Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du Cerebrovasculature: Pertinence pour les maladies du système nerveux central

Résumé

Ce manuscrit décrit une procédure pour suivre le remodelage de la cerebrovasculature pendant amyloïde accumulation de plaque in vivo en utilisant longitudinale microscopie à deux photons. Préparation-crâne aminci permet la visualisation des colorants fluorescents pour évaluer la progression des lésions vasculaires cérébrales dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer.

Résumé

Le remodelage de la vascularisation du cerveau est un trait commun des pathologies cérébrales. In vivo des techniques d'imagerie sont fondamentales pour détecter la plasticité ou les dommages cérébrovasculaires survenant heures supplémentaires et par rapport à l' activité neuronale ou le débit sanguin. In vivo , la microscopie biphotonique permet l'étude de la plasticité structurale et fonctionnelle des grandes unités cellulaires dans le cerveau vivant. En particulier, la préparation de la fenêtre-crâne amincie permet la visualisation des régions corticales d'intérêt (ROI) sans induire une inflammation cérébrale significative. séances d'imagerie répétitives de retour sur investissement corticales sont réalisables, en fournissant la caractérisation des caractéristiques de la maladie au cours du temps pendant la progression de nombreuses maladies du système nerveux central. Cette technique d'accéder aux structures de la pie-mère à moins de 250 um du cerveau repose sur la détection des sondes fluorescentes codées par les marqueurs cellulaires génétiques et / ou des colorants vitaux. Ces derniers (par exemple, les dextranes fluorescents) sont utilisées pour cartographier la luminal compartiment de structures vasculaires cérébraux. Germane le protocole décrit ici est l'utilisation d'un marqueur in vivo de dépôts amyloïdes, méthoxv-O4, afin d' évaluer la maladie d'Alzheimer (AD) , la progression. Nous décrivons également le traitement d'image post-acquisition utilisée pour suivre les changements vasculaires et les dépôts amyloïdes. Tout en se concentrant actuellement sur un modèle de AD, le protocole décrit est pertinent à d'autres troubles du système nerveux central où les changements cérébrovasculaires pathologiques se produisent.

Introduction

Le système vasculaire cérébral est une structure multi-cellulaire, qui est couplé fonctionnellement à anatomiquement et les neurones. Un remodelage des vaisseaux dynamique se produit au cours du développement du cerveau et pendant la progression de pathologies du système nerveux central (SNC) ^1,2. Il est largement admis que les dommages cérébrovasculaires est une caractéristique de plusieurs maladies du SNC, y compris l' épilepsie, la maladie d'Alzheimer (AD), une lésion cérébrale traumatique et l' encéphalite ^3,4. Par conséquent, le suivi des changements cérébrovasculaires in vivo devient significatif lors de la modélisation des maladies du SNC, à partir du début et en phases chroniques. Comme modifications cérébrovasculaires se produisent souvent en association avec des lésions neuronales ou la plasticité, l'imagerie de la neuro-vasculaire représente un point d'entrée clé pour déchiffrer les maladies du système nerveux central physiopathologie.

Ce protocole décrit un procédé basé longitudinale à deux photons pour suivre le remodelage de la cerebrovasculature dans un modèle murin deAD, une pathologie progressive marquée par des défauts vasculaires cérébraux sur les grands et les petits vaisseaux de calibre en raison du dépôt de plaque amyloïdogène ^5-7. Cette procédure permet la visualisation des dépôts amyloïdes et le suivi de leur position et de la croissance par rapport au remodelage neurovasculaire tout au long de la maladie. Colorants fluorescents vitaux sont injectés avant chaque session d'imagerie pour la visualisation des cerebrovasculature et plaques amyloïdes chez les souris transgéniques AD ^8. Séances d'imagerie répétées d'un retour sur investissement à travers une fenêtre crâne transcrânienne amincie est non-invasive et la méthode de choix pour évaluer le remodelage neurovasculaire dans le cerveau de souris vivante ^2,5,9,10.

La procédure ci-dessous décrit le protocole chirurgical, l'acquisition et le traitement d'image. La progression rapide de l'angiopathie amyloïde cérébrale (CAA), principalement au grand leptoméningée et artérioles pénétrantes est caractérisée.

Protocole

Les souris sont autorisés à accéder ad libitum à la nourriture, l' eau et à un cycle de lumière-obscurité de 12 h. Toutes les procédures impliquant des animaux de laboratoire conformes aux lois nationales et européennes et ont été approuvés par le ministère français de l'Education et de la Recherche Scientifique (ACEE-LR-00651-01). Un total de 6 transgénique 5xFAD et 4 littermate de type sauvage (WT) les souris témoins ont été utilisés pour cette procédure.

Préparation 1. pré-opératoire

1. Intrapéritonéale (IP) injecter Méthoxy-X04 (10 mg / kg) 48 heures avant la chirurgie pour étiqueter des dépôts Aß ^11.
2. Préparer un fluide stérile artificielle céphalorachidien (aCSF) (120 mM de NaCl, 26,2 mM de _NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH ₂ PO _4, 1,3 mM de _MgCl2, 10 mM de glucose; bulle avec 95% O _2/5% CO ₂ avant en ajoutant 2,5 mM de _CaCl2).
3. Stériliser outils chirurgicaux (ciseaux, pinces, lames de rasoir et foret), en utilisant un autoclave ou un stérilisateur à billes chaud avant aseptiquechirurgie.
4. Nettoyez le banc et microscope plaque chirurgicale avec 70% d'éthanol et le couvercle avec un chiffon absorbant propre.
5. Injecter de la kétamine / xylazine (75 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement) et le kétoprofène analgésique (2,5 mg / kg) IP.
6. Vérifiez le niveau approprié de l'anesthésie avec patte ou la queue pincements.
7. Appliquer une pommade ophtalmique stérile pour les yeux et de se raser la fourrure (nez aux oreilles) tout en évitant les moustaches. Une crème épilatoire peut être utilisée aussi longtemps qu'elle est suivie par un rinçage à l'eau avec précaution pour éviter l'irritation de la peau. Rasez la fourrure restant avec une lame de rasoir. Stériliser la peau avec une solution antiseptique povidone-iode.
8. Placez la souris sous le microscope binoculaire et faire une incision de la peau de l'oreille au nez. Tirez la peau sur le côté pour exposer le crâne. Inciser le périoste et rincer à plusieurs reprises le crâne avec LCRa stérile pour arrêter le saignement possible.

2. Vascularisation Étiquetage et Diluée SkullPréparation de la fenêtre (40 min)

1. Retirez la pommade oculaire avec une pointe de coton. Appliquer une goutte d'anesthésique topique ophtalmique (tétracaïne 1%) et de faire pression doucement la peau autour de l'orbite de l'œil pour atteindre saillie.
2. Injecter isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué avec du Dextran (70 kDa) (100 mg / kg ou 50 ul d'une solution à 50 mg / ml; aiguille d'insuline hypodermique) dans le sinus rétro-orbital selon la procédure décrite par Yardeni et ses collaborateurs ^12. Appliquer une pommade ophtalmique stérile pour les yeux.
3. Assurez-vous que la peau est rétractée et le crâne est propre et sec autour de la zone d'imagerie sélectionnée. Appliquez une petite quantité de colle cyanoacrylique autour de la fenêtre de la tête dispositif de montage (constitué de lames de rasoir empilées, voir la figure 1), et de la colle autour de la région cible appliquant une légère pression pendant plusieurs secondes ^10.
4. Tirez sur les extrémités de la peau au bord de la fenêtre de la tête dispositif de montage, faisant que la zone estsec. Fixer la peau et le bord de la fenêtre avec une petite quantité de vétérinaire cyanoacrylique de qualité de la colle et attendre jusqu'à ce que sec (Figure 1).
5. Fixer l'animal au stade en utilisant le dispositif de tête de montage. Rincez avec LCRa stérile et veiller à ce que le puits entre la peau et le dispositif de tête de montage est parfaitement étanche. Enveloppez la souris dans une couverture de survie pour maintenir la normothermie.
6. Effectuer un amincissement du crâne dans une solution de LCRa comme décrit précédemment ^10. A noter que le cuir chevelu ne soit pas complètement éliminé. Changer régulièrement les LCRa pour dégager les débris d'os et d'éviter la surchauffe des tissus. Tous les débris d'os restant peut être enlevé avec de brèves bouffées d'air. La solution ACSF atténue également les vibrations créées par forage.
   REMARQUE: L'épaisseur du crâne de souris varie entre 80 et 150 pm en fonction de l'âge de l'animal et de la région d'intérêt.
7. L'utilisation d'une fraise dentaire (à vitesse moyenne et 0,7 mm ronce) commencent l'amincissement de la surface du crâne dans une zone 1.0 mm de diamètre à l'aide d'un régulier mouvement vertical parallèle au crâne et éliminer la majeure partie de l'os spongieux (premier 40 - 70 um). souvenez-vous de remplacer LCRa toutes les 20-30 secondes et limiter le forage sans interruption à 3-4 sec. A noter que l'os à proximité de points de suture est très vascularisée. Appliquer LCRa prétrempé Gelfoam pour arrêter le saignement éventuel.
8. Utilisez une lame jetable de microchirurgie ophtalmique forte pour continuer avec l'amincissement du crâne, en faisant attention de ne pas appliquer une pression excessive. La région finale est d'environ 0,5 mm de diamètre et d'une épaisseur de 20-35 um.
   NOTE: En raison de la repousse osseuse et la cicatrisation, il est nécessaire de plus mince la fenêtre à chaque session d'imagerie.

3. Deux photons Microscopy (45 min)

1. Si nécessaire, injecter 19 mg / kg de kétamine pour maintenir l'anesthésie adéquate.
2. Transférer la souris (déterminée à l'étape de headmount) au microscope laser à deux photons. En utilisant une immersion dans l'eau 20x objcace avec une ouverture numérique de 1,0, de localiser la fenêtre crânienne amincie au centre du champ optique à l'aide de la lampe à epi-fluorescence. Assurez-vous que l'objectif est toujours immergé dans LCRa.
3. Lancer le balayage laser avec un laser à impulsions en mode verrouillé (Ti-Saphir 680-1040nm). Set d'onde d'excitation à 750 nm pour détecter la fluorescence émise du méthoxy-XO4 et FITC-dextran dans les canaux bleu et vert respectivement.
   NOTE: Le microscope a deux séparateurs de faisceau à 506 nm et 555 nm. La lumière bleue est capturée par un détecteur NDD équipé d'un filtre à 470 nm ± 12. Feu vert est capturé par un détecteur de GaAsP haute sensibilité équipé d'un filtre à 525 nm ± 25. La puissance laser maximale émise par l'objectif ne doit pas dépasser 10 mW pour éviter des dommages aux tissus induite par laser.
4. Acquérir une pile de faible grossissement (500 um x 500 um, 512 x 512 pixels, 2 pm étape) à un zoom numérique 0.7X pour créer une carte en 3D pour la relocalisation précise du ROIaux points temporels ultérieurs.
5. Acquérir une mosaïque de 4 images d'agrandissement numérique de haut avec un zoom numérique 2X (200 um x 200 um, 512 x 512 pixels, 1 pm étape). Utilisation du logiciel d'imagerie déplacer la fenêtre à 200 um étapes pour capturer toutes les régions. Profondeur de piles est typiquement de 250 um, en partant de la surface piale dans chaque image de la mosaïque.
6. Avant de retirer la souris du microscope, prendre une photo ou faire une carte dessinée à la main 2D de la vascularisation pial pour la relocalisation future du domaine de l'imagerie.

4. Récupération et Re-imagerie

1. Retirez le dispositif de tête de montage en appliquant une traction tout en maintenant le crâne en dessous. Si la colle reste attachée au crâne ou de la peau, gratter soigneusement avec une pince fine. Suturer le cuir chevelu et placer la souris dans une cage chauffée à surveiller le rétablissement de l'anesthésie avant de le retourner à la cage. Appliquer une crème antibiotique topique sur la suture et injecter kétoprofène (2,5 mg / kg) IP les suivantes 2 jours.
2. Répétez les étapes 1,1 à 2,5 pour les sessions répétées d'imagerie. Si nécessaire, raser l'os avec une lame de microchirurgie pour assurer une qualité optimale de l'image.
   NOTE: amincissement supplémentaire avec la fraise dentaire peut être nécessaire lorsque l'intervalle entre les sessions d'imagerie est plus d'un mois.
3. Placez la souris sous le microscope en utilisant la lumière épifluorescence selon la carte 2D de la vascularisation pial prise de la session précédente (étape 3.6).
4. Commencez à balayage laser à deux photons et d'ajuster la platine du microscope pour obtenir un alignement à l'échelle du micromètre en utilisant la carte 3D obtenue à l'étape 3.4. Passez à l'imagerie détaillée comme décrit à l'étape 3.5.

5. Post-acquisition tridimensionnelle Reconstruction et analyse d'images

1. Obtenir des reconstructions en trois dimensions du système vasculaire et des dépôts amyloïdes en utilisant l'image en 3D des logiciels d'analyse tels que Imaris (version 8.0 et utilisée 7.7.2).
2. Utilisez le plugin Layer Normalize dans le menu de traitement d'image et le contraste des changements sous - menu pour obtenir le contraste idéal des deux canaux dans toute la profondeur de la pile d'images.
3. Ouvrez les images de la même région , à tous points de temps en même temps et toujours les traiter en parallèle afin de comparer les différents points de temps.
4. les navires de trace à l'aide du module filament traceur.
   1. Cliquez sur l'icône du filament pour créer un nouveau filament, sauter le traceur automatique et choisir la méthode d'auto-chemin.
   2. Assurez-vous que le canal sélectionné correspond à l'image vasculaire et en utilisant la fonction de sélection du pointeur, cliquez à une bifurcation de vaisseau qui est conservé à travers les séances d'imagerie tout en maintenant les touches Maj + commande pour déterminer un point de départ. Utilisez la fonction de sélection du pointeur et cliquez tout en maintenant la touche Maj enfoncée pour sélectionner les points des filaments finaux.
      NOTE: Comparaison de l'obtesquelettes nis montreront des changements structurels de la vascularisation.
5. Effectuer avion par analyse de plan pour suivre de nouvelles plaques. Appliquer le module de surface pour le canal bleu pour le suivi de la croissance des plaques Aß. Cliquez sur l'icône de surface pour créer une nouvelle surface et procéder à la création de surface automatisé. Utilisez la méthode de seuillage à définir et à soustraire le signal de fond. Le menu des statistiques fournit des données par rapport à la surface des dépôts amyloïdes individuels.

Résultats

Ce protocole décrit un procédé permettant la visualisation du cerebrovasculature et des dépôts amyloïdes heures supplémentaires. Les colorants fluorescents ont été injectés pour étiqueter des dépôts amyloïdes (méthoxy-XO4) ¹¹ et de remplir la lumière cérébrovasculaires (FITC-Dextran) ^1. modules 3D de logiciels d'analyse d'images ont été utilisés pour créer des images 3D d'un champ constant de vue capturé à des points de temps cons...

Discussion

La technique ouverte du crâne pour in vivo microscopie à deux photons offre l'avantage de séances d'imagerie illimitées de grands champs d'imagerie ^13,14. Cependant, cette technique produit également l' inflammation dans la région d'intérêt ^14, neuro-vasculaire souvent incompatibles ou ayant un impact lecture outs ^15. Au contraire, la technique du crâne transcrânienne amincie ne conduit pas à la neuro-inflammation, ce qui permet l' imagerie fia...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue