in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Zusammenfassung

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

Zusammenfassung

Remodeling des Gehirns Gefäßen ist ein gemeinsames Merkmal von Hirnerkrankungen. In vivo sind Abbildungsverfahren grundlegende zerebrovaskulären Plastizität oder Beschädigung auftretende Verlängerung und in Bezug auf neuronale Aktivität oder den Blutfluss zu detektieren. In vivo Zweiphotonenmikroskopie ermöglicht die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Plastizität von großen Zelleinheiten in lebenden Gehirn. Insbesondere die ausgedünnten Schädel Fenster Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung der kortikalen Regionen von Interesse (ROI) ohne signifikante Entzündung des Gehirns zu induzieren. Repetitive Imaging-Sitzungen der kortikalen ROI sind möglich, während der Progression zahlreicher ZNS-Erkrankungen die Charakterisierung von Krankheits Kennzeichen im Laufe der Zeit bieten. Diese Technik der Pia-Strukturen innerhalb von 250 & mgr; m des Gehirns Zugriff beruht auf der Detektion von Fluoreszenzsonden kodiert durch genetische Zellmarker und / oder Vitalfarbstoffen. Letztere (zB fluoreszierende Dextrane) werden verwendet , um die lumin zur Karteal Raum von zerebrovaskulären Strukturen. Germane dem Protokoll hierin beschrieben ist die Verwendung eines in vivo - Marker von Amyloidablagerungen, Methoxy-O4, Alzheimer-Krankheit (AD) Fortschreiten zu beurteilen. Wir beschreiben auch die nach dem Erwerb der Bildverarbeitung verwendet, um Gefäßveränderungen und amyloiden Ablagerungen verfolgen. Während gegenwärtig auf einem Modell der AD Fokussierung ist das beschriebene Protokoll zu anderen ZNS-Erkrankungen relevant, wo pathologische zerebrovaskulären Änderungen auftreten.

Einleitung

Das Gehirn ist ein Gefßsystem mehrzelligen Struktur, die anatomisch und funktionell mit Neuronen gekoppelt. Eine dynamische Umgestaltung von Gefäßen tritt in der gesamten Entwicklung des Gehirns und während des Fortschreitens von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (CNS) ^1,2. Es ist weithin anerkannt , dass zerebrovaskuläre Schaden ist ein Markenzeichen von mehreren Erkrankungen des ZNS, einschließlich Epilepsie, Alzheimer-Krankheit (AD), Schädel - Hirn - Verletzungen und Enzephalitis ^3,4. Daher wird Tracking zerebrovaskulären Änderungen in vivo signifikant , wenn ZNS - Erkrankungen Modellierung von Beginn und in chronischen Phasen. Als zerebrovaskulären Änderungen ergeben sich häufig gleichzeitig mit neuronaler Schädigung oder Plastizität auftreten, Bildgebung des Neuro-Gefäß stellt einen zentralen Einstiegspunkt CNS Krankheit Pathophysiologie zu entziffern.

Dieses Protokoll beschreibt einen Längs Zwei-Photonen-basierten Verfahren, um den Umbau des cerebrovasculature in einem Mausmodell zu verfolgen vonAD, eine progressive Pathologie gekennzeichnet durch zerebrovaskuläre Defekte auf großen und kleinen Kalibers Gefäße aufgrund amyloidogene Plaqueablagerung ^5-7. Dieses Verfahren ermöglicht die Darstellung von Amyloidablagerungen und Verfolgung ihrer Position und das Wachstum in Bezug auf neurovaskuläre Remodellierung im Verlauf der Erkrankung. Vital Fluoreszenzfarbstoffe werden vor jeder Bildgebungssitzung für die Visualisierung der cerebrovasculature und Amyloidplaques in AD transgenen Mäuse injiziert ^8. Wiederholte Imaging - Sitzungen eines ROI durch einen ausgedünnten Schädel transkranielle Fenster ist nicht-invasiv und die Methode der Wahl neurovaskuläre Remodeling im lebenden Gehirn der Maus ^2,5,9,10 zu beurteilen.

Das folgende Verfahren beschreibt die chirurgische Protokoll, Bildaufnahme und -verarbeitung. Die frühe Progression von zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA) meist bei großen leptomeningealen und eindringende Arteriolen charakterisiert.

Protokoll

Mäuse sind erlaubt ad libitum Zugang zu Nahrung, Wasser und gewartet werden auf einer 12-Stunden - Licht-Dunkel - Zyklus. Alle Verfahren beteiligt Labortieren entsprachen nationalen und europäischen Gesetze und wurden von der Französisch Ministerium für Bildung und wissenschaftliche Forschung (CEEA-LR-00651-01) zugelassen. Insgesamt 6 transgenen 5xFAD und 4 littermate Wildtyp- (WT) Kontrollmäuse wurden für dieses Verfahren verwendet.

1. Die präoperative Vorbereitung

1. Intraperitoneal (IP) Methoxy-X04 (10 mg / kg) 48 Stunden vor der Operation injizieren ¹¹ Aß Ablagerungen zu etikettieren.
2. Bereiten sterile künstliche Cerebrospinal - Flüssigkeit (aCSF) (120 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO _3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH ₂ PO _4, 1,3 mM MgCl _2, 10 mM Glucose; Blase mit 95% O _2/5% CO ₂ vor Zugabe von 2,5 mM CaCl _2).
3. Sterilisieren chirurgische Instrumente (Scheren, Pinzetten, Rasierklingen und Bohrer), einen Autoklaven oder eine heiße Perle Sterilisator mit vor aseptischenChirurgie.
4. Reinigen Sie die OP-Tisch und Mikroskop Platte mit 70% Ethanol und Abdeckung mit einem sauberen, saugfähigen Tuch.
5. Injizieren Ketamin / Xylazin (75 mg / kg und 10 mg / kg, jeweils) und die analgetische Ketoprofen (2,5 mg / kg) IP.
6. Überprüfen Sie die entsprechende Ebene der Anästhesie mit Pfote oder Schwanz kneift.
7. Bewerben sterile Augensalbe auf die Augen und rasieren das Fell (Nase zu Ohren), während die Barthaare zu vermeiden. A Enthaarungscreme kann so lange verwendet werden, wie es durch sorgfältiges Spülen mit Wasser folgt Hautreizungen zu verhindern. Rasieren Sie die verbleibende Fell mit einer Rasierklinge. Sterilisieren Sie die Haut mit PVP-Jod antiseptische Lösung.
8. Platzieren Sie die Maus unter dem Binokular und machen einen Hautschnitt von den Ohren zur Nase. Ziehen Sie die Haut seitlich auf den Schädel aus. Inzision des Periosts und wiederholt den Schädel mit sterilem aCSF spülen möglich Blutung zu stoppen.

2. Gefäßsystem Labeling und verdünnt SchädelFenstervorbereitung (40 min)

1. Entfernen Sie die Augensalbe mit einem Wattestäbchen. Einen Tropfen topisches Augen Betäubungsmittel (Tetracain 1%) und den Druck sanft die Haut um die Augenhöhle Vorsprung zu erzielen.
2. Injizieren Fluorescein - Isothiocyanat (FITC) konjugiert mit Dextran (70 kD) (100 mg / kg oder 50 & mgr; l einer 50 mg / ml Lösung; hypodermischen Nadel Insulin) in dem retroorbitalen Sinus nach dem Verfahren , beschrieben von Yardeni und Kollegen ^12. Bewerben sterile Augensalbe auf die Augen.
3. Stellen Sie sicher, dass die Haut eingezogen ist und der Schädel ist sauber und trocken um den ausgewählten Imaging-Bereich. Eine kleine Menge von Cyanacryl- Klebstoff um das Fenster des Galgens Vorrichtung (bestehend aus gestapelten Rasierklingen, siehe Abbildung 1), und Kleber um den Zielbereich mit sanftem Druck für einige Sekunden ^10.
4. Ziehen Sie die Enden der Haut an den Rand des Fensters der Kopfvorrichtung montieren, so dass Sie sicher, dass der Bereichtrocken. Sichern Sie die Haut und den Rand des Fensters mit einer kleinen Menge von Tier Klasse Cyanacryl- Leim und warten , bis sie trocken (Abbildung 1).
5. Sichern Sie das Tier auf der Bühne mit dem Kopf-Mount-Gerät. Spülen mit sterilem aCSF und sicherzustellen, dass die gut zwischen der Haut und Kopfmontage Gerät perfekt abgedichtet ist. Wickeln Sie die Maus in einer Rettungsdecke zu Normothermie aufrechtzuerhalten.
6. Führen Ausdünnung des Schädels in aCSF - Lösung , wie zuvor beschrieben ^10. Man beachte, daß die Kopfhaut nicht vollständig entfernt wird. Regelmäßig den aCSF ändern Knochentrümmer zu löschen und Gewebe eine Überhitzung zu vermeiden. Ein verbleibender Knochentrümmer mit kurzen Luft Puffs entfernt werden. Die aCSF Lösung dämpft auch Schwingungen, die durch Bohren geschaffen.
   HINWEIS: Die Mausschädeldicke variiert zwischen 80 bis 150 & mgr; m von dem Alter des Tieres und dem interessierenden Bereich abhängt.
7. Mit starten Sie eine Zahnbohrer (bei mittlerer Geschwindigkeit und einem 0,7 mm-Fräse) in einem Bereich 1 der Schädeloberfläche Verdünnung.0 mm Durchmesser eine regelmäßige vertikale Bewegung parallel zum Schädel und entfernen Sie den größten Teil des spongiösen Knochens (erste 40-70 & mgr; m). erinnern aCSF alle 20-30 sec und begrenzen Kontinuierliches Bohren auf 3-4 sec zu ersetzen. dass der Knochen in der Nähe von Nähten Hinweis ist gefäß. Bewerben aCSF vorgetränkt Gelfoam eventuelle Blutung zu stoppen.
8. Mit einem scharfen Einweg ophthalmisches mikro Klinge mit der Ausdünnung des Schädels, um fortzufahren, aufpassen, nicht übermäßigen Druck auszuüben. Der Endbereich ist von etwa 0,5 mm im Durchmesser und mit einer Dicke von 20-35 & mgr; m.
   HINWEIS: Aufgrund Knochen nachwachsen und Vernarbung, ist es notwendig, weitere dünne das Fenster an jeder Bildgebungssitzung.

3. Zwei-Photonen-Mikroskopie (45 min)

1. Falls notwendig, injizieren mit 19 mg / kg Ketamin ausreichende Anästhesie aufrechtzuerhalten.
2. Übertragen Sie die Maus (fest auf die Bühne Headmount) unter der Zwei-Photonen-Laser-Mikroskop. Unter Verwendung eines 20X tauche objective mit einer numerischen Apertur von 1,0, suchen Sie den ausgedünnten Schädel-Fenster in der Mitte des optischen Feldes der Epi-Leuchtstofflampe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass das Ziel immer in aCSF eingetaucht ist.
3. Starten Laser-Scanning mit einem modengekoppelten gepulsten Laser (Ti-Saphir-680-1040nm). Eingestellt Anregungswellenlänge bei 750 nm die emittierte Fluoreszenz des methoxy-xO4 und FITC-Dextran in den blauen und grünen Kanäle jeweils zu erfassen.
   HINWEIS: Das Mikroskop weist zwei Strahlteiler bei 506 nm und 555 nm. Blaues Licht wird von einem Detektor mit einem NDD 470 ± 12 nm-Filter ausgestattet erfasst. Grünes Licht ist mit einem 525 ± 25 nm-Filter durch eine hohe Empfindlichkeit GaAsP Detektor erfasst. Die maximale Laserleistung vom Objektiv emittierte sollte nicht mehr als 10 mW Laser-induzierte Gewebeschädigung zu vermeiden.
4. Erwerben Sie ein geringer Vergrößerung Stapel (500 & mgr; m × 500 & mgr; m, 512 x 512 Pixel; 2 & mgr; m Schritt) bei einer 0,7X numerischen Zoom einer 3D-Karte für die präzise Relokalisierung des ROI zu erstellenzu späteren Zeitpunkten.
5. Erwerben Sie ein Mosaik aus vier hohe digitale Vergrößerung von Bildern mit einem 2X numerischen Zoom (200 & mgr; m × 200 & mgr; m, 512 x 512 Pixel; 1 & mgr; m-Schritt). Unter Verwendung der Imaging-Software das Fenster in 200 & mgr; m Schritten bewegen alle Regionen zu erfassen. Tiefe der Stapel ist typischerweise 250 um, ausgehend von der Pia-Oberfläche in jedem Bild des Mosaiks.
6. Bevor Sie die Maus aus dem Mikroskop zu entfernen, nehmen Sie ein Bild oder machen eine handgezeichnete 2D-Karte des pialen Gefäße für zukünftige Relokalisation des Abbildungsfeldes.

4. Wiederherstellung und Re-Imaging

1. Entfernen Sie die Kopfhalterung Gerät durch Traktion anwenden, während der Schädel unter halten. Wenn irgendein Klebstoff auf den Schädel oder der Haut haften bleibt, kratzen sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette ab. Nähen Sie die Kopfhaut und legen Sie die Maus in einem beheizten Käfig aus der Narkose zu überwachen, bevor es an den Käfig zurück. Bewerben topische antibiotische Creme auf die Naht und injizieren Ketoprofen (2,5 mg / kg) IP die folgenden 2 Tagen.
2. Wiederholen Sie die Schritte 1,1 bis 2,5 für die wiederholte Imaging-Sitzungen. Falls erforderlich, rasieren die Knochen mit einer mikro Klinge optimale Qualität des Bildes zu gewährleisten.
   HINWEIS: Zusätzliche Verdünnung mit dem Zahnbohrer kann notwendig sein, wenn das Intervall zwischen Imaging-Sitzungen länger als einen Monat ist.
3. Bewegen Sie die Maus unter dem Mikroskop epifluoreszenten Licht verwendet, gemäß der 2D-Karte des pialen Gefäß entnommen aus der vorherigen Sitzung (Schritt 3.6).
4. Starten Zwei-Photonen-Laser-Scanning und stellen Mikroskoptisch Ausrichtung im Mikrometer-Bereich zu erreichen, um die 3D-Karte in Schritt unter Verwendung von 3,4. Fahren Sie detaillierte Bildgebung, wie in Schritt 3.5 beschrieben.

5. Nach der Akquisition dreidimensionale Rekonstruktion und Bildanalyse

1. Erhalten Sie dreidimensionale Rekonstruktionen des Gefäßsystems und die Amyloid-Ablagerungen, die Bildanalyse-Software 3D mit wie Imaris (Version verwendet 8.0 und 7.7.2).
2. Verwenden Sie das Normalisieren Layer - Plugin auf der Bildverarbeitung Menü und Kontraständerung Untermenü idealen Kontrast der beiden Kanäle in der gesamten Tiefe des Bildstapels erhalten.
3. Öffnen Sie die Bilder aus der gleichen Region zu allen Zeitpunkten gleichzeitig und immer verarbeiten sie parallel , um die verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen.
4. Trace Gefäße mit dem Glühfaden Tracer-Modul.
   1. Klicken Sie auf das Filament Symbol, um einen neuen Faden zu schaffen, lassen Sie die automatische Tracer und wählen Sie die Auto-Pfad-Methode.
   2. Seien Sie sicher, dass der gewählte Kanal auf das Gefäßbild entspricht und mit der Auswahlfunktion des Zeigers, klicken Sie an einer Gefäßverzweigung, die über die Imaging-Sitzungen erhalten wird, während das Halten der Shift + Steuertasten, um einen Ausgangspunkt zu bestimmen. Verwenden Sie die Auswahlfunktion des Zeigers und klicken Sie auf, während die Shift-Taste gedrückt halten, die die Endpunkte der Filamente zu wählen.
      HINWEIS: Vergleich der obtained Skelette werden strukturelle Veränderungen des Gefäßsystems zeigen.
5. Führen Sie Ebene für Ebene Analyse neue Plaques zu verfolgen. Anwenden Oberfläche Modul auf den blauen Kanal für das Wachstum von Aß-Plaques zu verfolgen. Klicken Sie auf das Symbol Oberfläche eine neue Oberfläche zu erstellen und mit der automatisierten Oberflächenerstellung fortzufahren. Verwenden Sie das Schwellwertverfahren zu setzen und das Hintergrundsignal zu subtrahieren. Das Statistik-Menü bietet auf der Oberfläche einzelner Amyloid-Ablagerungen Daten relativ.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung des cerebrovasculature und Amyloidablagerungen Überstunden. Fluoreszierende Farbstoffe wurden injiziert amyloiden Ablagerungen zu beschriften (methoxy-xO4) ¹¹ und die zerebrovaskuläre Lumen (FITC-Dextran) ¹ zu füllen. 3D-Bild-Analyse-Software-Module wurden verwendet, um 3D-Bilder eines konstanten Sichtfeld zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten erfasst erstellen. Repräsentative Bilder im somatosensorische...

Diskussion

Die Open-Schädel Technik zur in - vivo - Zwei-Photonen - Mikroskopie bietet den Vorteil der unbegrenzten Imaging - Sitzungen von großen Abbildungsfelder ^13,14. Aber auch diese Technik eine Entzündung in der Region von Interesse ^14, oft inkompatibel oder aufprallneurovaskuläre Auslesungen ¹⁵ erzeugt. Im Gegensatz dazu wird der ausgedünnte Schädel transkranielle Technik nicht dazu führen , neuro-Entzündung, die eine zuverlässige Abbildung der zerebrovaskulären S...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue