Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

Resumo

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Resumo

Muitas aplicações biomédicas importantes, tais como imagens de células e manipulação remota, pode ser alcançado por marcação das células com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIONs). Alcançar a captação celular suficiente de SPIONs é um desafio que tem sido tradicionalmente atendidas por exposição de células a concentrações elevadas de SPIONs ou ao prolongar os tempos de exposição (até 72 horas). No entanto, estas estratégias são susceptíveis de mediar a toxicidade. Aqui, nós apresentamos a síntese do magnetoferritin spion à base de proteína, bem como um protocolo de funcionalização da superfície que permite a fácil magnetização celular rápida utilizando baixas concentrações de exposição. O núcleo de spion magnetoferritin consiste em óxido de ferro dopado com cobalto com um diâmetro médio de partícula de 8,2 nm mineralizado no interior da cavidade de baço de cavalo apo-ferritina. cationiza�o química de magnetoferritin produziu um romance, spion altamente membrana ativa que magnetizado células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) utilizando tempos de incubação comocurta como as concentrações de um minuto e ferro como baixos como 0,2 mm.

Introdução

Superfície de ligação ou internalização de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIONs) permitiu a magnetização de uma variedade de tipos de células para aplicações tais como imagiologia e manipulação remota. ¹ No entanto, a realização de magnetização suficiente celular pode ser um desafio, nomeadamente quando a interacção entre o spion e a superfície celular é fraca. ² Nas concentrações últimos, a exposição prolongada ou alta spion têm sido empregadas como estratégias para superar este desafio. ^3,4 No entanto, essas estratégias são problemáticos, porque eles aumentam a toxicidade ^5,6 e ter sucesso muito limitado em tipos de células com taxas de internalização baixos, como os linfócitos. ⁷ Para aumentar a absorção celular de SPIONs, abordagens de funcionalização de superfície vários foram exploradas. Por exemplo, os anticorpos têm sido utilizados para promover a endocitose mediada por receptor, ^8, enquanto a absorção não-específica pode ser conseguida utilizando uma transfecção^9,10 gents ou espécies de penetração de células, tais como o HIV TAT-péptido. ^11,12 No entanto, abordagens de anticorpos e péptido de funcionalização são limitados por reagentes dispendiosos e preparação sintética complexa, enquanto agentes de transfecção pode induzir a precipitação de nanopartículas e afectar negativamente a função da célula. ^13,14

Recentemente, referiram a síntese de magnetoferritin quimicamente cationizada, um romance spion que foi altamente eficaz em células estaminais mesenquimais humanas de magnetização (hMSCs) usando tempos de incubação tão curtos como um minuto. ¹⁵ Magnetoferritin é sintetizado através da reconstituição de um spion no interior da cavidade desmineralizada da ferritina proteína de armazenamento de ferro. ¹⁶ Este spion à base de proteínas combina muitas propriedades que o tornam bem adaptado para a magnetização de células, tais como o controlo sobre as propriedades magnéticas do núcleo magnético, ^17-19 e biocompatibilidade e solubilidade aquosa conferidos pelo invólucro de proteína. Mais distantemais, a funcionalização da superfície é facilmente conseguido devido aos aminoácidos endereçáveis que pode ser quimicamente ou geneticamente modificada ^{20-22. 23-25} Mostrámos que cationização química dos resíduos de aminoácidos acídicos da casca de proteínas gera uma nanopartícula estável que prontamente interagiu com domínios aniónicas sobre a superfície celular levando a magnetização celular rápida e persistente. Este procedimento elimina a necessidade de funcionalização laboriosa e protocolos de incubação prolongados, e, devido ao mecanismo de marcação não-específica desta estratégia magnetização rápida deve encontrar aplicação generalizada em outros tipos de células. Aqui, apresentamos um profundo relatório do método de marcação celular ultra-rápido, incluindo protocolos detalhados de síntese, purificação e superfície funcionalização de magnetoferritin cationizada.

Protocolo

células-tronco mesenquimais humanas (HMSC) foram colhidas a partir da medula óssea do fémur proximal de pacientes com osteoartrite submetidos a cirurgia de substituição total do quadril, em plena conformidade com as orientações do Comitê de Ética Bristol Southmead Hospital Research (referência # 078/01) e após o consentimento dos pacientes foi obtido.

1. Magnetoferritin síntese e purificação

1. Observações gerais
   1. Realizar Síntese magnetoferritin em, um vaso de reacção com camisa dupla passível de ser vedado a 65 ° C sob atmosfera de azoto para restringir a oxidação dos precursores de metal. Injectar as soluções de sal de metal e de peróxido de hidrogénio através de portas de acesso na tampa para dentro do vaso reaccional utilizando uma bomba de seringa.
   2. Após a síntese magnetoferritin, purificar a proteína por cromatograf ia de permuta aniónica (ver secção 1.4) para remover nanopartículas não fechado na cavidade de proteína, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho (ver secção 1.5) para isolar monómeros proteicos. deconcentração de proteína termine usando um ensaio de Bradford (ver secção 1.6).
2. Preparações antes da síntese
   1. Desoxigena-se 500 ml de água desionizada através da colocação de um tubo ligado a um cilindro de gás de azoto na água, selando o recipiente com película aderente e borbulhar de gás azoto durante aproximadamente 60 min.
   2. Aquecer num banho de água ligado ao vaso de reacção com revestimento duplo a 65 ° C. Adicionar 75 ml de mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tampão 50 (pH 8,6) para dentro do vaso de reacção, selar o recipiente, e retiram o oxigénio, fazendo borbulhar azoto gasoso através da solução tampão durante aproximadamente 20 min. Ao mesmo tempo, agita-se a solução tampão, utilizando um agitador magnético.
   3. Após a desoxigenação da solução tampão HEPES, retirar o tubo de fornecimento do gás de azoto a partir do tampão e mantê-lo em suspensão no vaso para manter uma atmosfera de azoto. Adicionar apo-ferritina para atingir uma concentração final de 3 mg / meu. Continuar a agitação magnética, mas reduzir a velocidade de agitação se formação de espuma ocorre.
   4. Prepara-se uma solução de estoque 25 mM de hepta-hidrato de sulfato de cobalto por dissolução de 0,19 g em 50 ml de água desionizada desoxigenado.
   5. Prepara-se uma solução de 25 mM de solução de sulfato hexa-hidratado de amónio e ferro por dissolução de 0,98 g em 100 ml de água desionizada desoxigenado.
   6. Remover 2,5 mL da solução de hexa-hidrato de sulfato de amónio e ferro e substituir com 2,5 ml de hepta-hidrato de sulfato de cobalto.
   7. Prepara-se uma solução 8,33 mM de peróxido de hidrogénio em água desionizada desoxigenada pela primeira adição de 965 ul de uma solução de peróxido de hidrogénio (30% w / w) a 9 ml de água desionizada desoxigenada, e, em seguida, adicionando 1 ml desta sub-estoque para 99 ml de água deionizada oxigenado.
3. síntese Magnetoferritin
   1. Injectar 10,1 ml de tanto o precursor de ferro-cobalto e o peróxido de hidrogénio em simultâneo na solução de apo-ferritina (s magneticamentetirred) a um caudal de 0,15 mL / min utilizando duas bomba de seringa (volume total injectado: 20,2 ml).
   2. Durante o período de injecção, desoxigenar mais 500 ml de água desionizada.
      NOTA: O conteúdo do vaso de reacção gradualmente adoptar uma cor castanho escuro que a reacção prossegue.
   3. Pouco antes da conclusão da primeira injecção, prepare-se mais 100 ml de precursor de ferro-cobalto e solução de peróxido de hidrogênio utilizando a água deionizada recém-oxigenado.
   4. Repita o passo de injecção descrita em 1.3.1 usando soluções recentemente preparadas de ferro-cobalto e peróxido de hidrogênio.
   5. Durante o período de injeção, desoxigenação mais 500 ml de água deionizada, e proceda conforme descrito em 1.3.3 e 1.3.4.
   6. Após a terceira injecção, deixar a solução a amadurecer durante 15 minutos sob agitação.
   7. Adicionar 1,5 ml de uma solução de citrato de sódio 1 M para o recipiente de reacção para quelar iões metálicos livres na solução.
   8. Remover a solução da reacçãonavio em 50 ml de tubos de centrífuga, centrifugação durante 30 min a 4350 xg e passar o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22? m. Nesta fase, o sobrenadante filtrado pode ser armazenado a 4 ° C até à purificação.
4. Cromatografia de troca iônica
   1. Carregar a amostra sobre uma coluna (2,5 cm de diâmetro, 20 cm de comprimento) contendo uma matriz catiónica, utilizando uma bomba peristáltica a um caudal de 10 ml / min.
   2. Lava-se a coluna com cerca de 100 ml de tampão de corrida (tampão de 50 mM de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 8,0) utilizando uma bomba de gradiente, a um caudal de 10 ml / min.
   3. Para eluir a proteína, lava-se a coluna a 10 ml / min, com concentrações crescentes de cloreto de sódio (NaCl) em tampão de Tris: 150, 500 e 1000 mM de concentração final de NaCl, 150 ml de cada concentração.
   4. Como a proteína elui a uma concentração de NaCl de 500 mM, recolhê-lo em fracções de 50 ml utilizando um colector de fracções automático.
      NOTA: Para umprotocolo detalhado de cromatografia de permuta iónica consultar protocolos previamente publicados. ²⁶
5. A cromatografia de exclusão de tamanho
   1. Concentra-se os 150 ml de magnetoferritin até um volume de aproximadamente 2 ml, utilizando uma unidade de filtração centrífuga de 15 ml, seguido por uma unidade de volume de 4 ml. Consulte as instruções do fabricante das unidades de filtro centrífugos (ver lista de materiais) para um protocolo detalhado deste procedimento.
   2. Carregar a amostra concentrada numa coluna de filtração em gel, utilizando uma ansa de injecção.
   3. Lava-se a coluna com tampão de corrida (50 mM de tampão Tris, pH 8,0, contendo NaCl 150 mM) a uma taxa de fluxo de 1,3 ml / min.
   4. Recolha 6 ml frações usando um colector de fracções automático. monômeros de proteínas eluir passado. Neste ponto, magnetoferritin purificado pode ser armazenado a 4 ° C até à cationização.
      NOTA: Para um protocolo detalhado de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando uma coluna de filtração em gel consultar previously protocolos publicados. ²⁷
6. Determinar a concentração de proteína
   1. Preparar padrões de ferritina de 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 mg / ml em tampão Tris 50 mM usando disponível comercialmente ferritina de baço de cavalo.
      NOTA: A concentração de proteína da ferritina comercialmente disponível é indicado no frasco. Se não, entre em contato com o fornecedor para obter essa informação.
   2. Diluir as amostras magnetoferritin de concentração desconhecida em tampão Tris 50 mM até a cor da solução aproximadamente combine com a cor do 0,5 mg / ml de padrão. Faça uma nota do factor de diluição.
   3. Adicionam-se 10 ul de cada amostra e padrão magnetoferritin em triplicado em poços de uma placa de 96 poços.
   4. Adicionar 200 mL de reagente de Bradford ready-made a cada poço (consulte a lista de materiais para Bradford detalhes reagente de ensaio).
   5. Incubar à temperatura ambiente durante 8 minutos.
   6. Medir a absorvância a λ = 595 nm, utilizandoum leitor de microplacas.
   7. Traça-se a absorvância média dos padrões de ferritina como uma função da concentração de proteína e usar o declive e ordenada na origem da ajuste linear para calcular a concentração da amostra magnetoferritin.
      NOTA: Levar em conta o factor de diluição, que foi utilizado para ajustar a amostra magnetoferritin com a curva padrão.

2. Magnetoferritin cationiza�o

1. Observações gerais
   NOTA: Para cationização magnetoferritin, N, N-dimetil-1,3-propanodiamina (DMPA) foi acoplado a resíduos de ácido aspártico e glutâmico na superfície do MF, utilizando N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida N '(EDC).
   1. Efectua-se a reacção à temperatura ambiente sob agitação. O protocolo é dada a seguir para a cationização de 10 mg de magnetoferritin em um volume total de 5 ml (concentração de proteína de 2 mg / ml). No entanto, escalar para cima ou para baixo, mantendo a proteína: DMPA: rácios EDC consistente, bem como os volumes de solução tampão e magnetoferritin.
   2. Antes da reacção de cationização, dialisar as amostras magnetoferritin em tampão 50 mM de fosfato (pH 7) contendo 50 mM de NaCl. Isto é importante para remover o tampão de eluição de Tris e evitar reacções indesejadas entre a amina Tris e os resíduos de ácidos carboxílicos de EDC-activados. Determinar a concentração de proteína após diálise e ajustá-lo a 4 mg / ml antes da cationização.
2. protocolo cationiza�o
   1. Pesar 374 mg de DMPA e dissolvem-se em 2,5 mL de 200 ácido etanossulfónico (MES) mM de tampão de 2- (N-morfolino).
   2. Ajuste o pH da solução a cerca de 7 utilizando (6 M) de ácido clorídrico concentrado (HCl).
      ATENÇÃO: Execute esta etapa em um exaustor, como a adição do ácido para DMPA libera vapores tóxicos!
   3. Adicionar 2,5 ml de solução magnetoferritin a 4 mg / mL (final de concentração de MES é 100 mM, concentração final de magnetoferritin é de 2 mg / ml, a quantidade total de proteína é de 10 mg).
   4. Adicionar um agitador magnético e agitou-se durante 2 horas para equilibrar.
   5. Cuidadosamente ajustar a solução para pH 5,0 utilizando HCl 1 M.
   6. Adicionar 141 mg de EDC em pó à solução de DMPA / magnetoferritin.
   7. Continuar a agitação durante 3,5 h.
   8. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M para remover quaisquer precipitados.
   9. Adicionar a solução para tubo de diálise com um peso de 12-14 kDa molecular de corte e dializar contra 4 L de tampão de 50 mM de fosfato (pH 7) contendo NaCl a 50 mM durante 2 dias a 4 ° C, substituindo o tampão de diálise, pelo menos, três vezes durante esse período.
      NOTA: neste momento, magnetoferritin cationizada pode ser armazenado a 4 ° C até uso posterior.

3. mesenquimais humanas Labeling Stem Cell com cationizada Magnetoferritin

1. Observações gerais
   1. Realizar toda a cultura de células utilizando classe II cabines de fluxo laminar e incubadoras umidificado a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono.
   2. Células de cultura como monocamadas usando 175 ^cm2 frascos e 20 ml de meio de cultura, que foi reabastecido a cada 3 - 4 dias. O meio de cultura consistia em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), contendo 1000 mg / L de glucose, 10% (v / v) de soro fetal bovino, 1% (v / v) de solução de penicilina / estreptomicina, 1% (v / v) L -alanil-L-glutamina e solução de factor de crescimento de fibroblastos humano 5 ng / ml de fresco suplementado.
2. Rotulagem magnética de hMSC com magnetoferritin cationizada
   1. Semente 150.000 hMSCs em 25 cm ² frascos e deixar a aderir durante a noite a 37 ° C.
   2. Filtrar esterilizar magnetoferritin cationizados, através de um filtro de seringa de 0,22 um e determinar a concentração de proteína.
   3. Mantendo condições estéreis, preparar uma solução de 0,5 uM magnetoferri cationizadaestanho em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Manter tampado em uma capa de cultura estéril até o uso.
   4. Lavam-se as células plaqueadas com 2 ml de PBS temperatura ambiente.
   5. Adicionar 1 ml de solução magnetoferritin cationizada esterilizado para as células plaqueadas e incubar durante o período de tempo desejado (1 min a 1 h).
   6. Lavar as células com PBS e, em seguida, as células de colheita por adição de 0,5 ml de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubando a 37 ° C durante 5 min.
   7. Adicionar 1 ml de meio de cultura para inactivar a tripsina / EDTA, transferir a solução para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar durante 5 minutos a 524 x g.
   8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 0,5 ml de tampão de separação magnética, consistindo em 0,5% (w / v) de soro fetal de bovino e 2 mM de EDTA em PBS.
3. Separação magnética de células
   1. Fixe o íman ao multi posição, e adicionar uma coluna de separação magnética para o ímã. Colocar um filtro de pré-separação em the coluna.
   2. Colocar 0,5 ml de tampão de separação magnética no filtro de pré-separação e deixá-lo funcionar tanto através do filtro e a coluna de lavagem e molhá-los.
   3. Coloque um tubo de centrífuga de 15 ml, sob a coluna.
   4. Adicionar 0,5 ml de suspensão de células no reservatório do filtro da coluna de separação magnética.
   5. Quando o reservatório está vazio, adicionar 0,5 ml de tampão de separação magnética.
   6. Quando o reservatório está vazio, adicionar mais 0,5 ml de tampão de separação magnética.
   7. Repetir mais uma hora (o volume total de tampão de separação magnética usada para a lavagem deve ser de 1,5 mL). Este passo de lavagem elui todas as células não-magnetizados do (fracção de células não-magnetizado) coluna.
   8. Remova a coluna do ímã e coloque-o em um 15 ml novo tubo de centrífuga. Remover filtro do reservatório coluna.
   9. Adicionar 1 ml de tampão de separação magnética para o reservatório e imediatamente empurrar através da coluna utilizando o êmbolo fornecido pelo fabricanter. Este elui nas células magnetizadas a partir da coluna para o tubo de centrifugação (fracção de células magnetizado).
   10. Centrifugar ambos os tubos durante 5 min a 524 x g.
   11. Descartar o sobrenadante e re-suspender as pelotas de células em 0,3 ml de PBS.
   12. Contar o número de números de células em cada uma das fracções usando um hemocitómetro.
   13. Determinar a fracção de células magnetizadas, H (%), usando a seguinte equação:
       
       onde n (M) é o número de células na fracção magnetizado e n (M + NM) é a soma do número de células nas fracções magnetizadas e não magnetizadas.
4. Preparando hMSCs marcadas com magnetoferritin cationizada para a quantificação de ferro usando plasma indutivamente acoplado a espectroscopia de emissão óptica (ICP-OES)
   NOTA: O protocolo pode precisar ser adaptado para outros instrumentos ICP-OES. É aconselhável consultar com o retécnico de sável.
   1. Centrifugar um número conhecido de células durante 5 min a 524 x g.
   2. Remover o sobrenadante e adicionar PBS 0,25 ml de 50% (v / v) de ácido nítrico.
   3. Vortex misturar a suspensão de células acidificada.
   4. Incubar à temperatura ambiente durante a noite.
   5. Adicionar 4,75 ml de água destilada a cada amostra e mistura de vórtice.
   6. Analisar com o ICP-OES. ²⁸
   7. Normalizar o teor de ferro medido como o número de células para determinar um valor para o teor de ferro celular.

Resultados

MET foi usada para confirmar a mineralização de nanopartículas no interior da cavidade apoferritina e determinar o tamanho médio do núcleo (Figuras 1A e 1B). A análise de imagem de amostras não coradas magnetoferritin deu um diâmetro médio do núcleo de 8,2 ± 0,7 nM, e mancha aurotioglucose confirmou a presença de nanoparticulas dentro da gaiola de proteína. Note-se que as imagens mostram um exemplo magnetoferritin que foi adicionalmente purificado utilizando separação magnética para isolar núcleos de nanopartículas uniformes. Magnetoferritin amostras que não foram purificadas magneticamente tem uma distribuição mais ampla de tamanho ligeiramente núcleo. ²⁹ Análise da estrutura do núcleo magnetoferritin utilizando-área seleccionada de difracção de electrões indicou a possível presença da estrutura inversa espinela baseado em magnetite (Fe ₃ O ₄₎ e / ou maghemite (γ-Fe ₂ O _3), bem como a estrutura espinélio devido à Co ₃ O _4. Além disso, os espectros Raman revelou picos atribuídos ao Fe ₃ O _4, pequenas quantidades de γ-Fe ₂ O _3, e uma ferrite de cobalto (Figura 1 C). A análise ICP-OES de magnetoferritin mostrou uma média de 102? g de ferro e 0,9 ug de cobalto por miligrama de magnetoferritin.

Um esquema está incluído, que ilustra o passo de cationização subsequente (Figura 2 A). O diâmetro hidrodinâmico de magnetoferritin e magnetoferritin cationizada foi de 11,8 ± 1,1 nm e de 12,5 ± 1,4 nm, respectivamente, conforme determinado por dispersão de luz dinâmica. A eficiência de cationização covalente DMPA-acoplamento para magnetoferritin foi avaliada utilizando potenciometria Zeta e do laser de ionização de dessorção de tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa assistida por matriz. O potencial zeta passou de -10,5 mV para MF para + 8,3 mV para magnetoferritin cationizada, confirmando umaalteração no potencial de superfície de negativo para positivo (Tabela 1). Experiências de espectrometria de massa encontrado um peso molecular subunidade de 20,1 kDa para apo-ferritina nativa e 21,1 kDa para cationizada apo-ferritina (Figura 2 B). Este aumento de massa corresponde a cerca de 12 moléculas de DMPA acoplados por sub-unidade de proteína, e a cationização de 288 resíduos de toda a proteína 24-subunidade.

saturação magnética e susceptibilidade foram medidos através de magnetometria SQUID e transversal e longitudinal relaxação foram medidos usando ressonância magnética. As propriedades magnéticas foram semelhantes para magnetoferritin e magnetoferritin cationizada, indicando que cationização teve impacto insignificante sobre as propriedades magnéticas da spion fechado (Tabela 1). Além disso, estas propriedades são semelhantes às outras nanopartículas à base de óxido de ferro, ^19,30, demonstrando que cationizada magnetoferritin seria tão adequados como agentes de contraste convencionais à base de spion MRI em aumento de contraste de imagem.

Após uma exposição de 30 minutos, a superfície da célula foi densamente coberto com magnetoferritin cationizada (Figura 3 A). No entanto, depois de uma semana, não há nanopartículas foram encontrados na superfície celular (Figura 3 B). magnetoferritin cationizada foi notavelmente eficaz em hMSCs magneticamente de rotulagem. Notavelmente, expondo as células a magnetoferritin cationizada durante um minuto resultou na magnetização de 92% da população de células e a entrega de 3,6 pg de ferro por célula. O aumento do tempo de incubação de 15 minutos resultou na magnetização de toda a população de células (Figura 3 C).

Figura 1: Caracterização de magnetof núcleos erritin dopado com 5% de cobalto. Imagens de TEM de magnetoferritin corados com aurotioglucose (A) e imaculada (B). O encarte mostra difração de elétrons correspondente com índices de magnetita. Barra de escala: 20 nm. (C) Raman espectro para magnetoferritin. As setas indicam os principais modos de ferrite de cobalto (T _{2 g),} magnetita e maghemita (ambos A _1g) Raman vibração. ^31,32 O comprimento de onda do laser utilizado foi de 532 nm. (Imagem adaptada do Okuda et ai. ^18). Note-se que esta amostra magnetoferritin tinha sido ainda purificado usando separação magnética, que isolado partículas magnetoferritin uniformemente carregado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

785fig2.jpg "/>
Figura 2: cationização de magnetoferritin. A) representações da área de superfície acessível ao solvente, mostrando a distribuição de ácida (vermelho) e resíduos de aminoácidos básicos (amarelo) na superfície da proteína. Magnetoferritin (1) é modificado para magnetoferritin cationizada (2) por ligação cruzada mediada por carbodiimida de DMPA de resíduos de aminoácidos ácidos sobre a superfície da proteína (3). B) A análise de espectrometria de massa de subunidades de Apo-ferritina apo-ferritina e cationizada. Massa-para-carga (m / z) Espectro de apoferritina (ApoF) e cationizada apoferritina (gato-ApoF) gerado por MALDI-TOF. Um aumento de massa de 20,1 kDa e 21,1 kDa é observado depois de cationização. (Imagem adaptada de Correia Carreira et al. ¹⁵⁾ Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: rotulagem magnética e separação de células de hMSCs incubadas com magnetoferritin cationizada. A) imagem TEM de hMSCs após uma incubação de 30 minutos com magnetoferritin cationizada. A seta indica a presença de núcleos magnetoferritin densamente compactados na superfície da célula. Barras de escala: 200 nm. B) imagem TEM de hMSC uma semana após marcação. A superfície celular está livre de magnetoferritin cationizada. C) A investigação da rapidez de rotulagem magnética: 92% da população de células foram magnetizados após uma exposição de uma hora com 0,5 uM magnetoferritin cationizados, e toda a população de células foi magnetizado dentro de 15 minutos. teor de ferro por célula foi determinada utilizando ICP-OES. Média e desvio padrão de três repetições biológicas são mostrados. (Imagem adaptada do Correia ¹ Carreira et al.5) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	MF	cat-MF
Diâmetro hidrodinâmico [nm]	11,8 ± 1,1	12,5 ± 1,4
Zeta potencial [mv]	(-) 10,4 ± 0,2	8,3 ± 0,7
Momento saturação magnética [AM 2 kg -1]	54,9 ± 1,6	55,3 ± 1,4
Susceptibilidade de massa [4 x 10 m 3 kg -1]	1,75 ± 0,08	1,75 ± 0,07
Relaxividade longitudinal [seg -1 mM -1]	2,6 ± 0,1	2,3 ± 0,1
Relaxação transversal [sec mM -1 -1]	44,6 ± 1,0	52,8 ± 0,8

Tabela 1: Caracterização físico-química de magnetoferritin (MF) e magnetoferritin cationizada (cat-MF). (Tabela adaptado de Correia Carreira et al. ¹⁵⁾

Discussão

MET de amostras coradas com magnetoferritin aurotioglucose revelou a mineralização de nanopartículas bem sucedido dentro do compartimento da proteína. difracção do electrão e a análise de Raman do núcleo de nanopartículas indicou a presença de uma ferrite de cobalto, indicando sucesso dopagem do núcleo de nanopartículas com cobalto. Isto demonstra que as nanopartículas de óxido misto pode com sucesso ser mineralizado dentro da cavidade de apo-ferritina. Além disso, mostrámos previamente que a dopagem de cobalto pode ser variada, alterando a quantidade de precursor de cobalto adicionados à mistura reaccional, a qual permite um ajuste das propriedades magnéticas. ¹⁸

Magnetoferritin síntese pode ser realizada numa variedade de vasos, contanto que eles estão firmemente selado e tem portas de acesso através do qual podem ser introduzidos reagentes (por exemplo, um-três tubuladuras balão de fundo redondo). A temperatura de reacção deve ser mantida a 65 ° C, quer por colocação do recipiente noum banho de água / óleo ou usar um vaso duplo com camisa. Aqui, utilizou-se uma configuração de duplo encamisado célula electroquímica para realizar a síntese. Para garantir a síntese bem sucedida, a manutenção do pH correcto e evitando a contaminação de oxigénio das soluções aquosas é crucial. soluções de sal de metal deve sempre ser preparada imediatamente antes da utilização, em vez de antes. Além disso, as soluções de apoferritina comerciais pode variar em qualidade e afectar resultado de síntese (por exemplo., O tamanho de nanopartículas núcleo mineralizada). Pode ajudar a dialisar a solução apoferritina em tampão HEPES 50 mM (pH 8,6) antes da síntese para remover qualquer agente de redução residual usado pelo fabricante. É útil para fazer uma nota do número do lote da solução apo-ferritina utilizado para a síntese, para que possa ser especificamente solicitado pelo fabricante deve necessidade material adicional para ser comprado. Além disso, a concentração de proteína disponível comercialmente apo-ferritina deve ser indicado no frasco, que podeser usada para calcular o volume de solução de apo-ferritina necessários para a síntese. Se este não for o caso, entre em contato com o fornecedor para obter essa informação.

A vantagem da adição gradual de sais de metal e de peróxido de hidrogénio - como apresentado aqui e nos relatórios anteriores - é que a mineralização do núcleo de nanopartículas pode ser controlada de tal modo que diferentes factores de carga (ou seja, tamanhos de nanopartículas) pode ser alcançado. ³³ Além disso, é possível purificar ainda mais magnetoferritin utilizando uma coluna de separação magnética, por exemplo, uma coluna com enchimento com pó de aço inoxidável protegido dentro de um electroíman. ³⁴ Assim, os núcleos de nanopartículas altamente monodispersas podem ser isoladas a partir da amostra magnetoferritin grandes quantidades. No entanto, para a marcação de células magnético, tal como apresentado aqui, esta não é necessária. Uma limitação da síntese magnetoferritin é o rendimento de síntese relativamente baixa de cerca de 10%, e o custo relativamente elevado de comercial de apo-Fesoluções rritin. No entanto, a apo-ferritina pode também ser preparado a partir de baço de cavalo barata disponível ferritina, seguindo protocolos estabelecidos desmineralização. ¹⁶

Cationização de magnetoferritin foi conseguida pela adição de uma razão molar de 250 moléculas de DMPA e 50 moléculas de EDC por resíduos carregados negativamente (os cálculos com base na sequência de aminoácidos de ferritina de baço de cavalo). Este excesso de reagente sobre proteína resultou em eficiências elevadas cationização, comparável também relatado anteriormente resultados para o cationiza�o de ferritina. ³⁵ Para a análise de MALDI-TOF, apoferritina e apoferritina cationizada foram utilizados devido à massa molecular excessivo do núcleo magnetoferritin. Para produzir eficiências altas cationização, pH ideal é também crucial. reticulação EDC-mediada é mais eficaz em condições ligeiramente ácidas, e descobrimos que pH 5 apresentaram resultados cationização ideais para magnetoferritin. No entanto, para outras proteínas Cationization pH pode necessitar de ser optimizado. Cationização no ou perto do ponto isoeléctrico da proteína deve ser evitada, pois esta pode levar à precipitação severa.

magnetização células estaminais com magnetoferritin cationizada foi altamente eficaz e pode ser conseguido utilizando tempos de incubação bem abaixo de 30 minutos. Mesmo uma incubação de uma hora resultou em um teor de ferro de 3,6 pg celular, que está dentro do intervalo descrito necessária para influenciar T2 e T2 * contraste para IRM. ^36,37 Também é notável que esta rotulagem eficiente é alcançada com baixas concentrações de ferro extracelulares. Por exemplo, estudos anteriores utilizando nanopartículas aniónicos relatam níveis de ferro de 10 pg por célula após um período de incubação de 30 minutos com ferro 5 mM. ³⁸ Em comparação, a incubação com uma solução magnetoferritin cationizada contendo 0,5 uM proteína corresponde a cerca de incubação com 0,2 mM de ferro e também produz cerca de 10 pg de ferro por CELl após 30 minutos. Nós não fomos capazes de identificar claramente as vesículas endocitose usando TEM. No entanto, estudos anteriores utilizando ferritina cationizada encontrado que a internalização ocorreu nos primeiros dez minutos da exposição. ^39,40 ferritina catiónica pode ser localizada em vesículas revestidas, indicando endocitose clathrin- ou dependentes de caveolin. Os mesmos estudos também relataram que, após 30 minutos de incubação, a ferritina cationizada ainda estava presente na superfície da célula, bem como em organismos multi-vesiculares, assemelhando-se lisossomas.

Outras aplicações podem incluir cationização de gaiolas apo-ferritina carregadas com outras nanopartículas e / ou moléculas funcionais, tais como drogas anti-cancro ⁴¹ ou ⁴² pontos quânticos. Cationização destas construções ferritina poderia resultar na distribuição mais rápida e mais eficiente da sua carga de células.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	BPE310-1	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen	Sigma Aldrich	A3641	we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	C6768	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate	Sigma Aldrich	F1543	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%)	Sigma Aldrich	216763	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate	Sigma Aldrich	S1804	powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron	Merck Millipore	SLGP033RS	syringe filter
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434	poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units	Merck Millipore	4310	Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis	Merck Millipore	UFC801024	Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare	17-1287-04	we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17-1196-01	this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system	GE Healthcare	28406264
sample pump P-960	GE Healthcare	18-6727-00	load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00
Bradford assay reagent	Sigma Aldrich	B6916	solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen	Sigma Aldrich	F4503	prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)	Sigma Aldrich	308110	CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma Aldrich	E6383	keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	AppliChem	A0689,0500	powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane	Sigma Aldrich	D9652	soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose	Sigma Aldrich	D5546	warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F7524	add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution	Sigma Aldrich	P0781	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solution	Gibco	35050-087	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor	PeproTech	100-18B	add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	D8537	sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution	Sigma Aldrich	E5134	keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134	powder; make a 2 mM solution in PBS
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7030	add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for attachment of MACS magnet
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet	Miltenyi Biotec	130-042-102	can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407	30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66%	Sigma Aldrich	7006
Titrando 907, syringe pump	Metrohm	2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5	Molecular Devices		Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX	JEOL		Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer	Renishaw		Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser	Laser Quantum		Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme	Applied Biosystems		Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS	Malvern Instruments		Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System	Quantum Design		Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra	Siemens		Used to determine longitudinal and transverse relaxivity
Tecnai 12 BioTwin Spirit	FEI		Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES	Agilent		Used to determine iron content in cells