrößenverteilung. 29 Die Analyse der Struktur des magnetoferritin Kern ausgewählt flächige Elektronenbeugung zeigte die mögliche Anwesenheit der inversen Spinellstruktur auf Basis von Magnetit (Fe 3 O 4) und / oder Maghemit (γ-Fe 2 O 3), sowie die Spinellstruktur aufgrund Co 3 O 4. Darüber hinaus ergab Peaks Raman - Spektren zu Fe 3 O 4 zugeschrieben, geringe Mengen an γ-Fe 2 O 3 und ein Kobaltferrit (Abbildung 1 C). ICP-OES-Analyse von magnetoferritin zeigte einen Durchschnitt von 102 & mgr; g Eisen und 0,9 ug Kobalt pro Milligramm magnetoferritin.

Eine schematische ist im Preis enthalten ist , welche die nachfolgende Kationisierung Schritt (Abbildung 2 A). Die hydrodynamischen Durchmesser von magnetoferritin und kationisierte magnetoferritin betrug 11,8 ± 1,1 nm und 12,5 ± 1,4 nm bestimmt, wie durch dynamische Lichtstreuung bestimmt. Die Kationisierung Effizienz der kovalenten Kopplung an DMPA-magnetoferritin wurde mit zeta Potentiometrie und Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation Time-of-flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie beurteilt. Das Zeta-Potential geändert von -10,5 mV für MF bis + 8,3 mV für kationisierten magnetoferritin, eine BestätigungÄnderung der Oberflächenpotential von negativ auf positiv (Tabelle 1). Die Massenspektrometrie Experimente fand eine Untereinheit Molekulargewicht von 20,1 kDa für native apo-Ferritin und 21,1 kDa für kationisierten apo-Ferritin (Abbildung 2 B). Diese Massenzunahme entspricht etwa 12 gekoppelt DMPA Moleküle pro Protein-Untereinheit, und die Kationisierung von 288 Resten auf dem gesamten 24-Untereinheit-Protein.

Magnetische Sättigung und Empfindlichkeit wurden unter Verwendung von SQUID-Magnetometrie gemessen und Quer- und Längs Relaxivität wurden mittels Magnetresonanztomographie gemessen. Die magnetischen Eigenschaften waren ähnlich für magnetoferritin und kationisierte magnetoferritin, was darauf hinweist , dass Kationisierung vernachlässigbaren Einfluss auf die magnetischen Eigenschaften des umschlossenen SPION (Tabelle 1) hatte. Darüber hinaus sind diese Eigenschaften ähnlich zu anderen Eisenoxid basiert Nanopartikel, 19,30 Demonstrieren die magne kationisiertetoferritin wäre ebenso geeignet wie herkömmliche SPION-basierte MRI-Kontrastmittel in der Bildgebung Kontrast zu verbessern.

Nach einer 30-minütigen Belichtung wurde die Zelloberfläche dicht mit kationisierter magnetoferritin (Abbildung 3 A) abgedeckt. Jedoch nach einer Woche wurden keine Nanopartikel auf der Zelloberfläche (Figur 3 B) gefunden. Kationisierte magnetoferritin war bemerkenswert wirksam bei magnetisch Kennzeichnung hMSCs. Bemerkenswerterweise führte die Zellen zu kationisierte magnetoferritin Belichten für eine Minute in der Magnetisierung von 92% der Zellpopulation und der Lieferung von 3,6 pg Eisen pro Zelle. Erhöhung der Inkubationszeit auf 15 Minuten in der Magnetisierung der gesamten Zellpopulation ergab (Abbildung 3 C).

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Abbildung 1: Charakterisierung von magnetof erritin Kerne mit 5% Kobalt dotiert. TEM - Aufnahmen von magnetoferritin gefärbt mit Aurothioglucose (A) und ungefärbte (B). Inset zeigt entsprechende Elektronenbeugung mit Magnetit-Indizes. Maßstabsbalken: 20 nm. (C) Raman - Spektrum für magnetoferritin. Die Pfeile zeigen die Haupt Raman Schwingungsmoden für Kobaltferrit (T 2g), Magnetit und Maghemit (beide A 1g). 31,32 Die verwendete Laserwellenlänge war 532 nm. (Bild angepasst von Okuda et al. 18). Beachten Sie, dass diese magnetoferritin Probe weitere magnetische Trennung gereinigt worden war, unter Verwendung, die gleichmäßig belastet magnetoferritin Teilchen isoliert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Kationisierung von magnetoferritin. A) Lösungsmittel zugängliche Oberfläche Darstellungen , die die Verteilung der sauren (rot) und einfach (gelb) Aminosäurereste auf der Proteinoberfläche zeigt. Magnetoferritin (1) an kationisierter magnetoferritin modifiziert (2) durch Carbodiimid-vermittelte Vernetzung von DMPA zu sauren Aminosäureresten auf der Proteinoberfläche (3). B) Die Massenspektrometrie - Analyse von apo-Ferritin und kationisierte apo-Ferritin - Untereinheiten. Masse zu Ladung (m / z) Spektrum von Apoferritin (ApoF) und kationisierte Apoferritin (cat-ApoF), die durch MALDI-TOF. Eine Massenzunahme von 20,1 kDa auf 21,1 kDa nach Kationisierung beobachtet. (Bild angepasst von Correia Carreira et al. 15) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Magnetische Kennzeichnung und Zelltrennung von hMSCs mit kationisierten magnetoferritin inkubiert. A) TEM - Aufnahme von hMSCs nach einer 30-minütigen Inkubation mit kationisierter magnetoferritin. Der Pfeil weist auf das Vorhandensein magnetoferritin Kerne dicht auf der Zelloberfläche verpackt. Maßstabsbalken: 200 nm. B) TEM - Aufnahme von hMSC eine Woche nach der Etikettierung. Die Zelloberfläche ist klar kationisierter magnetoferritin. C) Untersuchung der Schnelligkeit , mit der magnetischen Kennzeichnung: 92% der Zellpopulation wurden magnetisiert nach einer einminütigen Exposition mit 0,5 uM kationisierte magnetoferritin und die gesamte Zellpopulation wurde innerhalb von 15 Minuten magnetisiert. Der Eisengehalt pro Zelle wurde ICP-OES ermittelt. Mittelwert und Standardabweichung von drei biologischen Replikaten gezeigt. (Bild angepasst von Correia Carreira et al. 15) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

MF Katze-MF
Hydrodynamischen Durchmesser [nm] 11,8 ± 1,1 12,5 ± 1,4
Das Zeta - Potential [mv] (-) 10,4 ± 0,2 8,3 ± 0,7
Magnetische Sättigungsmoment [Am 2 kg -1] 54,9 ± 1,6 55,3 ± 1,4
Massen Anfälligkeit [x 10 4 m 3 kg -1] 1,75 ± 0,08 1,75 ± 0,07
Longitudinal Relaxivität [mM -1 s -1] 2,6 ± 0,1 2,3 ± 0,1
Quer Relaxivität [mM -1 s -1] 44,6 ± 1,0 52,8 ± 0,8

Tabelle 1: Physikalisch - chemische Charakterisierung von magnetoferritin (MF) und kationisierte magnetoferritin (cat-MF). (Tabelle von Correia Carreira et al angepasst. 15)

Diskussion

TEM von magnetoferritin Proben gefärbt mit Aurothioglucose zeigte die erfolgreiche Mineralisierung von Nanopartikeln innerhalb des Proteinkäfig. Elektronenbeugung und Raman-Analyse der Nanopartikel-Kern zeigte die Anwesenheit eines Kobaltferrit, was anzeigt erfolgreichen Dotierungs des Nanopartikels Kern mit Kobalt. Dies zeigt, dass Mischoxid-Nanopartikel erfolgreich mineralisierte innerhalb der apo-Ferritin Hohlraum sein kann. Darüber hinaus haben wir gezeigt, daß die zuvor Kobaltdotierung durch Veränderung der Menge an Kobalt Vorstufe zu dem Reaktionsgemisch zugegeben variiert werden kann, die Abstimmung der magnetischen Eigenschaften ermöglicht. 18

Magnetoferritin Synthese kann in einer Vielzahl von Gefäßen durchgeführt werden, solange sie dicht verschließbaren sind und Zugangsöffnungen , durch die Reaktanden eingeführt werden können (beispielsweise in einem Dreihalsrundkolben). Die Reaktionstemperatur sollte, indem das Gefäß auf 65 ° C gehalten werden, entweder inein Wasser / Ölbad oder ein Doppelmantelgefäß mit. Hier verwendeten wir einen Doppelmantelaufbau elektrochemischen Zelle, um die Synthese durchzuführen. Zu gewährleisten erfolgreiche Synthese, den richtigen pH aufrechtzuerhalten und Sauerstoffkontamination der wässrigen Lösungen zu vermeiden, ist von entscheidender Bedeutung. Metallsalzlösungen sollten immer frisch vor vorbereitet werden und nicht zu verwenden, als im Voraus. Darüber hinaus können kommerzielle Apoferritin - Lösungen in Qualität variieren und Synthese Ergebnis beeinflussen (z. B. Größe der Nanopartikel - Kern mineralisierten). Es kann helfen, die Apoferritin-Lösung in 50 mM HEPES-Puffer (pH 8,6) vor der Synthese zu dialysieren restliche Reduktionsmittel vom Hersteller verwendet zu entfernen. Es ist nützlich, notieren Sie die Chargennummer des apo-Ferritin-Lösung für die Synthese verwendet zu machen, so kann es speziell vom Hersteller sollten zusätzliches Material notwendig gekauft werden angefordert werden. Darüber hinaus sollte die Proteinkonzentration von im Handel erhältlichen apo-Ferritin auf der Flasche angegeben werden, woverwendet werden, um das Volumen von apo-Ferritin-Lösung zur Synthese erforderlich zu berechnen. Ist dies nicht der Fall ist, sich an den Lieferanten für diese Informationen.

Der Vorteil der schrittweisen Zugabe von Metallsalzen und Wasserstoffperoxid - wie hier und in früheren Berichten dargestellt - ist , dass die Mineralisierung des Nanopartikels Kern so gesteuert werden kann , dass unterschiedliche Belastungsfaktoren (dh Nanopartikels Größen) erreicht werden kann. Darüber 33 ist es möglich , zu reinigen magnetoferritin ferner eine Säule magnetische Trennung unter Verwendung von , beispielsweise eine Säule , die mit rostfreiem Stahlpulver innerhalb eines Elektromagneten befestigt ist . Daher 34, hochmonodispersen Nanopartikelkerne können aus der Masse magnetoferritin Probe isoliert werden. Jedoch für die magnetische Zellmarkierung wie hier dargestellt ist dies nicht erforderlich. Eine Einschränkung magnetoferritin Synthese ist die relativ geringe Syntheseausbeute von etwa 10%, und die relativ hohen Kosten der kommerziellen apo-ferritin Lösungen. Es können jedoch auch apo-Ferritin von billig verfügbar Pferd Milz durch folgenden etablierten de-Mineralisierung Protokolle Ferritin hergestellt werden. 16

Kationisierung von magnetoferritin durch Zugabe eines molaren Verhältnis von 250 Molekülen DMPA und 50 Molekülen pro EDC negativ geladenen Rest (Berechnungen auf der Basis der Aminosäuresequenz von Pferde Milz-Ferritin) erzielt wurde. Dieser Überschuss an Reagenz über Protein führte zu hohen Kationisierung Effizienz, vergleichbar auch für die Kationisierung von Ferritin zuvor berichteten Ergebnisse. 35 für die MALDI-TOF - Analyse, Apoferritin und kationisierte Apoferritin wurden wegen der übermäßigen Molekularmasse des magnetoferritin Kern verwendet. Um ergeben hohe Kationisierung Effizienz, optimaler pH-Wert ist auch von entscheidender Bedeutung. EDC-vermittelte Vernetzung ist am effektivsten, unter leicht sauren Bedingungen, und wir fanden, dass pH 5 optimal Kationisierung Ergebnisse für magnetoferritin ergab. Jedoch für andere Proteine ​​cationization pH kann optimiert werden müssen. Kationisierung an oder nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins sollte vermieden werden, da dies zu schweren Ausfällen führen kann.

Die Stammzell Magnetisierung mit kationisierten magnetoferritin war sehr effizient und erreicht werden konnte Inkubationszeiten deutlich unter 30 Minuten unter Verwendung. Selbst eine einminütigen Inkubation führte zu einer zellulären Eisengehalt von 3,6 pg, die innerhalb der gemeldeten Bereich ist erforderlich, um T2 und T2 beeinflussen * Kontrast für MRI. 36,37 Es ist auch bemerkenswert , dass diese effiziente Markierung mit niedrigen extrazellulären Eisenkonzentrationen erreicht wird. Zum Beispiel mit früheren Studien anionische Nanopartikel berichten Eisengehalt von 10 pg pro Zelle nach einer 30-minütigen Inkubationszeit mit 5 mM Eisen. 38 Im Vergleich dazu Inkubation mit einem kationisierten magnetoferritin Lösung , die 0,5 & mgr; M - Protein mit etwa 0,2 mM Eisen entspricht Inkubation enthält und auch etwa 10 pg Eisen pro cel ergibtl nach 30 Minuten. Wir waren eindeutig nicht in der Lage, um alle endozytotische Vesikel identifizieren TEM. Jedoch fand früheren Studien kationisierte Ferritin mit, dass die Internalisierung innerhalb der ersten zehn Minuten der Exposition aufgetreten. 39,40 kationisierte Ferritin konnte in beschichteten Vesikeln lokalisiert werden, was darauf hinweist clathrin- oder Caveolin-abhängige Endozytose. Dieselben Studien berichteten auch, dass nach 30 Minuten Inkubation kationisierte Ferritin noch auf der Zelloberfläche war, sowie in multivesikulären Körpern, ähnlich Lysosomen.

Weitere Anwendungen könnten Kationisierung von apo-Ferritin Käfige beladen mit anderen Nanoteilchen und / oder funktionelle Moleküle, wie Antikrebsmittel 41 oder Quantenpunkte 42 umfassen. Die Kationisierung dieser Ferritin-Konstrukte könnten schneller und effizienter Lieferung ihrer Ladung zu Zellen führen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Fisher ScientificBPE310-1powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleenSigma AldrichA3641we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate Sigma AldrichC6768prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate Sigma AldrichF1543prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%)Sigma Aldrich216763prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrateSigma AldrichS1804powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micronMerck MilliporeSLGP033RSsyringe filter
Trizma baseSigma AldrichT1503powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chlorideSigma Aldrich31434poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter unitsMerck Millipore4310Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untisMerck MilliporeUFC801024Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare17-1287-04we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare17-1196-01this column was bought ready packed
ÄKTA purifier systemGE Healthcare28406264
sample pump P-960GE Healthcare18-6727-00load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00
Bradford assay reagentSigma AldrichB6916solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleenSigma AldrichF4503prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)Sigma Aldrich308110CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)Sigma AldrichE6383keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)AppliChemA0689,0500powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membraneSigma AldrichD9652soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucoseSigma AldrichD5546warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serumSigma AldrichF7524add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solutionSigma AldrichP0781add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solutionGibco35050-087add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factorPeproTech100-18Badd to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered salineSigma AldrichD8537sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solutionSigma AldrichE5134keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma AldrichE5134powder; make a 2 mM solution in PBS 
bovine serum albuminSigma AldrichA7030add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand Miltenyi Biotec130-042-303for attachment of MACS magnet
MACS MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnetMiltenyi Biotec130-042-102can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filterMiltenyi Biotec130-041-40730 mm filter
Nitric acid solution, 64-66%Sigma Aldrich7006
Titrando 907, syringe pumpMetrohm2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5Molecular DevicesUsed to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EXJEOLUsed for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometerRenishawUsed for Raman spectroscopy
Torus DPSS laserLaser QuantumUsed for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtremeApplied BiosystemsUsed for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZSMalvern InstrumentsUsed to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement SystemQuantum DesignUsed to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom SkyraSiemensUsed to determine longitudinal and transverse relaxivity 
Tecnai 12 BioTwin SpiritFEIUsed for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OESAgilentUsed to determine iron content in cells

Referenzen

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